1、精選優質文檔-傾情為你奉上發酵工藝原理（發酵工程）講 義王莘2012.8.20第一章 緒論發酵工業應用：生物生物學一、發酵定義：從工業微生物角度的發酵：利用培養微生物來獲得產物的有氧或厭氧的任何過程，現在有擴大到培養生物細胞（含有動物、植物和微生物）獲得產物的所有過程。從發酵工業角度的發酵：借助微生物在有氧和無氧條件下的生命活動來制備微生物體本身，或共同直接代謝產物或次級代謝產物的過程統稱為發酵。傳統發酵：醬油、醋、酒、長毛豆腐。新興發酵：有機酸、酶制劑、抗生素。發酵工業的劃分：食品工業（釀造工業）和非食品工業（發酵工業）發酵工業：利用生物的生命活動生產的酶對無機或有機原料進行酶加工獲得產品的

2、工業。二、發酵工業具備的條件： 要有某種適宜的微生物。 要保證或控制微生物進行代謝的各種條件（培養基組成，溫度，溶氧濃度 ，酸堿度等）。 要有進行微生物發酵的設備。 要有將菌體或代謝產物提取出來精制成產品的方法和設備。三、發酵工業的改革1天然發酵階段特點：1）家庭作坊式生產；2）容易感染細菌 ； 3）厭氧發酵；4）非純種培養； 5）憑經驗傳授技術； 6）產品質量不穩定。2純培養技術的建立階段純培養階段特點：（1）多為好氧產品；（2）、均為表面培養；（3）、產品生產過程簡單；（4）、設備要求不高；（5）、生產規模不大。3通氣攪拌發酵技術的建立階段第二次世界大戰爆發，1929年英國人費萊明發現青霉

3、素，迅速形成工業大規摸生產。1940年英國人費洛里精制分離青霉素醫治戰傷藥物。發酵工業新篇章：發酵現象釀造食品工業非食品工業青霉素抗菌素發酵工業氨基酸,核酸發酵（代謝控制發酵）基因工程菌動物細胞大規模培養植物細胞大規模培養藻類細胞大規模培養轉基因動物。發酵工程產業化發展：發酵工程技術給人類社會生產力的發展帶來了巨大的潛力，涉及到解決人類所面臨的食品與營養、健康與環境、資源與能源等重大問題 。細胞大規模培養技術：細胞大規模培養 微生物、動植物細胞、藻類細胞等4代謝控制發酵技術5開拓發酵原料時期6基因工程階段四、發酵工業的范圍： 現代發酵工業涉及領域按微生物發酵產品的性質分為以下幾個方面。1 微生

4、物菌體發酵2微生物酶發酵：3 微生物代謝產物發酵4微生物的生物轉化發酵：生物轉化與化學反應相比優點：反應條件溫和，對環境無污染。5微生物特殊機制的利用（1）利用微生物消除環境污染環境惡化（2）利用微生物發酵保持生態平衡（3）微生物濕法冶金：（4）利用基因工程菌株開拓發酵工程新領域五、發酵工業的特點1.發酵原料的選擇2.微生物菌種得選育及擴大培養3.發酵設備選擇以及工藝條件控制發酵工藝控制關鍵：發酵全過程的無菌狀態的保持，防雜菌污染，設備沖洗，培養基滅菌，空氣過濾。4. 發酵產物的分離提取5.發酵廢物的回收和利用 第2章 發酵培養基第一節 培養基的類型及功能 培養基：是人們提供微生物生長繁殖和生

5、物合成各種代謝產物所需要的按一定比例配制的多種營養物質的混合物。（人工配制的含有營養物質的供微生物生長的介質。）發酵培養基作用：滿足菌體生長+促進產物形成。一、培養基的營養成分及來源1、能源 2、碳源 3、氮源 4、有機鹽 5、特殊生長因子 二、培養基的類型和用途1、按物質來源分：自然培養基（化學成分不清楚，異養微生物完全培養基）、合成培養基（化學成分和數量已知配制，實驗室用生長慢）、半合成培養基（天然碳、氮、生長因子和化學藥品，多數微生物使用）合成培養基：由已知組成成分的各種營養物質組合的培養基叫合成培養基。復合培養基（天然+半合成）：由一些組成成分不完全明確的天然有機物與一些無機鹽組合的培

6、養基。2、按物理性狀態分：固體培養基、半固體培養基、體培養基固體培養基 :適合于菌種和孢子的培養和保存，也廣泛應用于有子實體的真菌類，如香菇、白木耳等的生產 。半固體培養基:即在配好的液體培養基中加入少量的瓊脂，一般用量為0.5%0.8% ,主要用于微生物的鑒定。液體培養基:80%90%是水，其中配有可溶性的或不溶性的營養成分，是發酵工業大規模使用的培養基。 3、按生產工藝用途分：從發酵生產應用考慮）孢子培養基、種子培養基、發酵培養基，工業中常用種子和發酵培養基用生產。（1）孢子培養基：供制備孢子用的。孢子：某一生長階段中，在營養細胞內形成一個圓形，卵圓形或圓柱形的休眠體叫孢子。（2）種子培養

7、基：供孢子發芽和菌體生長繁殖用的。（3）發酵培養基：是供菌體生長繁殖和合成大量代謝產物用的。三、發酵培養基的選擇： 培養基供菌生長、繁殖、代謝、合成產物的營養物質。培養基成分和配比的適合與否影響菌的生長代謝，對產物的工藝質量和產量影響大。1、選擇和培植發酵培養基對應考慮的基本原則：（1）、必須提供合成微生物細胞和發酵產物的基本成分。（2）、有利于減少培養基原料的單耗，即提高單位營養物質所合成產物數量或最大產率。（3）、有利于提高培養基和產物的濃度，以提高單位容積發酵罐的生產能力。（4）、有利于提高產物的合成速度，縮短發酵周期。（5）、盡量減少副產物的形成，便于產物的分離純化。（6）、原料價格低

