1、doi：10.3969/j.issn.1000V84X.2012.06.021肺炎鏈球菌蛋白疫苗候選蛋白研究進(jìn)展李莉莉鄭凡王健（北京生物制品研究所，北京100024）100084X（2012）06-0573-04廣，可以對所有年齡和免疫狀態(tài)的人群產(chǎn)生保護(hù)作用，并旦誘發(fā)免疫記憶，保護(hù)力持久。（2）采用高度保守的共同蛋白作為疫苗，不受血清型限制,對于所有血清型均產(chǎn)生效果。（3）價格相對低廉，生產(chǎn)成本低，適合發(fā)展中國家大規(guī)模的使用。本文對最有希望成為候選疫苗的蛋白進(jìn)行綜述。1 溶血素（Pneumolysin,Ply）Ply是一個由471個氨基酸組成的分子量為53kD蛋白,定位于肺炎鏈球菌的細(xì)胞漿,在

2、細(xì)胞生K到某個階段時被釋放出來。P】y的主要作用是溶血和激活補體。Ply可能存在四個結(jié)構(gòu)域，分別為domain，其主要活性位點存在于domain4oPly與受體結(jié)合并插入到細(xì)胞膜，啟動溶血功能（主要定位在domain4C末端）。而激活補體的區(qū)域主要定位于domain4N末端Ply能夠破壞蜂窩狀連接細(xì)胞，阻止呼吸上皮和室管膜的纖毛蠕動;降低多型核白細(xì)胞的遷移和吞噬活性，能刺激宿主細(xì)胞釋放炎性細(xì)胞因子。通過與IgG的Fc段結(jié)合可直接激活補體的經(jīng)典途徑，同時促進(jìn)炎癥反應(yīng)和消除血清的調(diào)理作用。鼻腔和腹膜腔的肺炎鏈球菌攻擊實驗結(jié)果顯示，重組Ply可使老鼠壽命延長89%和93%。在肺炎鏈球菌動脈注射的攻擊

3、實驗中,Ply不能徹底保護(hù)老鼠。鼻內(nèi)洗滌法也不能減低鼻內(nèi)致病菌的數(shù)量。但是鼻內(nèi)攻擊實驗中能夠降低肺內(nèi)的致病圈數(shù)。這些結(jié)果顯示,Ply對于細(xì)菌在鼻咽的復(fù)制沒有作用，但是對于病菌在肺部的復(fù)制、并且穿越肺部進(jìn)入血液，最后在血液中高滴度復(fù)制具有重要作用。P】y的全氨基酸序列高度保守，抗原性強。因此,Ply可以作為覆蓋所有血清型抗原疫苗的備選蛋白，而且該疫苗潛能已經(jīng)被不同實驗室證實。盡管免疫制備方法不同、所用肺炎鏈球菌的血清型不同、實驗動物種類不同，但是,Ply的保護(hù)作用實驗得到了一致的結(jié)果。2 肺炎鏈球菌表面粘附素A（Pneumococcalsurgaceantigen,PsaA）PsaA是一個35k

4、D、由309個氨基酸組成的蛋中國圖書分類號R373.21文獻(xiàn)標(biāo)識碼A文章編號肺炎鏈球菌能夠引起肺炎、腦膜炎、中耳炎等疾病,在世界范圍內(nèi)具有很高的致病率和致死率?；颊咧饕性趮胗變骸⒗夏耆撕兔庖吡Φ拖碌娜巳?。據(jù)統(tǒng)計，每年大約有一百萬的五歲以下兒童死于肺炎鏈球留引起的疾病?？股厥欠窝祖溓蚓鸺膊∽畛Ｓ玫闹委熕幬铮?，耐青霉素和多重耐藥菌的出現(xiàn)使這些疾病的治療難度大大增加，同時，治療費用也逐步攀升，而疫苗是解決這個問題的最好方法。莢膜多糖是最早-被認(rèn)識的肺炎鏈球菌致病因子，擁有80種以上血清型。1983年，美國批準(zhǔn)使用23價肺炎鏈球菌多糖疫苗（23-valentpneumococcalpol

