1、硫酸化酵母葡聚糖體外和體內對大腸桿菌抑制作用的比較摘 要： 以酵母堿不溶性葡聚糖為原料，硫酸為酯化劑，在尿素-二甲基亞砜溶液中進行硫酸酯化反應得到易溶于水的白色硫酸化葡聚糖。利用得到的硫酸化葡聚糖進行體外和體內抑制大腸桿菌效果研究。體外抑菌實驗結果表明：硫酸化葡聚糖在體外對大腸桿菌的生長沒有抑制作用。小鼠活體實驗顯示：硫酸化葡聚糖能顯著提高大腸桿菌致腹膜炎的小鼠的成活率。關鍵詞： 酵母葡聚糖； 硫酸化； 硫酸化葡聚糖； 抑菌； 大腸桿菌Comparison of the Inhibition Effects of Sulfated Glucan on E.coli in Vitro &

2、 in VivoAbstract: Alkali-insoluble -glucan was used as raw materials to produce water-soluble white sulfated glucan by sulfuric esterification inurea-DMSO solution with sulfuric acid as esterifying agent. Then the inhibition effects of the produced sulfated glucan on E.coli in vitro and invivo were

3、studied. Its bacteriostasis in vitro showed that it could not inhibit the growth of E.coli in vitro. In vivo experiments in mice suggestedthat sulfated glucan could significantly enhance the survival rate of mice with peritonitis induced by E.coli.Key words: -glucan; sulfated; sulfated dextran; bact

4、eriostasis; E.coli酵母堿不溶性葡聚糖是一種以 -1，3 為主鏈并伴以間或的 -1，6 側鏈的天然高分子聚合物，具有多種免疫刺激活性， 能夠通過刺激免疫系統對生物反應進行修飾，保護機體免受異物的感染，增強機體的免疫能力，抑制腫瘤，抗氧化和促進傷口愈合等作用1-3，是一種重要的生物效應應答劑（biological response modifiers, BRM）。但由于酵母堿不溶性葡聚糖難溶于水， 其應用受到了很大限制。因此增加其水溶性是一個急需解決的問題，增溶的主要方法有酸解、酶解、超聲波、熱變性和化學修飾。其中化學修飾法是比較常用的一種方法， 而硫酸化是葡聚糖化學修飾的一個重

5、點。 修飾后的硫酸化葡聚糖同樣具有免疫增強活性，且其水溶性明顯優于葡聚糖，能夠擴展葡聚糖作為免疫活性增強劑的應用范圍， 開發前景十分廣闊。本文以酵母堿不溶性葡聚糖為原料，硫酸為酯化劑，在尿素-二甲基亞砜溶液中進行硫酸酯化反應得到易溶于水的白色硫酸化葡聚糖。 并對其在體外和體內對大腸桿菌的抑制作用進行了研究和比較。1 材料與方法1.1 堿不溶性酵母葡聚糖制備4稱取干燥的酵母細胞壁粗提物 100 g，加入 3 %的氫氧化鈉溶液 600 mL，攪拌均勻，將混合物置于 75 水浴中加熱 3 h，冷卻至室溫，4000 r/min 離心 10 min，沉淀物水洗兩遍。 水洗過的沉淀物， 加入 3 %的氫氧

6、化鈉溶液400 mL，混合均勻后置于 100 條件下處理 2 h，冷卻至室溫，4000 r/min 離心 10 min，重復水洗 2 次。 沉淀用丙酮處理，4000 r/min 離心 10 min， 重復用丙酮洗滌 2 次，置于 40 干燥，得到酵母不溶性葡聚糖。1.2 供試菌種和動物大腸桿菌（E.Coli）,由天津科技大學菌種保藏中心提供。ICR/HSD 小鼠，約重 18 g ，購自中國人民解放軍軍事釀酒科技 2010 年第 3 期（總第 189 期）·LIQUORMAKING SCIENCE TECHNOLOGY 2010 No3(Tol189)37釀酒科技 2010 年第 3

7、期（總第 189 期）·LIQUORMAKING SCIENCE TECHNOLOGY 2010 No3(Tol189)醫學院實驗動物中心。酵母細胞壁粗提物，由安琪酵母股份有限公司提供。1.3 培養基細菌培養基：牛肉膏 5 g、蛋白胨 10 g、NaCl l5 g、瓊脂 20 g、水 1 L、pH7.27.4,121滅菌 20 min。1.4 主要試劑及設備氫氧化鈉、丙酮、濃硫酸、二甲基亞砜均為分析純。油浴恒溫振蕩器，PL 403 電子天平，DL-5000B 大容量離心機，80 mm-G6 過濾漏斗， 透析袋，D-37520 真空冷凍干燥機（德國 Martin Christ），722

