1、doi：10.3969/j.issn.1000V84X.2012.06.021肺炎鏈球菌蛋白疫苗候選蛋白研究進展李莉莉鄭凡王健（北京生物制品研究所，北京100024）100084X（2012）06-0573-04廣，可以對所有年齡和免疫狀態的人群產生保護作用，并旦誘發免疫記憶，保護力持久。（2）采用高度保守的共同蛋白作為疫苗，不受血清型限制,對于所有血清型均產生效果。（3）價格相對低廉，生產成本低，適合發展中國家大規模的使用。本文對最有希望成為候選疫苗的蛋白進行綜述。1 溶血素（Pneumolysin,Ply）Ply是一個由471個氨基酸組成的分子量為53kD蛋白,定位于肺炎鏈球菌的細胞漿,在

2、細胞生K到某個階段時被釋放出來。P】y的主要作用是溶血和激活補體。Ply可能存在四個結構域，分別為domain，其主要活性位點存在于domain4oPly與受體結合并插入到細胞膜，啟動溶血功能（主要定位在domain4C末端）。而激活補體的區域主要定位于domain4N末端Ply能夠破壞蜂窩狀連接細胞，阻止呼吸上皮和室管膜的纖毛蠕動;降低多型核白細胞的遷移和吞噬活性，能刺激宿主細胞釋放炎性細胞因子。通過與IgG的Fc段結合可直接激活補體的經典途徑，同時促進炎癥反應和消除血清的調理作用。鼻腔和腹膜腔的肺炎鏈球菌攻擊實驗結果顯示，重組Ply可使老鼠壽命延長89%和93%。在肺炎鏈球菌動脈注射的攻擊

3、實驗中,Ply不能徹底保護老鼠。鼻內洗滌法也不能減低鼻內致病菌的數量。但是鼻內攻擊實驗中能夠降低肺內的致病圈數。這些結果顯示,Ply對于細菌在鼻咽的復制沒有作用，但是對于病菌在肺部的復制、并且穿越肺部進入血液，最后在血液中高滴度復制具有重要作用。P】y的全氨基酸序列高度保守，抗原性強。因此,Ply可以作為覆蓋所有血清型抗原疫苗的備選蛋白，而且該疫苗潛能已經被不同實驗室證實。盡管免疫制備方法不同、所用肺炎鏈球菌的血清型不同、實驗動物種類不同，但是,Ply的保護作用實驗得到了一致的結果。2 肺炎鏈球菌表面粘附素A（Pneumococcalsurgaceantigen,PsaA）PsaA是一個35k

4、D、由309個氨基酸組成的蛋中國圖書分類號R373.21文獻標識碼A文章編號肺炎鏈球菌能夠引起肺炎、腦膜炎、中耳炎等疾病,在世界范圍內具有很高的致病率和致死率。患者主要集中在嬰幼兒、老年人和免疫力低下的人群。據統計，每年大約有一百萬的五歲以下兒童死于肺炎鏈球留引起的疾病。抗生素是肺炎鏈球菌引起疾病最常用的治療藥物，但是，耐青霉素和多重耐藥菌的出現使這些疾病的治療難度大大增加，同時，治療費用也逐步攀升，而疫苗是解決這個問題的最好方法。莢膜多糖是最早-被認識的肺炎鏈球菌致病因子，擁有80種以上血清型。1983年，美國批準使用23價肺炎鏈球菌多糖疫苗（23-valentpneumococcalpol

5、ysaccharidevaccine,PPV23）,該多糖疫苗對相對應的血清型（如1、2、3、4、5、6B、7N、8、9N、10A、11A、12F、14、15B、17F、18C、19A、19F、20、22F、23F、33F）預防效果大于65%,但對此23個型別以外的其他型別的有效率為0%-60%o而攜帶和發病率最高的小于2歲的兒童和免疫受損害者對該疫苗的抗體應答較弱甚至無效。7價結合肺炎鏈球菌疫苗（Heptavalentpneumococcalconjugatevaccine,PCV7）于2000年在美國上市，該疫苗是針對肺炎鏈球曲7個血清型（4,6B,9V,14,18C,19F,23F）的莢

6、膜多糖，能夠100%的預防其所包含的7個血清型細菌的感染。與23價苗的不同是,7價結合苗能夠引起T細胞免疫，能夠對小于2歲的嬰幼兒有100%的作用，對于預防疫苗型菌株引起的侵襲性疾病有效率為97.4%0但因為僅包括7個血清型,該疫苗的應用在美國致使非疫苗型細萌所致侵襲性疾病的發病率升高了25%141o目前，國內13價結合苗也在研制中，但是這種結合苗質量難于控制，成本也大大增加。由于過于昂貴，所以一些經濟欠發達地區的結合苗被放棄使用。這就要求研發更加有效且便宜的疫苗，而蛋白疫苗就是解決這個問題的最好途徑。蛋白疫苗有以下幾點優勢：（1）保護作用范圍通訊作者作者簡介:李莉莉（1979年），女,碩士，