8、廉，質量穩定，取材容易。（7）、所用原料盡可能減少對發酵過程中通氣攪拌的影響，利于提高氧的利用率，降低能耗。（8）、有利于產品的分離純化，并盡可能減少產生“三廢”的物質。2、工業化發酵培養基選擇步驟：（1）、了解菌種來源、生活習慣，理化特性和營養要求。（2）、了解生產菌種的培養條件、生物合成代謝途徑、代謝產物化學性質、結構、工藝、產品質量要求。（3）、選化學合成培養基進行搖瓶試驗每小發酵罐培養，氮、碳產物代謝能力情況的摸索，選擇適宜的pH值。（4）、確定培養基配比確定金屬（非）離子的影響無機要素營養要求，按高低、適中進行確定做復合培養基試驗做發酵條件與培養基關系試驗用碳酸鈣調pH值中間補料法控

9、制碳、氮、養料、前體類物質代謝引導發酵向合成產物的途徑發展。四、配制工業發酵培養基的一般要求：1、營養物組成較豐富，濃度適當，能滿足菌絲體菌種發芽和生長繁殖成大量具有生理功能的需要（產物合成潛力提高）2、在一定條件下，各種原材料彼此不產生化學反應，理化性相對穩定。3、粘度適中，滲透壓適當。4、原材料品種及濃度對代謝產物生物合成過程要有利于主產物的生物合成，高產率維持時間長，副產物合成率要降至最低。5、不影響發酵過程的通氣和攪拌，便于產物的分離純化。6、原材料盡量選質優價廉、成本低。 第二節 發酵培養基的成分及來源 培養基原料：C（50%）、N、無機鹽、微量元素、水、生長因子、前體。一、碳源：（

10、微生物自身細胞物質、糖類、脂、蛋白質等和能源構成菌體的主要元素及各代謝產物的主要原料。）定義：凡是用于構成微生物細胞和代謝產物中碳素的營養物質均稱碳源。功能：提供能量的重要元素。碳源：糖（碳水化合物）、脂肪、有機酸、醇、碳氫化合物（烴類）1、碳水化合物（糖類）（1）單糖：葡萄糖（實驗室培養基）所有的微生物都能利用葡萄糖；但是會引起葡萄糖效應；工業上常用淀粉水解糖,但是糖液必須達到一定的質量指標；糖蜜：糖蜜是制糖生產時的結晶母液，它是制糖工業的副產物。 糖蜜主要含有蔗糖，總糖可達50%75%。一般糖蜜分甘蔗糖蜜和甜菜糖蜜葡萄糖蜜。糖蜜使用的注意點：除糖份外，含有較多的雜質，其中有些是有用的，但是

11、許多都會對發酵產生不利的影響，需要進行預處理。（2）雙糖：乳糖、麥芽糖、蔗糖（3）多糖：糊精、淀粉及其水解液，工業化過程常用淀粉水解物酶法水解為發酵糖。 （4）淀粉、糊精：使用條件：微生物必須能分泌水解淀粉、糊精的酶類缺點：難利用、發酵液比較稠、一般>2.0%時加入一定的-淀粉酶成分比較復雜，有直鏈淀粉和支鏈淀粉等等。優點：來源廣泛、價格低，可以解除葡萄糖效應2、脂肪：霉菌和放線菌利用油脂作碳源，其具有消沫和補充碳源的雙重作用。3、無機酸、醇：在單細胞蛋白、氨基酸、維生素、抗生素發酵中作碳源和補充碳源。4、碳氫化合物（烷烴）：微生物表面糖脂吸收系統乳化后利用碳。二、氮源（細菌、酵母菌氮含

12、量大，霉菌含蛋量低，NH2基存在不提供能量）：指構成微生物細胞和代謝產物中的氮素的營養物質。1、主要功能：構成微生物細胞和含氮的代謝產物，補充碳源，是細胞合成蛋白質、酶、氨基酸、核苷酸及抗生素等重要代謝物成分。2、有機氮源（有碳有氮）：含有蛋白質、肽類、游離氨基酸、糖類、脂肪、無機鹽、生長因子。微生物對這類氮源的利用具有選擇性。土霉素生產中玉米漿和氨基酸的利用率增加；選擇有機氮時要注意品種、產地、加工方法對質量的影響。3、有機氮源：氨基酸、蛋白質水解物及尿素。4、無機氮源（無碳有氮）：銨鹽、硝酸鹽及氨氣、氯化銨。5、實驗室用培養基氮源：蛋白胨、牛肉膏、酵母粉等蛋白水解物。6、工業化生產常用氮源

13、：硫酸銨、尿素、氨水、黃豆粉、花生粉、魚粉、棉籽粉、玉米漿、酒精水及屠宰場廢水等。氮源使用的一些相關問題：有機氮源和無機氮源應當混合使用；早期：容易利用易同化的氮源無機氮源；中期：菌體的代謝酶系已形成、則利用蛋白質；有些產物會受氮源的誘導和阻遏例： 蛋白酶的生產有機氮源選取時也要考慮微生物的同化能力；開發效果好、有針對性的有機氮源仍然是令人感興的課題；三、無機鹽和微量元素1、定義：是微生物代謝所需的重要物質。2、功能：構成菌體成分，作為酶的輔基或激活劑，調節微生物體內氧化還原電位、pH值及維持滲透壓。無機元素對菌體生長的影響： 濃度降低促進生長；濃度提高抑制生長3、無機鹽：磷酸、硫酸鹽、氯化物

14、、鈉、鉀、鈣、鎂、鐵。4、微量元素：一般參與酶的組成或使酶活化。微量元素缺乏，導致細胞生理活性下降，甚至停止生長。 P：構成菌體核酸、核蛋白及磷脂成分，組成高能磷酸化合物及許多酶的活性基，參與氧化磷酸化反應必須元素。Fe：是細胞色素及其氧化酶的激活劑。Zn（脫氫酶）、Mg（糖化酶）、Co（B2輔酶 ）：是某些酶的輔酶或激活劑。Na：維持細胞滲透壓。K：影響細胞膜透性。Ca：調節細胞透性作用。使用注意事項：1、對于其它渠道有可能帶入的過多的某種無機離子和微量元素在發酵過程中必須加以考慮例：鐵離子 青霉素發酵中，鐵離子的濃度要小于20g/ml 發酵罐必須進行表面處理使用時注意鹽的形式（pH的變化）