8、-S 型可見分光光度計，WQF-510 傅立葉變換紅外光譜儀。1.5 硫酸化葡聚糖的制備5準確稱取酵母 -D-葡聚糖 2.0 g 溶于含 36 g 尿素的 50 mL 二甲基亞砜中，攪拌溶解，邊攪拌邊緩慢滴加50 mL 含 5 mL 濃硫酸的二甲基亞砜混合液。 然后，置于100 的油浴恒溫振蕩器中，在 100 r/min 的轉速下進行酯化反應。 反應 4 h 后，將反應液快速冷至室溫，并加去離子水至 2 L。 稀釋后的溶液 5000 r/min 離心 10 min，所得上清液用 G6 的沙芯漏斗（1.22 m）過濾以除去未反應的酵母葡聚糖微粒。 過濾后的溶液裝入透析袋用超純水透析，共透析 5

9、d，每天換水 1 次。最后將透析所得液體濃縮至 200 mL，冷凍干燥得硫酸化酵母葡聚糖。1.6 硫酸化葡聚糖的紅外光譜測定采用溴化鉀壓片法， 用 WQF-510 傅立葉變換紅外光譜儀測定。1.7 體外抑菌實驗方法6-91.7.1 供試菌株的活化和菌懸液的制備將供試菌種大腸桿菌接入細菌試管斜面培養基上。置 37 恒溫培養箱內培養 24 h。挑取 1 環活化好的大腸桿菌放入 9 mL 無菌生理鹽水中，振蕩搖勻，制成一系列菌懸液，濃度為 107108cfu/mL，備用。1.7.2 體外抗菌實驗用無菌水把硫酸化葡聚糖配成 150 mg/mL 的水溶液， 再用二倍稀釋法得到 75 mg/mL、35.5

10、 mg/mL、17.75 mg/mL、8.875 mg/mL 4 個系列濃度的稀釋液，用無菌水作陰性對照，同系列濃度的鏈霉素作陽性對照。在超凈工作臺上，分別吸取 1×108cfu/mL 0.1 mL 加入到冷卻的培養基平板中，均勻涂布，再向平皿中等距離放入 3 個牛津杯，分別加入無菌水、硫酸化葡聚糖溶液和鏈霉素，每個菌種做 3 組平行實驗。 將涂有菌液的平皿置恒溫培養箱培養，在 37 恒溫培養箱內培養 24 h，觀察并測量抑菌圈的大小。1.8 小鼠活體抑菌實驗111.8.1 OD 與菌數標準曲線的回歸方程將供試菌種大腸桿菌接入細菌試管斜面培養基上。置 37 恒溫培養箱內培養 24 h

11、。挑取 1 環活化好的大腸桿菌放入 50 mL 無菌細菌液體培養基中，37 ，50 r/min水浴搖床培養 18 h， 取 10 mL 大腸桿菌培養液離心洗滌，所得菌體用生理鹽水稀釋成 OD 值在 0.91 之間的菌液，將此液分別做 11、11.2、11.4、11.6、11.8、12 6 個稀釋度稀釋，分別測定其 OD 值。與此同時將 6 個稀釋度的菌液進行準確的細菌平板計數。 記錄 OD 值和相應的計數結果。 計算出 OD-細菌數曲線的回歸方程：y=1.531x+0.0276，相關系數 r=0.9995。1.8.2 抗菌實驗將 20 只 SCI 小鼠分成 2 組， 每組 10 只， 用藥組以

12、250 mg/kg 的劑量腹腔注射 0.5 mL 硫酸化葡聚糖水溶液，對照組小鼠注射同等劑量的葡葡糖溶液。24 h 后對各小鼠腹腔注射 1 mL 的菌濃為 1×108個 /mL 的大腸桿菌菌液，此菌液依 1.8.1 中的方法得到。 從菌液注射完畢開始計時，此后的 30 h 內分別記錄各組小鼠的存活情況。2 結果與分析2.1 硫酸化葡聚糖紅外光譜的測定圖 1 是葡聚糖及其衍生物的紅外光譜圖。 由圖 1 可以看出， 與葡聚糖相比， 硫酸化葡聚糖的紅外圖譜在1235.7 cm-1處出現較強的不對稱 S=O 伸縮振動吸收峰。在 815.2 cm-1處， 出現與 C-O-SO3基團相關的對稱性