5、ysaccharidevaccine,PPV23）,該多糖疫苗對相對應(yīng)的血清型（如1、2、3、4、5、6B、7N、8、9N、10A、11A、12F、14、15B、17F、18C、19A、19F、20、22F、23F、33F）預(yù)防效果大于65%,但對此23個型別以外的其他型別的有效率為0%-60%o而攜帶和發(fā)病率最高的小于2歲的兒童和免疫受損害者對該疫苗的抗體應(yīng)答較弱甚至無效。7價結(jié)合肺炎鏈球菌疫苗（Heptavalentpneumococcalconjugatevaccine,PCV7）于2000年在美國上市，該疫苗是針對肺炎鏈球曲7個血清型（4,6B,9V,14,18C,19F,23F）的莢

6、膜多糖，能夠100%的預(yù)防其所包含的7個血清型細(xì)菌的感染。與23價苗的不同是,7價結(jié)合苗能夠引起T細(xì)胞免疫，能夠?qū)π∮?歲的嬰幼兒有100%的作用，對于預(yù)防疫苗型菌株引起的侵襲性疾病有效率為97.4%0但因為僅包括7個血清型,該疫苗的應(yīng)用在美國致使非疫苗型細(xì)萌所致侵襲性疾病的發(fā)病率升高了25%141o目前，國內(nèi)13價結(jié)合苗也在研制中，但是這種結(jié)合苗質(zhì)量難于控制，成本也大大增加。由于過于昂貴，所以一些經(jīng)濟(jì)欠發(fā)達(dá)地區(qū)的結(jié)合苗被放棄使用。這就要求研發(fā)更加有效且便宜的疫苗，而蛋白疫苗就是解決這個問題的最好途徑。蛋白疫苗有以下幾點優(yōu)勢：（1）保護(hù)作用范圍通訊作者作者簡介:李莉莉（1979年），女,碩士，

7、助理研究員，主要從事生物制藥和新型疫苗研發(fā)方面研究.E-mail：chuji79yahoo.0白質(zhì)。PsaA在肺炎鏈球菌粘附、自溶以及毒力方面都起著重要作用。PsaA與多種菌體粘附素的氨基酸序列高度同源。X晶體衍射實驗顯示,PsaA是一個橢圓形蛋白,模體分析結(jié)果確認(rèn),PsaA是一種脂蛋白，它的N末端共價結(jié)合在細(xì)胞膜的磷脂層上。因為細(xì)胞壁的厚度和蛋白大小的關(guān)系，PsaA被埋在多聚糖和莢膜多糖下面，所以，抗PsaA抗體無法結(jié)合到細(xì)胞壁上PsaA在各個血清型中都是高度保守，沒有大的抗原和分子變化。PsaA已經(jīng)被作為疫苗在患有鼻炎、肺炎、菌血癥和敗血癥的動物模型中進(jìn)行了評價。多個實驗室結(jié)果顯示,Psa

8、A免疫效果在鼻咽部分的作用效果明顯，但在不同血清型之間存在差異，如對于WU2型,PsaA有良好保護(hù)性，但對A66.1作用就不明顯PsaA對所有D39(3血清型)攻擊的小鼠都能延長壽命，但對WCH43(4血清型)沒有作用，推測可能在不同型別菌體的細(xì)胞壁厚度、莢膜多糖等因素決定了PsaA暴露程度不同，從而導(dǎo)致免疫效果有差異，所以，PsaA可以作為肺炎鏈球菌蛋白疫苗的重要組成部分。3肺炎鏈球菌表面蛋白A(PneumococcalsurfaceproteinA,PspA)PspA是肺炎鏈球菌細(xì)胞表面的膽堿結(jié)合蛋白，也是一種重要致病因子。它的主要作用是與乳鐵蛋白結(jié)合使乳鐵蛋白喪失功能，從而失去乳鐵蛋白對

9、菌體生長的控制'E;抑制補體活化，降低C3b在肺炎鏈球菌表面的沉積，從而干擾補體介導(dǎo)的吞噬調(diào)理作用"妲。PspA與PsaA和PLY不同的是,在不同型別間,PspA核酸和氨基酸序列并不保守?？贵w免疫可以發(fā)生交叉反應(yīng)，但并不是對每個血清型都有效。這種變化與菌體上莢膜多糖的血清型并不相關(guān)。盡管不同PspA的序列不同，但都有相似的空間結(jié)構(gòu)。PspA有四個獨立結(jié)構(gòu)域：N末端的a螺旋、脯氨酸富集區(qū)、高度保守的20個氨基酸重復(fù)序列和在C末端輕度疏水的17個氨基酸序列根據(jù)細(xì)胞表面a螺旋區(qū)的不同，將PspA分成6個分支3個家族。家族1和2的a螺旋區(qū)有54%同源性，其他區(qū)域有84%-100%同源