15、例：黑曲酶NRRL-330,生產-淀粉酶，P對酶活的影響 pH 酶活不加 4.25 120分鐘加 K2HPO4 5.45 30分鐘加 KH2PO4 4.62 75分鐘四、生長因子、消沫劑、前體和產物促進劑1、生長因子：微生物生長必需而少量的，自身不能合成或少量合成，以滿足機體生長需要的有機化合物，如維生素。功能：構成輔酶的組成部分，促進生命活動進行。如維生素B族是各種酶的活性基的組成部分，沒有維生素B，E就不能活動。有機氮源是這些生長因子的重要來源，多數有機氮源含有較多的B簇維生素和微量元素及一些微生物生長不可缺少的生長因子。 2、消沫劑：工業化生產中消除發酵中產生的泡沫，防止逃液和染菌，保證

16、生產的正常運轉。常用的消沫劑：植物油、動物油、高分子化合物。3、前體：在產物的生物合成過程中，被菌體直接用于產物合成而自身結構無顯著改變的物質稱為前體。前體可自身合成（纈氨酸、半胱氨酸青霉素合成時用）；外源性前體（苯乙酸青霉素G）青霉素：分子量356 苯乙酸:分子量136 作用：前體有助于提高產量和組份 用法：前體使用時普遍采用流加的方法 前體一般都有毒性，濃度過大對菌體的生長不利苯乙酸，一般基礎料中僅僅添加0.07% 前體相對價格較高，添加過多，容易引起揮發和氧化，流加也有利于提高前體的轉化率4、產物促進劑 所謂產物促進劑是指那些非細胞生長所必須的營養物，又非前體，但加入后卻能提高產量的添加

17、劑。 促進劑提高產量的機制尚不清楚。 有些促進劑本身是酶的誘導物；有些促進劑是表面活性劑，可改善細胞的透性，改善細胞與氧的接觸從而促進酶的分泌與生產；五、水：是培養基的主要組成成分，是構成菌體細胞的主要成分，是營養物質傳導介質。功能：水是良好的溶劑，菌體所需要的營養物質都是溶解于水中被吸收的。滲透、分泌、排泄等作用都是以水為媒介的，并且水直接參與代謝作用中的許多反應。對于發酵工廠來說，恒定的水源是至關重要的，因為在不同水源中存在的各種因素對微生物發酵代謝影響甚大。 水源質量的主要考慮參數包括pH值、溶解氧、可溶性固體、污染程度以及礦物質組成和含量。 對于釀造行業，水的重要性不言而喻。對于常規發

18、酵，可靠、持久，能提供大量成分一致清潔的水。六、 影響培養基質量的因素工業發酵過程中，生產水平波動大，菌體代謝異常等現象。1、原材料質量的影響2、水質的影響3、滅菌的影響4、其他影響因素 第三節 發酵培養基的設計和優化一、培養基成分選擇的原則 菌種的同化能力、代謝的阻遏和誘導1000.22.0、合適的C、N比、pH的要求 二、培養基實驗設計：培養基成分的含量最終都是通過實驗獲得的；合理的實驗方法：多因子實驗；多因子實驗：均勻設計、正交實驗設計、響應面分析等；在篩選培養基中使用的原材料種類和濃度配比時，經常采用的方法：單因子試驗法、正交試驗設計和均勻試驗設計。1、單因子試驗法：適用培養基組成和單

19、一營養成分的選擇（費時，準確性低）2、均勻試驗法：試驗點均勻分散特點，實驗組數與因素的水平數相同，試驗結果分析采用計算機對試驗數據進行多元回歸系統處理，求得一回歸方程定量預測最優的條件和結果，最佳培養基組成和濃度由菌種的生長情況、C/N代謝規律、pH值變化、產物合成速率決定。3、正交試驗設計: 是研究多因素多水平的又一種設計方法，它是根據正交性從全面試驗中挑選出部分有代表性的點進行試驗，這些有代表性的點具備了“均勻分散，齊整可比”的特點，正交試驗設計是分式析因設計的主要方法。是一種高效率、快速、經濟的實驗設計方法。三、培養基設計的步驟 根據前人的經驗和培養基成分確定時一些必須考慮； 的問題，初

20、步確定可能的培養基成分； 通過單因子實驗最終確定出最為適宜的培養基成分； 當培養基成分確定后，剩下的問題就是各成分最適的濃度，由于培養基成分很多，為減少實驗次數常采用一些合理的實驗設計方法。 例1：類胡蘿卜素高產菌Y11的培養基的優化原培養基: 初步確定可能的培養基成分(以碳源為例)通過單因子實驗確定適宜的培養基成分(以碳源為例)考慮到成本：乙酸鈉是較為合適的碳源進一步：乙酸鈉的濃度2%比較好結果：碳源：乙酸鈉 0. 2%；氮源：氯化銨 0.2%； 酵母膏0.03%；無機鹽: 復合無機鹽0.05%例2：正交設計確定優化的配方 例3： 發酵培養基改進后培養基的發酵結果；搖瓶水平到反應器水平的優化

21、配方；搖瓶、反應器培養基研究的兩個層次；搖瓶培養基設計的第一步；反應器最終的優化的基礎配方 第三章 工業發酵的染菌及滅菌第一節 發酵染菌的危害發酵染菌能給生產帶來嚴重危害，防止雜菌污染是任何發酵工廠的一項重要工作內容。尤其是無菌程度要求高的液體深層發酵，污染防止工作的重要性更為突出。 所謂“雜菌”， 是指在發酵培養中侵入了有礙生產的其他微生物。幾乎所有的發酵工業，都有可能遭受雜菌的污染。染菌的結果，輕者影響產量或產品質量，重者可能導致倒罐，甚至停產。一，染菌對不同品種發酵的影響青霉素；疫苗；檸檬酸；谷氨酸；肌苷、肌苷酸；酶制劑二，不同種類的雜菌對發酵的影響青霉素發酵：污染細短產氣桿菌比粗大桿菌

