1、感受態(tài)細(xì)胞的制備（DH5 a）、準(zhǔn)備工作所有試劑、容器均需提前預(yù)冷。1、實(shí)驗(yàn)器械4C離心機(jī)（50ml離心管），37C恒溫箱, 至少）； 滅菌的 錐形瓶盒。0.22卩m的濾器2個(gè)（過(guò)濾滅菌 1.5mlEP管1盒，與離心機(jī)配套的 2個(gè)，高壓滅菌的100ml玻璃瓶37 C搖床，超凈臺(tái)（使用前需要紫外消毒 15minTfB2種溶液），10ml注射器2個(gè)；冰盒；高壓 50ml離心管6個(gè)（高壓滅菌），高壓滅菌的500ml 2個(gè)，高壓滅菌的1ml槍頭和200卩l(xiāng)槍頭各一2、試劑配制（甘油特別難吸，用藍(lán)槍頭慢慢吸吧） LB平板：?jiǎn)渭僉B平板，加有amp或有kana的（制板時(shí)需標(biāo)注好類型，時(shí)間） 。 SOB培養(yǎng)

2、基（Super Optimal Broth ） TfB I： （100ml 制備量）分別稱取乙酸鉀0.294g , MnCb 0.99g , KCl 0.146g , CaCb0.111g，置于200ml燒杯中，加入15ml甘油和85mlDDV，搖晃，使其全部溶解。然后在安全櫥中用孔徑為 0.22卩m的濾器過(guò)濾混合液，置于高壓滅菌的100ml玻璃瓶中，4C保存，使用前必須預(yù)冷。（裝在50ml離心管，封口 4度保存） TfB n（ 20ml制備量，每次現(xiàn)用現(xiàn)配，裝在50ml離心管）：分別稱取 MOP®046g , CaCb0.167g , KCl 0.015g，置于50ml燒杯中，加入

3、3ml甘油和17mlDDW,搖晃，使其全部溶解。 然后在安全櫥中用孔徑為 0.22卩m的濾器過(guò)濾混合液，使用前必須預(yù)冷。終體積TFB1濃度100ml200 ml250 ml1LKAc30 mM0.249g0.588 g0.623 g2.49 gKCl100 mM0.146g0.292 g0.365 g1.46 gCaCl210 mM0.111g0.223 g0.278 g1.11 gMnCl 2 4H 2O150 mM0.99g1.98 g2.475g9.9 gGlycerol15%15ml30 ml37.5 ml150 ml先用部分去離子水溶解，后定容至要求體積。用0.2 M醋酸調(diào)pH值至5

4、.8 （非常關(guān)鍵），用針式過(guò)濾器過(guò)濾除菌，4度保存。TFB2濃度20ml200 mlMOPS10 mM0.042g0.42gCaCl275 mM0.164g1.64 gKCl10 mM0.015g0.15gGlycerol15%3ml30 ml先用部分去離子水溶解，后定容至要求體積。用1 M KOH調(diào)pH值至6.5，用針式過(guò)濾器過(guò)濾除菌，放在冰上當(dāng)天現(xiàn)配現(xiàn)用SOB培養(yǎng)基配制量 1 L配制方法 1.配制250 mM KCI溶液。（50ml離心管分裝）在90 ml的去離子水中溶解I.86 g KCI后，定容至100 ml。2. 配制2 M MgCI 2溶液。（50ml離心管分裝）在90 ml去離子

5、水中溶解 4.06g MgCl2 6H2O后，定容至100 ml， 咼溫咼壓火菌。3.稱取下列試劑，置于l L燒杯中Trypt one20 g Yeast Extract5 gNaCl0.5 g4加入約800 ml的去離子水，充分?jǐn)嚢枞芙狻?.量取10 m1 250 mM KCl溶液，加入到燒杯中。6滴加NaOH小塊，調(diào)節(jié)pH值至7.0。7. 加入去離子水將培養(yǎng)基定容至l L 08. 高溫高壓滅菌后，4C保存。9. 使用前加入5 ml滅菌的2 M MgCl 2溶液。I D拉差甘LB培養(yǎng)基配制量 1 L配制方法 1.稱取下列試劑，置于l L燒杯中。Trypt one10 gYeast Extra

6、ct5 gNaCl10 g2.加入約800 ml的去離子水，充分?jǐn)嚢枞芙?滴加固體NaOH，調(diào)節(jié)pH值至7.0。4.加去離子水將培養(yǎng)基定容至1 L o5高溫高壓滅菌后，4度保存。二、實(shí)驗(yàn)步驟1第一天：下午3點(diǎn)取出-80°的感受態(tài)細(xì)胞 DH5a，冰浴，用槍頭沾一點(diǎn)（就可以帶出很 多細(xì)菌，剩余的不要了），在500ul的LB液體培養(yǎng)基中吹打（輕柔），取50ul至另一個(gè)500ul 的LB中再稀釋，取100ul涂板。37度恒溫箱培養(yǎng)過(guò)夜約 16h （具體時(shí)間觀察單克隆，可以 順利挑菌就行）。2、 第二天早上，觀察是否長(zhǎng)出單個(gè)菌落，菌落大小合適時(shí)，向2個(gè)無(wú)菌的搖菌管分別加入5ml高壓過(guò)的SOB培

7、養(yǎng)液，標(biāo)注為對(duì)照管和DH5 a管。從LB平板上挑取單個(gè)菌落加入DH5 a 管中，220rpm , 37C, 5h, OD550達(dá) 0.3 ,將 5mlSOB倒入 lOOmlSOB 37 度，220rpm, 3.5h 后，OD550達(dá) 0.36 （T43.7%）,取出冰上放置 5min ;3、將100ml菌液轉(zhuǎn)入兩個(gè)離心瓶中（平底），spin 3K,5 C 4倒凈上清，倒置于吸水紙上吸干剩余上清。之后步驟必須冰上進(jìn)行，鹽處理細(xì)胞后，操作輕柔；4、 每管加入20ml Tbfl重懸，輕柔操作，冰上放置5' , spin 3K,5C。倒去上清， 并倒置于吸水紙上；5、 每管加入2ml Tbf ll重懸，輕柔操作，冰上放置15'；& 每管50ul分裝。液氮速凍，-80度儲(chǔ)存，標(biāo)明制作日期，細(xì)菌種類；7、 留出一管做鑒定，分別直接涂布陰性，含AMP含Kana的板子；再分別轉(zhuǎn)化抗 AMF和抗 Kana的質(zhì)粒，分別涂布含 AMP含