10、性。研究顯示，在美國、哥倫比亞、巴西、阿根廷大概有94%99%都是1和2家族。在皮下和腹膜攻擊的敗血癥動物模型中，全長PspAl蛋白使實驗動物存活時間和存活率分別增加了80.6%和62.5%o用PspA氮末端a螺旋區(qū)免疫以皮下攻擊的實驗動物,可以延長動物的存活時間，對于同一家族的作用達(dá)50%,不同家族的作用為25%。保護(hù)作用的效力隨使用的片段的長度的增加而加強。與PsaA和PLY相比,PspA在鼻內(nèi)定植、肺炎、敗血癥有更廣泛的保護(hù)作用。但是,PspA對膽堿有強烈干擾,而膽堿是細(xì)胞結(jié)構(gòu)中重要的信號，而且這種干擾作用對于人或者實驗動物的負(fù)面作用還沒有得到驗證。4膽堿結(jié)合蛋白A(Cholinebin

11、dingproteinA,CbpA)CbpA是一個多型蛋白，分子量在69kD到120kD之間,具有與PspA高度同源的膽堿結(jié)合結(jié)構(gòu)域。CbpA的基因突變會導(dǎo)致肺炎鏈球菌與上皮細(xì)胞結(jié)合能力降低，也能導(dǎo)致在實驗動物鼻咽部定植能力降低。提示CbpA有可能是主要負(fù)責(zé)肺炎鏈球菌與真核生物細(xì)胞粘附的作用"6】。CbpA還可以和補體C3以及人血清因子H結(jié)合。H因子是補體激活旁路途徑的調(diào)節(jié)因子，可與C3結(jié)合加快C3降解。所以,CbpA能夠幫助細(xì)菌免于補體旁路途徑的攻擊"刀。由此可見,CbpA是一個多功能蛋白，在肺炎鏈球菌粘附、入侵和逃避機體補體系統(tǒng)進(jìn)攻過程中起主要作用。CbpA序列主要有三

12、個結(jié)構(gòu)域，包括位于N端的多形態(tài)a螺旋區(qū)、保守的脯氨酸富集區(qū)、細(xì)胞壁錨定區(qū)。盡管CbpA在肺炎鏈球菌中有很重要的作用,但是對于其免疫保護(hù)作用的研究很有限。動物實驗結(jié)果顯示，用CbpA的N端免疫動物能夠大大提高腹腔或者靜脈攻擊動物的存活率。由于肺炎鏈球菌致病機理復(fù)雜,CbPA有很大作為疫苗抗原的前景，但需要更多實驗結(jié)果對其進(jìn)行驗證。然而，由于它可與C3、H因子、plgR分子相互作用，這些可能會影響PspC作為疫苗的安全性。5肺炎鏈球菌三蛆氨酸蛋白(Pneumococcalhistidinetriedproteins,Pht)Pht是一個裸露在菌體表面的蛋白家族，分子量77-88kD,都含有一個具有

13、三個組氨酸的模體:HXXHXHOPhtA是在利用計算機對肺炎鏈球菌全基因序列搜索帶有信號肽n的蛋白時被發(fā)現(xiàn)的網(wǎng)，家族成員包括PhtB.PhtD.PhtE和PhtAoPhtA.PhtB和PhtD同源性較高，在前三分之二的序列中有59%81%同源性。PhtE相差較遠(yuǎn)，有40%同源性。但三組氨酸模體在蛋白理化性質(zhì)、生物學(xué)活性中的作用還沒有被確定。在這類蛋白中，PhtB被研究得比較透徹，已證實在研究過的14個肺炎鏈球菌血清型中都有表達(dá)。在皮下和鼻內(nèi)攻擊肺炎鏈球菌的動物模型中,PhtB能夠起到保護(hù)作用，并且可顯著降低鼻咽、肺部感染和菌血癥的風(fēng)險。PhtE的免疫作用與PhtB相似，有免疫作用的位點均位于蛋