22、的危害大；鏈霉素發酵：污染細短桿菌、假單孢桿菌和產氣桿菌比粗大桿菌的危害大；四環素發酵：污染雙球菌、芽孢桿菌和夾膜桿菌的危害較大；檸檬酸發酵：最怕污染青霉菌；肌苷、肌苷酸發酵：污染芽孢桿菌的危害最大；谷氨酸發酵：最怕污染噬菌體；高溫淀粉酶發酵：污染芽孢桿菌和噬菌體的危害較大；三，不同染菌時間對發酵的影響種子培養期染菌、發酵前期染菌、發酵中期染菌及發酵后期染菌。四，不同染菌途徑對發酵的影響種子帶菌：種子帶菌可使發酵染菌具有延續性；空氣帶菌：空氣帶菌也使發酵染菌具有延續性，導致染菌范圍擴大至所有發酵罐；培養基或設備滅菌不徹底：一般為孤立事件，不具有延續性；設備滲漏：這種途徑造成染菌的危害性較大；五

23、，染菌對產物提取和產品質量的影響對過濾的影響：發酵液的粘度加大；菌體大多自溶；由于發酵不徹底，基質的殘留濃度增加；造成的后果：過濾時間拉長，影響設備的周轉使用，破壞生產平衡；大幅度降低過濾收率；對提取的影響有機溶劑萃取工藝：染菌的發酵液含有更多的水溶性蛋白質，易發生乳化，使水相和溶劑相難以分開。離子交換工藝：雜菌易粘附在離子交換樹脂表面或被離子交換樹脂吸附，大大降低離子交換樹脂的交換量。對產品質量的影響對內在質量的影響：染菌的發酵液含有較多的蛋白質和其它雜質。對產品的純度有較大影響。對產品外觀的影響：一些染菌的發酵液經處理過濾后得到澄清的發酵液，放置后會出現混濁，影響產品的外觀。六，染菌對三廢

24、處理的影響使過濾后的廢菌體無法利用；發酵染菌的廢液，生物需氧量（BOD）增高，增加三廢治理費用和時間第二節 發酵過程中染菌的檢查判斷一、染菌的檢查與判斷 目前生產上常用的雜菌檢查方法有：顯微鏡檢查：染色 ； 鏡檢平板劃線檢查：到平板空培養待測樣品劃線培養觀察。酚紅肉湯培養檢查：無菌肉湯培養基空培養 接入樣品 培養觀察1、顯微鏡檢查（鏡檢）：革蘭氏染色法2、平板劃線培養或斜面培養檢查法3、肉湯培養檢查法判斷發酵是否染菌應以無菌試驗結果為根據無菌試驗的目的：1，監測培養基、發酵罐及附屬設備滅菌是否徹底；2，監測發酵過程中是否有雜菌從外界侵入；3，了解整個生產過程中是否存在染菌的隱患和死角；二，各種

25、檢查方法的比較顯微鏡檢查方法簡便、快速，能及時發現雜菌，但由于鏡檢取樣少，視野的觀察面也小，因此不易檢出早期雜菌。平板劃線法和肉湯培養方法的缺點是需經較長時間培養(一般要過夜)才能判斷結果，且操作較繁瑣，但它要比顯微鏡能檢出更少的雜菌，而且結果也更為準確；三，雜菌檢查中的問題檢查結果應以平板劃線和肉湯培養結果為主要根據；平板劃線和肉湯培養應做三個平行樣；要定期取樣；酚紅肉湯和平板劃線培養樣品應保存至放罐后12小時，確定為無菌時方可棄去；取樣時防止外界雜菌混入的措施；表4-1四，發酵異?，F象判斷是否染菌 除了以上的方法外，在實際生產中還可以根據以下參數的異常變化來判斷是否染菌溶解氧、pH值、尾氣

26、中CO2含量1、發酵異?，F象判斷是否染菌：溶解氧、pH、二氧化碳含量及菌體酶活力。溶氧濃度（谷氨酸發酵時）谷氨酸發酵時止常利J異常的溶解氧曲線正常發酵溶解氧曲線；異常發酵溶解氧曲線；··一異常發酵光密度曲線發酵初期：菌體適應期溶氧濃度不變耗氧量 染好氧雜菌溶解氧接近于0發酵中期：菌體對數生長期溶氧濃度耗氧量 染厭氧雜菌溶解氧耗氧量發酵后期：菌體衰老期溶氧濃度耗氧量 2）二氧化碳的含量雜菌染菌糖耗二氧化碳含量；噬菌體染菌糖耗二氧化碳含量耗氣性發酵排氣中二氧化碳含量與糖代謝有關。第三節 發酵染菌和染菌原因分析一、發酵染菌率發酵染菌率：定義：指一年內發酵染菌的批數與總投料發酵批數

27、之比。 總染菌率（一年內） = 發酵染菌批數 / 總投料批數 ×100%發酵染菌率以發酵罐染菌批（次）為基準，染菌罐批（次）應包括染菌重消后的重復染菌的罐批（次）在內。設備染菌率：統計發酵罐或其他設備的染菌率，有利于查找因設備缺陷而造成的染菌原因不同品種發酵的染菌率：統計不同品種發酵的染菌率，有助于查找不同品種發酵染菌的原因。不同發酵階段的染菌率：將整個發酵周期分成前期、中期和后期三個階段，分別統計其染菌率。有助于查找染菌的原因。季節染菌率：統計不同季節的染菌率，可以采取相應的措施制服染菌。操作染菌率：統計操作工的染菌率，分析染菌原因，考核操作工滅菌操作技術水平。二、發酵染菌和染菌原