13、C-O-S 吸收峰。 這兩個特征性吸收峰表明硫酸基已與葡聚糖連接。2.2 硫酸化葡聚糖的抑菌效果硫酸化葡聚糖的抑菌效果見表 1。 由表 1 可以看出，硫酸化酵母葡聚糖對大腸桿菌沒有抑制作用。2.3 硫酸化葡聚糖的小鼠活體抑菌實驗對 SCR 小鼠腹腔注射 250 mg/kg 劑量的硫酸化葡聚糖，24 h 以后再對小鼠注射菌濃度為 1×108個 / mL 的大腸桿菌菌懸液，結果見圖 2。由圖 2 可以看出， 硫酸化葡聚糖對小鼠有著明顯的免疫預防作用， 注射葡萄糖的對照組小鼠的成活率只有圖 1 葡聚糖硫酸化的紅外光譜圖38造環境的可能性最大， 因此同一酒廠內的酵母菌群組成相對較為穩定， 不

14、同產地甚至不同酒廠的白酒釀造酵母則可能存在較大差異。因此， 要進一步探明多糧濃香型白酒糟醅中酵母菌的種屬分布及菌群變化的規律，還需深入研究，如發酵不同階段酵母的區系變化， 不同酵母菌菌株代謝產物對白酒化學成分、感官特性的影響等。對分離得到的某些具有特殊應用價值的酵母菌，還可開展提高出酒率、改善白酒風味等方面的應用研究， 甚至還可篩選到用于發酵木糖生產酒精，單細胞蛋白生產等多個領域的酵母菌株。參考文獻：1 陳敏.濃香型酒發酵過程中糟醅微生物動態研究J.釀酒科技，1998，89(5)：26-28.2 趙東，喬宗偉，彭志云.濃香型白酒發酵過程中酒醅微生物區系及其生態因子演變研究J.釀酒科技，2007

15、，157(7)：37-39.3 張文學，喬宗偉，胡承，等.濃香型白酒糟醅中真菌菌群的多樣性分析J.四川大學學報(工程科學版)，2006（9）：98-101.4 吳飛，陳紅英，胡承，等.濃香型白酒糟醅中可培養酵母 18SrDNA1 全序列的系統學分析J.釀酒科技，2006，（4）：23-25.5 莊名揚，孫遠孟，胡森，等.Hs-1、Hs-4 在全興系列濃香型白酒生產中應用J.釀酒科技，1993，（5）：40.6 王治國，夏明星，管清先，等.應用產酯酵母提高濃香型白酒質量的研究J .釀酒科技，1994，（4) ：13-15.7 J.A.巴尼特，R.W.佩恩，D.亞羅酵母菌的特征與鑒定手冊M.青島：

16、青島海洋大學出版社，1991.8 張文學，岳元媛，向文良，等.濃香型白酒酒醅中化學物質的變化及其規律性J.四川大學學報(工程科學版)，2005，（7）：44-48.圖 2 硫酸化葡聚糖小鼠活體抗大腸桿菌實驗結果- ! 20 %，而注射了硫酸化葡聚糖的用藥組小鼠的成活率達到 80 %，明顯高于對照組小鼠。3 結論在助溶劑尿素的協助下， 把酵母葡聚糖溶于二甲基亞砜（DMSO）中,以二甲基亞砜硫酸混合液為硫酸化試劑，對酵母堿不溶性葡聚糖進行硫酸化修飾，得到白色硫酸化葡聚糖易溶于水。 通過體外抑菌實驗和小鼠活體抑菌實驗對所得葡聚糖的生物活性進行檢測。結果表明，硫酸化葡聚糖在體外對大腸桿菌無抑制作用，

17、但是用硫酸化葡聚糖對小鼠進行腹腔注射能顯著提高小鼠的免疫防疫能力，減小大腸桿菌致腹膜炎小鼠的死亡率。硫酸化葡聚糖不能直接抑制大腸桿菌的生長， 但是可以通過激活機體的免疫系統來抵制大腸桿菌的感染。 體內和體外抗菌實驗的比較進一步表明硫酸化葡聚糖是一種生物反應效應劑， 其活性機制是通過激活機體的免疫系統來表現其生物活性。參考文獻：1 Ohno. N, Miura. T, Miura, N. N, Adachi. Y, Yadomae. T.Structure and biological activities of hypochlorite oxidizedzymosanJ. Carbohydra

18、te Polymers. 2001, vol. 44：339-349.2 Ozcan Erel. A novel automated method to measure total antioxi-dant response against potent free radical reactionsJ. ClinicalBiochemistry . 2004, 37：112-119.3 David L. Williams, Henry A, et al. Development, physicoche-mical characterization and preclinical efficacy evaluation of awater soluble glucan sulfate derived from SaccharomycescerevisiaeJ. Immunopharmacology, 1991, vol. 22：139-156.4 廖鮮艷，顧國賢，李崎，李永仙. 啤酒廢酵母殘渣制備堿不溶性葡聚糖J. 釀酒，2001，28(1)：75-77.5 David L. Williams, Henry A. Pretus, Rose B. McNamee, et al.Development of a water-soluble, sulfated (13)