14、白的C末端,PhtA、PhtD刺激產(chǎn)生保護(hù)性抗體,在致死性實驗中保護(hù)作用為40%和80%oPhtB、PhtD、PhtE也可以作為候選疫苗蛋白，這些蛋白質(zhì)的性質(zhì)、生化功能、傳播路徑等還需要進(jìn)一步研究。6 肺炎鏈球菌保護(hù)蛋白A(PneumococalprotectiveproteinA,PppA)PppA是肺炎鏈球菌候選疫苗蛋白中分子量最小的蛋白，分子量20kDo這種蛋白在用磷酸鹽緩沖液清洗完整菌體時可以大量獲得。免疫電子顯微鏡觀察可見，抗PppA血清可以與菌體表面結(jié)合，說明PppA是一種表達(dá)在菌體表面的蛋白。序列分析顯示,PppA蛋白不是大的開放閱讀框的一部分,也沒有典型的分泌用信號肽序列。這種

15、蛋白如何穿越膜的機制還不很清楚。該蛋白抗原性保守，序列也高度保守，在實驗的各個型別中同源性達(dá)92%97%。PppA的生化功能和在傳播中的作用等都還未知。PppA的免疫作用研究也很少,在鼻咽定植的動物模型中產(chǎn)生了高滴度血清抗體，降低了攻擊風(fēng)險。關(guān)于PppA仍需要進(jìn)一步研究。7 神經(jīng)氨酸昔酶(Neuraminidase)Neuraminidase是一種酶，能夠把粘液素、糖蛋白、糖脂類的N-乙酰神經(jīng)氨酸末端從菌體表面切開。生化研究顯示，肺炎鏈球菌至少有兩種神經(jīng)氨酸酶：NanA和NanB,分子量分別是100kD和75kDw。兩個蛋白的氨基酸序列并不一致。目前對NanA研究相對較多。根據(jù)序列預(yù)測分析,N

16、anA可能有三個結(jié)構(gòu)：氨基端區(qū)域、脯氨酸富集區(qū)和細(xì)胞壁錨定區(qū)。這種結(jié)構(gòu)顯示，蛋白可能是共價結(jié)合在肽聚糖的菠基上，通過跨膜區(qū)穿越細(xì)胞壁，暴露它的氨基端在菌體外。NanA的發(fā)病機制在南美粟鼠耳炎動物模型中得到了驗證。如果使NanA突變失活，可以輕易減少實驗動物鼻咽部的肺炎鏈球菌菌體。證實NanA的作用就是在肺炎鏈球菌入侵時去除上皮細(xì)胞表面的硅酸位點，使下面的受體暴露，增強菌體在鼻咽部的定植能力【習(xí)。最新研究顯示，在不同型別間，NanA的氨基酸序列和抗原性存在較大變異，這種變化可能影響其成為疫苗的備選蛋白。8 自溶素(Autolysin)肺炎鏈球萌白溶素是一種酶，叫N-乙酰胞壁?；鵏-丙氨酸酰胺酶(

17、LytA)oLytA能夠降解細(xì)菌細(xì)胞壁的肽聚糖骨架，能夠參與細(xì)胞的生長和分裂。這種自溶素的功能在所有肺炎鏈球菌中均有顯示。LytA分子約36kD,含兩個功能區(qū)，氨基端負(fù)責(zé)催化功能,歿基端有膽堿結(jié)合區(qū)域,使蛋白能夠和細(xì)胞壁結(jié)合'巧。電子顯微鏡觀察證實,LytA也是細(xì)胞外表面蛋白，抗LytA抗體可與肺炎鏈球菌結(jié)合。LytA序列在各個型別中都是高度保守有關(guān)LytA的免疫實驗進(jìn)行的也很有限。用純化的LytA免疫鼻腔攻擊肺炎鏈球菌的小鼠，只能小幅度提高存活時間，不能提高存活率。但是，用腹腔內(nèi)注射法LytA免疫攻毒的小鼠卻能夠提高存活率。目前,雖然對這種蛋白的基礎(chǔ)研究還很少，由于LytA蛋白序列在