28、因分析 避免在發酵生產中污染雜菌應以預防為主?！胺乐赜谥巍保虑胺乐箘儆谑潞笸炀取?如果一旦發生染菌現象就要盡快找出原因及時糾正、堵塞漏洞才能減少損失，并從中吸取經驗教訓，避免以后有類似情況發生，保持生產的正常進行。但在發酵生產中，往往因為生產過程的環節很多，同時各工廠的生產設備、產品種類和管理措施不盡相同，引起染菌的原因比較復雜，有時不能及時找出而耽誤了生產。專心-專注-專業1、國外一抗生素發酵染菌原因的分析 2、國內一制藥廠發酵染菌原因的分析 國外一抗生素發酵染菌原因的分析國內一制藥廠發酵染菌原因的分析染菌原因百分率%染菌原因百分率%染菌原因百分率%染菌原因百分率%種子帶菌9.64蛇管穿孔

29、5.89外界帶入雜菌（取樣、補料帶入）8.20操作違反規程1.60接種時罐壓跌零0.19接種管穿孔0.39設備穿孔7.60種子帶菌0.60培養基滅菌不透0.79閥門泄漏1.45空氣系統帶菌26.00原因不明35.00空氣系統帶菌19.96罐蓋漏1.54停電罐壓跌零1.60攪拌軸密封泄漏2.09其他設備漏10.13接種11.00泡沫冒頂0.48操作問題10.15蒸汽壓力不夠或蒸汽量不足0.60夾套穿孔12.36原因不明24.91管理問題7.09 3，從染菌的規模幅度來分析染菌原因 大批（多個）發酵罐染同一種菌：空氣系統問題 部分發酵罐(或罐組)染菌：前期可能是種子帶雜菌，或滅菌不徹底，中后期則可

30、能是中間補料系統或油管路系統發生問題所造成的個別發酵罐連續染菌：設備問題(如閥門的滲漏或罐體腐蝕磨損)，設備的腐蝕磨損所引起的染菌會出現每批發酵的染菌時間向前推移的現象個別發酵罐偶然染菌：原因比較復雜，因為各種染菌途徑都可能引起。 4，從染菌的時間來分析發酵前期：種子、無菌空氣 、培養基、設備滅菌不徹底、 接種操作不當、設備或管道有死角。發酵后期：中間補料、操作不合理問題、設備滲漏。5，從染菌的類型來分析淺綠色菌落(革蘭氏陰性桿菌) ：發酵罐的冷卻管、夾套滲漏或水污染。 耐熱性芽孢桿菌：死角、培養基、設備滅菌不徹底。 球菌、酵母、不耐熱無芽孢桿菌：可能是從蒸汽的冷凝水或空氣中帶來的、種子帶菌、

31、設備滲漏、操作問題。 霉菌：無菌室及滅菌不徹底或操作不嚴格問題第四節 發酵雜菌污染途徑及防止一、種子帶菌的原因及防止1、種子帶菌原因問題培養基及用具滅菌不徹底，滅菌溫度達不到要求。菌種在移接過程，操作和管理不當。菌種在培養過程或保藏過程中外界空氣和雜菌進入（試管有長度、緊度，應恒溫，嚴檢）無菌室的無菌條件不符合要求。2，種子帶菌的防止種子帶雜菌是發酵前期染菌的原因之一。在每次接種后應留取少量的種子懸浮液進行平板、肉湯培養，借以說明是否是種子中帶雜菌。種子培養的設備和裝置有無菌室、滅菌鍋和搖瓶機等。（1）無菌室無菌室的基本要求：無菌室面積不宜過大，一般約46米2高約26米。 為了減少外界空氣的侵

32、入，無菌室要有13個套間(緩沖過道) 無菌室內部的墻壁、天花板要涂白漆或采用磨光石子，要求無裂縫，墻角最好做成形 。室內布置應盡量簡單，最好能安裝空氣調節裝置，通入無菌空氣并調節室內的溫濕度。 無菌室的每個套間一般都用紫外線滅菌。化學滅菌藥劑： 用作噴灑或揩擦的(以揩擦為主) ： 75%酒精;0.25%新潔而滅(季胺鹽)；0.61%漂白粉；0.5%石炭酸；0.5%過氧乙酸；1%煤酚皂(來蘇爾)；0.5%高錳酸鉀；300單位毫升土霉素；50單位毫升制霉菌素等 。用作熏蒸：甲醛(每立方米空間約用10毫升)或硫磺(每立方米空間約用2-3克)。 （2）培養基要求無原料性狀（顆粒、結塊等）及原料無發霉變

33、質現象出現。（3）種子培養基滅菌滅菌操作時需要注意排氣管是否暢通 ；固體培養基可采用兩次滅菌的方法；通入蒸汽后使瓶內培養基溫度達到121ºC所需的時間與瓶內培養基的體積有關 。二、設備滅菌不徹底：1、實罐滅菌未充分排除罐內空氣，造成“假壓”，使罐頂空間局部溫度達不到要求開排氣閥使蒸汽透過所有管線徹底滅菌。2、培養基連續滅菌時，蒸汽壓力波動大，達不到滅菌溫度自控裝置。3、設備管道存在“死角”，引起蒸汽不能有效到達或不能充分到達預定到達的局部滅菌部位形成不徹底滅菌部位“死角”。4、設備滲漏引起染菌及防止：砂眼（腐蝕）裂縫（振動）選優質材料。5、操作問題：移料+罐壓=0，外界空氣進入+泡沫

34、頂蓋+壓縮空氣壓力突降+發酵液倒流入空氣過濾器高度責任心+管理+高素質。三、發酵設備、管件的滲漏與配置設備和管件的滲漏一般是指設備和管件由于腐蝕、內應力或其他原因形成微小漏孔所發生的滲漏現象。這些漏孔很小，特別是不銹鋼材料形成的漏孔更小，有時肉眼不能直接覺察，需要通過一定的試漏方法才能發現。1，設備滲漏的原因發酵液中腐蝕性物質對設備的腐蝕；設備加工不良；彎管時，彎頭處管壁變??；焊接不良；2，盤管滲漏的防止放罐后要認真清洗發酵罐；控制冷卻水質量，降低其中氯離子含量；對盤管定期檢查、試漏，及時發現漏隙； 3，空氣分布管滲漏的防止空氣帶菌：空氣凈化設備、流程、過濾介質選用和裝填、介質滅菌管理等。4，