18、各個性別間高度保守，使之成為了蛋白疫苗的候選目標(biāo)。9 鐵離子轉(zhuǎn)運蛋白(Irontransportprotein,PiuAandPiaA)鐵離子在細(xì)菌的致病過程中有重要作用，但是,肺炎鏈球菌本身并不產(chǎn)生交換鐵的含鐵細(xì)胞。研究與肺炎鏈球菌同源的革蘭氏陰陽菌的基因時發(fā)現(xiàn)了ABC三種轉(zhuǎn)運蛋白的操縱子:Piu.pia.pit,每個操作子分別編碼結(jié)合蛋白、透酶、ATP酶。PiuA被研究的比較透徹，它是一種脂蛋白，處在膜外緣，可以結(jié)合血紅素和亞血紅素。但是最近研究顯示，高滴度兔抗PiuA和PiaA抗體可以在表面結(jié)合，提示這兩種蛋白可能存在于細(xì)胞的表面。PiuA和PiaA存在于所有23種型別的菌體中。目前，對

19、于這兩種蛋白作為備選疫苗的研究卜分有限10三種新表面蛋白典型的疫苗抗原是分泌蛋白和表面蛋白。對肺炎鏈球菌N4基因進(jìn)行全基因序列搜索，以尋找這類蛋白，在2687個潛在開放閱讀框中，發(fā)現(xiàn)了110個基因帶有一個或者多個不同模體的表面蛋白，其中108個片段包括97個完整的基因被克隆出來。相應(yīng)蛋白也被表達(dá)或純化,并進(jìn)行了動物實驗。其中,6蛋白對通過腹腔注射攻擊的小鼠產(chǎn)生保護(hù)性作用。包括endo-p-N-acetylglucosaminidase(LytB,SP46),1,4-p-N-acetyimuraminidase(LytC,Sp91)和細(xì)胞壁相關(guān)絲氨酸蛋白酶(Spl28,Spl30)。這些蛋白在2

20、3個型別的菌體中無論是序列還是抗原性均保守,并且均可以發(fā)現(xiàn)于細(xì)胞壁和細(xì)胞膜，它們可能是好的疫苗備選蛋白，但是還需要做更進(jìn)一步的研究。11總結(jié)21價莢膜多糖疫苗和7價結(jié)合疫苗已具有良好保護(hù)老人和孩子免受大部分肺炎鏈球菌攻擊的作用，但是由于型別的限制以及可能發(fā)生的致病菌株替換，都要求研制新的、保護(hù)力更強更廣的蛋白疫苗。由于肺炎鏈球菌致病機理并不是簡單的細(xì)胞毒素和細(xì)胞溶解，而是極其復(fù)雜。從最初鼻咽部的定植到入侵、到發(fā)展出癥狀，如中耳炎、腦膜炎、肺炎、菌血癥等,肺炎鏈球菌都是用不同的毒力因子，在不同的階段感染和破壞機體組織，同時逃避機體的免疫機制。這些不同的蛋白刺激機體產(chǎn)生的抗體有不同的保護(hù)作用。在所

21、研究的蛋白中，PsaA、PspA、PhtB、PppA、NanA能夠有效清除50%以上鼻內(nèi)感染。PspA、PhiB蛋白能夠刺激機體產(chǎn)生具有保護(hù)作用的抗體，是好的疫苗備選蛋白。幾種蛋白的聯(lián)合應(yīng)用會產(chǎn)生更加強大和復(fù)雜的保護(hù)作用，如PsaA、Ply、PspA的聯(lián)合使用可以在動物模型中產(chǎn)生更加強大的保護(hù)作用。如果這些蛋白不能作為疫苗提供有效的保護(hù)，它還可以作為一種蛋白載體服務(wù)于多糖疫苗，或者作為現(xiàn)在一些疫苗的補充成分,為疫苗中所不能提供保護(hù)的型別提供保護(hù)。制備蛋白疫苗相對簡單、廉價，又具有保護(hù)作用強、保護(hù)范圍廣等多糖疫苗所無法比擬的優(yōu)點，所以，蛋白質(zhì)疫苗取代多糖和多糖結(jié)合疫苗是發(fā)展的趨勢°12

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