35、罐體滲漏的防止5，管件的滲漏 與發酵罐相連接的管路很多，有空氣、蒸汽、水、物料、排氣、排污等管路，管路多，相應的管件和閥門也多。管道的連接方式、按裝方法以及選用的閥門形式對防止污染有很大的關系。所以，與發酵有關的管路不能同一般化工廠的化工管路完全一樣，而有其特殊的要求。四、發酵罐與管件的死角 所謂死角是指滅菌時因某些原因使滅菌溫度達不到或不易達到的局部地區。發酵罐及其管路如有死角存在，則死角內潛伏的雜菌不易殺死，會造成連續染菌，影響生產的正常進行。1，法蘭連接的死角 發酵工廠的有關管路要保持光滑、通暢、密封性好，以避免和減少管道染菌的機會。例如法蘭與管子焊接時受熱不勻使法蘭翹曲密封面發生凹凸不

36、平現象就會造成死角(圖78c)。墊片的內圓比法蘭內徑大或比較小以及安裝時沒有對準中心也會造成死角(圖78a、b)。 2，渣滓在罐底與用環式空氣分布管所形成的死角 3，不銹鋼襯里的死角 4，接種管路的死角 采用種子罐時是利用壓力差將種子罐中培養好的種子輸入發酵罐內，種子罐與發酵罐的一段連接管路的滅菌是與發酵罐的滅菌同時進行的。如下圖所示有一小段管路存在蒸汽不流通的死角，所以應在閥1的半截上裝設旁通，焊上一個小的放氣閥，此段管路即可得到蒸汽的充分滅菌。 5，排氣管的死角 罐頂排氣管彎頭處如有堆積物，其中窩藏的雜菌不容易徹底消滅，而當發酵時受攪拌的震動和排氣的沖擊就會一點點地剝落下來造成污染。另外排

37、氣管的直徑太大，滅菌時蒸汽流速小也會使管中部分耐熱菌不能全部殺死。所以排氣管要與罐的尺寸有一定比例，不宜過大或過小。 6，不合理補料管配置造成的死角 7，壓力表安裝不合理形成的死角五、染菌后的挽救措施 種子培養或種子罐中發現污染 。發酵早期染菌可以適當添加營養物質，重新滅菌后再接種發酵。 中后期染菌，如果雜菌的生長將影響發酵的正常進行或影響產物的提取時，應該提早放罐。 有些發酵染菌后發酵液中的碳、氮源還較多，如果提早放罐，這些物質會影響后處理提取使產品取不出，此時應先設法使碳、氮源消耗，再放罐提取。有時發酵罐偶而染菌，原因一時又找不出，一般可以采取以下措施：(1)連續滅菌系統前的料液貯罐在每年

38、4!10月份(雜菌較旺盛生長的時間)加入0.2%甲醛，加熱至80°C，存放處理4小時，以減少帶入培養液中的雜菌數。(2)對染菌的罐，在培養液滅菌前先加甲醛進行空消處理。甲醛用量：0.120.17L/m3罐體積。(3)對染菌種子罐罐內放水滅菌，滅菌后水量占罐體的2/3以上。細菌芽孢較耐干熱而不耐濕熱的緣故。六、制服染菌對發酵過程的要求1、對空氣凈化系統的要求。2、對蒸汽要求。3、對設備的要求。4、對工藝的要求。第五節 滅菌培養基+設備+空氣滅菌防止發酵過程染菌+保證生產。染菌：營養物質消耗+抑制產生菌生長+改變培養液性質+產生破壞代謝產物的酶類。 一、 滅菌的方法滅菌：指用化學的或物理

39、學的方法殺滅或除掉物料或設備中所有的有生命的有機體的技術或工藝過程。工業常用的滅菌方法：化學物質滅菌；熱滅菌；輻射滅菌；過濾介質除菌。（一）、消毒和滅菌的區別： 消毒：用物理或化學方法殺死物料、容器、器具內外的病原微生物。（殺死引起感染的微生物）或（用物理、化學方法除去表面的致病微生物）滅菌：用物理、化學方法殺死或除去環境中所有微生物。（殺死一切微生物）消毒不一定滅菌（無菌態）；滅菌無菌態（可消毒）（二）、常用的滅菌方法1、干熱滅菌法干熱滅菌法 一般認為繁殖型細胞在100 以上干熱1小時即被殺死。耐熱性細菌芽胞在120以下長是時間加熱也不死亡，介140前后則殺菌效率急劇增長。所以，關于干熱滅菌

40、條件，有的藥典規定為1801小時以上，有的藥典規定為16017024小時，此僅是大至的標準而已.2、濕熱滅菌1）濕熱滅菌定義：借助蒸汽釋放的熱能使微生物細胞中的蛋白質、酶和核酸分子內部的化學鍵，特別是氫鍵受到破壞，引起不可逆的變性，使微生物死亡。2）優點：來源容易，操作無毒。穿透力強，滅菌徹底。具有很大的潛熱，蒸汽冷卻的水有利于滅菌。蒸汽輸送可借助于本身的壓力。經濟快捷。3）濕熱滅菌的原理：在有水分存在的情況下，蛋白質更易受熱而發生不可逆的凝固變性。3、輻射滅菌1）定義：利用高能量的電磁輻射和微粒輻射來殺滅微生物。2）紫外線對芽孢和營養細胞都能起作用的波長范圍：250270nm殺菌率高。3）放

41、射性同位素CO60，密封包裝滅菌（產品成品包裝的滅菌）4、化學物質滅菌1）定義：化學物質用于消毒和防腐。2）作用：藥物易與細胞中的某些成分起化學反應，使蛋白質變性，酶失活，破壞細胞膜透性而殺滅微生物。3）適用范圍：藥殘難除，易于蛋白質產生化學反應，不適合培養基滅菌，只適合于局部空間或某些器械的消毒。4）化學藥品：高錳酸鉀：氧化蛋白質、氨基酸，濃度為0.10.25%;次氯酸鈉（漂白粉）：強烈氧化作用;75%酒精：細胞脫水作用，使乙醇分子進入蛋白質的肽鍵空間，引起蛋白質變性或沉淀。范圍為皮膚和器具表面殺菌。新潔爾滅和杜滅芬：陽離子表面活性劑與微生物菌體表面結合，引起菌外膜損傷和蛋白變性。對芽孢無滅

42、菌作用。范圍：器具和環境。使用濃度：0.25%（5%加水稀釋20倍）。甲醛：還原作用殺菌，與蛋白質氨基結合使其變性。37%甲醛溶液稱為福爾馬林。范圍：無菌室和車間空間消毒。戊二醛：應用廣泛，使用范圍為堿性條件下殺死孢子，濃度為2%。范圍：器具和儀器。過氧乙酸：強氧化劑，對營養細菌、真菌（孢子）、病毒起作用；殺菌濃度0.01%；無害濃度0.2%；-40仍可殺菌，有腐蝕性。酚類：有毒性，水溶性差，污染環境。濃度為0.10.15%，15分鐘滅大腸桿菌。抗生素：抑菌滅菌劑，有選擇性（細菌）。二 培養基濕熱滅菌（一）、影響培養基滅菌的因素1、培養基成分：油脂越高，糖類越高，蛋白質的濃度越高，都會使微生物

43、的耐熱性增高。2、pH值：pH值為6.08.0，微生物耐熱性好；pH值<6.0滅菌時間3、培養基中的顆粒：顆粒越大，滅菌越難，反之，越易。顆粒小于1mm 培養基無影響。4、泡沫：培養基形成泡沫對滅菌極為不利，因為泡沫中的空氣形成隔熱層，使傳熱困難，熱量很難穿透去殺滅空氣中的微生物。解決辦法加消泡劑。（二）、培養基滅菌方式1、分批滅菌（實罐滅菌）：將配制好的培養基輸入發酵罐內，用直接蒸汽加熱，達到滅菌要求的溫度和壓力后，維持一定時間，再冷卻至發酵要求的溫度，這一工藝稱為分批滅菌或實罐滅菌。適用于小批量生產，固體顆粒培養基，產泡沫多時采用。通常必須滅菌條件：110-130，5-20分鐘，培養

44、液滅菌采用高溫短時加熱的方式。2、連續滅菌：培養基在發酵罐外經過一套滅菌設備連續的加熱滅菌，冷卻后送入已滅菌的發酵罐內的工藝過程稱為連續滅菌。 使用于大規模生產、小顆粒液體培養基，產少量泡沫。 利用板式換熱器進行連續滅菌的流程圖，其流程的能量利用較合理。 三 空氣除菌（一）、空氣中的微生物：好氧性微生物的生長繁殖和形成代謝產物都需要消耗氧氣。1、大氣空氣：塵埃+沙土+各種各樣的微生物;2、空氣中懸浮的微生物一般為：103104個/立方米;3、空氣除菌的目的為除去或殺滅空氣中的微生物;4、空氣中的微生物：細菌、細菌芽孢、酵母、霉菌、放線菌及噬菌體?？諝庠谝M發酵罐之前必須進行嚴格處理，除去其中含

45、有的微生物和其他有害成分;（二）、空氣除菌方法：1、加熱滅菌：可用蒸汽、電能、空氣壓縮機產生的熱量進行滅菌。2、電除塵：含有灰塵和微生物的空氣通過高壓氣流電場，正極電場強度>1000V/cm2時，氣體產生電離，產生的離子使灰塵和微生物等成為載電體，被捕集與電極上。3、介質過濾除菌：經高溫滅菌的介質過濾層，將空氣中的微生物等顆粒阻截在介質層中，而達到除菌目的。1）絕對過濾：介質的之間的空隙小于被濾除的微生物，當空氣流過介質層后，空氣的微生物被濾除。節約能量和時間，操作簡便。微孔濾膜（孔徑小于0.5nm）；纖維介質：纖維素膜微孔濾膜2）深層過濾：以纖維狀（玻璃纖維）+顆粒狀（活性炭）介質過濾

46、層 用超玻璃纖維，聚乙烯醇等為介質的過濾層3）影響介質過濾效率的主要因素：顆粒性質、介質性質（介質填充長度L、介質填充密度和介質纖維直徑）和氣流速度.4）空氣過濾器：A、纖維狀或顆粒介質過濾器：特點：過濾層厚度L體積V壓力降P操作麻煩。介質：棉花（上下）、玻璃纖維、活性炭（中）B、過濾紙類過濾器：以微孔濾紙、濾板、濾棒構成的過濾器。特點：阻力、壓力降低，強度下降;介質：超細玻璃纖維、聚乙烯醇制成旋風式或套管式;5）、空氣過濾除菌的工藝流程 空氣凈化工藝流程圖1空氣吸氣口；2粗過濾器；3空氣壓縮機；4一級空氣冷卻器；STh級空氣冷卻器；6分水器；7空氣貯罐；8旋風分離器；9絲網除沫器；10空氣加

47、熱器8 11總空氣 過濾器；12分過濾器無菌空氣制備控制要點：提高空氣入口潔凈度（加粗過濾和增高吸氣口高度） 防壓縮空氣中夾帶的油水，影響無菌空氣質量（壓縮機出口空氣要升溫至120150）第四章 生產菌種的培養與保藏 第一節 種子制備的過程（菌種的擴大培養）種子制備一般包括兩個過程，即在固體培養基上生產大量孢子的孢子制備過程和在液體培養基中生產大量菌絲的種子制備過程。種子擴大培養：是指將保存在砂土管、冷凍干燥管中處于休眠狀態的生產菌種接入試管斜面活化后，在經過扁瓶或搖瓶及種子罐逐級放大培養而獲得一定數量和質量的純種過程。這些純種培養物稱為種子。 種子擴培的目的：接種量的需要；菌種的馴化；縮短發

48、酵時間、保證生產水平。一、工業對微生物的要求1、能在廉價原料制成的培養基上迅速生長并生成所需的代謝生產物，產量高。2、可以在易于控制的培養條件下，迅速生長和發酵，且所需酶活力高。3、生長速度和反應速度較快，發酵周期短。4、根據代謝控制的要求，選擇單產高的營養缺陷型突變株或調節突變株或野生菌株。5、選育抗噬菌體能力強的菌株，使其不易感染噬菌體。6、菌種純粹，其不易變異退化，以保證發酵生產和產品質量的穩定性。7、菌種不是病原菌，不產生任何有害的生物活性物質和毒素（包括抗生素、激素、毒素等），以保證安全。二、工業常用的微生物三、種子制備的過程大致可分為： 實驗室種子制備階段; 生產車間種子制備階段

49、實驗室種子的制備實驗室種子的制備一般采用兩種方式 對于產孢子能力強的及孢子發芽、生長繁殖快的菌種可以采用固體培養基培養孢子，孢子可直接作為種子罐的種子，這樣操作簡便，不易污染雜菌。 對于產孢子能力不強或孢子發芽慢的菌種，可以用液體培養法。 四、孢子制備孢子制備是種子制備的開始，是發酵生產的一個重要環節。（一）放線菌孢子的制備1、放線菌的孢子培養常采用：瓊脂斜面培養基2、培養基成分要求：C：1%；N：0.5%C造成生理酸性環境孢子形成;N菌絲繁殖孢子形成干燥和限制營養是直接或間接誘導孢子形成的原因。3、放線菌斜面培養：T：28；514天。4、放線菌發酵生產工藝過程 節約菌種用量，易控孢子質量菌種

50、母斜面（孢子）子斜面（孢子）搖瓶種子（菌絲）種子罐發酵罐 防菌種變異5、成分：麩皮、豆汁、蛋白胨、無機鹽（二）霉菌孢子的制備1、霉菌的孢子培養成分：大米、小米、玉米、麩皮、麥粒等天然農產品。2、霉菌培養條件：T：2528，培養414天。（三）、細菌孢子的制備：1、細菌的斜面培養基：多采用碳源限量而氮源豐富的配方。CN牛肉膏、蛋白胨2、培養條件：T多37；T少28；培養12天；產孢510天五、種子制備生產車間種子制備 ：實驗室制備的孢子或液體種子移種至種子罐擴大培養，種子罐的培養基雖因不同菌種而異，但其原則為采用易被菌利用的成分如葡萄糖、玉米漿、磷酸鹽等，如果是需氧菌，同時還需供給足夠的無菌空氣

51、，并不斷攪拌，使菌（絲）體在培養液中均勻分布，獲得相同的培養條件。 1、一級種子：孢子（或搖瓶菌絲）被接入到體積較小的種子罐中，經培養后形成大量的菌絲，這樣的種子稱為一級種子。2、二級種子：把一級種子轉入到體積較大種子罐內發酵，經培養后形成大量菌絲，這樣的種子稱為二級種子。3、二級發酵：把一級種子轉入發酵罐內發酵，稱為二級發酵。4、三級發酵：把二級種子轉入發酵罐內發酵，稱為三級發酵。（50噸罐）5、種子罐的作用：主要是使孢子發芽，生長繁殖成菌（絲）體，接入發酵罐能迅速生長，達到一定的菌體量，以利于產物的合成。6、種子罐級數：決定菌種的性質和菌體生長速度及發酵設備的合理應用。種子罐級數取決于：

52、種子的性質（生長繁殖性能）； 孢子瓶中孢子的密度（密度大則級數少）； 孢子發芽及菌絲繁殖速度； 發酵罐中種子的最低接種量； 種子罐與發酵罐的容積比；細菌：生長快，種子用量比例少，級數也較少，二級發酵。 茄子瓶種子罐發酵罐 霉菌：生長較慢，如青霉菌，三級發酵 孢子懸浮液一級種子罐（27C,40小時孢子發芽，產生菌絲 ）二級種子罐（ 27C,1024小時，菌體迅速繁殖，粗壯菌絲體）發酵罐 放線菌：生長更慢，采用四級發酵酵母：比細菌慢，比霉菌，放線菌快，通常用一級種子7、確定種子罐級數需注意的問題：種子級數越少越好，可簡化工藝和控制，減少染菌機會種子級數太少，接種量小，發酵時間延長，降低發酵罐的生產

53、率，增加染菌機會雖然種子罐級數隨產物的品種及生產規模而定。但也與所選用工藝條件有關。如改變種子罐的培養條件，加速了孢子發芽及菌體的繁殖，也可相應地減少種子罐的級數。 8、種子制備的目的：形成一定數量和質量的菌體。9、發酵目的：獲得大量發酵產物。六、種子擴大培養1、菌種擴大培養的目的：就是要為每只發酵罐的投料，提供相當數量的代謝旺盛的種子。2、種子擴大培養的任務：不但要得到純而壯的培養菌，而且要獲得活力旺盛，足夠量的培養物。七、工業微生物的培養類型1、工業微生物的培養方法：靜置培養、通氣培養 靜置培養法：將培養基盛于發酵容器中，在接種后，不通空氣進行發酵，又稱為嫌氣性發酵。通氣培養法：其生產菌種以需氧菌和兼性需氧菌屬多，它的生長的環境必須供給空氣，以維持一定的溶解氧水平，使菌體迅速生長和發酵，又稱為好氣性發酵。2、種子擴大培養階段1)液體培養法：試管+搖床;2)表面培養法：茄子瓶、克氏瓶、瓷盤;3)固體培養法：三角瓶、培養皿;A、固體培養：曲法培養：淺盤固體培養和深層固體培養（固體曲霉活性高）深層固體通風制曲：在曲房周圍用循環的冷卻增濕的無菌空氣來控制溫度和濕度，靈活調節適應菌種