7、助理研究員，主要從事生物制藥和新型疫苗研發方面研究.E-mail：chuji79yahoo.0白質。PsaA在肺炎鏈球菌粘附、自溶以及毒力方面都起著重要作用。PsaA與多種菌體粘附素的氨基酸序列高度同源。X晶體衍射實驗顯示,PsaA是一個橢圓形蛋白,模體分析結果確認,PsaA是一種脂蛋白，它的N末端共價結合在細胞膜的磷脂層上。因為細胞壁的厚度和蛋白大小的關系，PsaA被埋在多聚糖和莢膜多糖下面，所以，抗PsaA抗體無法結合到細胞壁上PsaA在各個血清型中都是高度保守，沒有大的抗原和分子變化。PsaA已經被作為疫苗在患有鼻炎、肺炎、菌血癥和敗血癥的動物模型中進行了評價。多個實驗室結果顯示,Psa

8、A免疫效果在鼻咽部分的作用效果明顯，但在不同血清型之間存在差異，如對于WU2型,PsaA有良好保護性，但對A66.1作用就不明顯PsaA對所有D39(3血清型)攻擊的小鼠都能延長壽命，但對WCH43(4血清型)沒有作用，推測可能在不同型別菌體的細胞壁厚度、莢膜多糖等因素決定了PsaA暴露程度不同，從而導致免疫效果有差異，所以，PsaA可以作為肺炎鏈球菌蛋白疫苗的重要組成部分。3肺炎鏈球菌表面蛋白A(PneumococcalsurfaceproteinA,PspA)PspA是肺炎鏈球菌細胞表面的膽堿結合蛋白，也是一種重要致病因子。它的主要作用是與乳鐵蛋白結合使乳鐵蛋白喪失功能，從而失去乳鐵蛋白對

9、菌體生長的控制'E;抑制補體活化，降低C3b在肺炎鏈球菌表面的沉積，從而干擾補體介導的吞噬調理作用"妲。PspA與PsaA和PLY不同的是,在不同型別間,PspA核酸和氨基酸序列并不保守。抗體免疫可以發生交叉反應，但并不是對每個血清型都有效。這種變化與菌體上莢膜多糖的血清型并不相關。盡管不同PspA的序列不同，但都有相似的空間結構。PspA有四個獨立結構域：N末端的a螺旋、脯氨酸富集區、高度保守的20個氨基酸重復序列和在C末端輕度疏水的17個氨基酸序列根據細胞表面a螺旋區的不同，將PspA分成6個分支3個家族。家族1和2的a螺旋區有54%同源性，其他區域有84%-100%同源

10、性。研究顯示，在美國、哥倫比亞、巴西、阿根廷大概有94%99%都是1和2家族。在皮下和腹膜攻擊的敗血癥動物模型中，全長PspAl蛋白使實驗動物存活時間和存活率分別增加了80.6%和62.5%o用PspA氮末端a螺旋區免疫以皮下攻擊的實驗動物,可以延長動物的存活時間，對于同一家族的作用達50%,不同家族的作用為25%。保護作用的效力隨使用的片段的長度的增加而加強。與PsaA和PLY相比,PspA在鼻內定植、肺炎、敗血癥有更廣泛的保護作用。但是,PspA對膽堿有強烈干擾,而膽堿是細胞結構中重要的信號，而且這種干擾作用對于人或者實驗動物的負面作用還沒有得到驗證。4膽堿結合蛋白A(Cholinebin

11、dingproteinA,CbpA)CbpA是一個多型蛋白，分子量在69kD到120kD之間,具有與PspA高度同源的膽堿結合結構域。CbpA的基因突變會導致肺炎鏈球菌與上皮細胞結合能力降低，也能導致在實驗動物鼻咽部定植能力降低。提示CbpA有可能是主要負責肺炎鏈球菌與真核生物細胞粘附的作用"6】。CbpA還可以和補體C3以及人血清因子H結合。H因子是補體激活旁路途徑的調節因子，可與C3結合加快C3降解。所以,CbpA能夠幫助細菌免于補體旁路途徑的攻擊"刀。由此可見,CbpA是一個多功能蛋白，在肺炎鏈球菌粘附、入侵和逃避機體補體系統進攻過程中起主要作用。CbpA序列主要有三

12、個結構域，包括位于N端的多形態a螺旋區、保守的脯氨酸富集區、細胞壁錨定區。盡管CbpA在肺炎鏈球菌中有很重要的作用,但是對于其免疫保護作用的研究很有限。動物實驗結果顯示，用CbpA的N端免疫動物能夠大大提高腹腔或者靜脈攻擊動物的存活率。由于肺炎鏈球菌致病機理復雜,CbPA有很大作為疫苗抗原的前景，但需要更多實驗結果對其進行驗證。然而，由于它可與C3、H因子、plgR分子相互作用，這些可能會影響PspC作為疫苗的安全性。5肺炎鏈球菌三蛆氨酸蛋白(Pneumococcalhistidinetriedproteins,Pht)Pht是一個裸露在菌體表面的蛋白家族，分子量77-88kD,都含有一個具有

13、三個組氨酸的模體:HXXHXHOPhtA是在利用計算機對肺炎鏈球菌全基因序列搜索帶有信號肽n的蛋白時被發現的網，家族成員包括PhtB.PhtD.PhtE和PhtAoPhtA.PhtB和PhtD同源性較高，在前三分之二的序列中有59%81%同源性。PhtE相差較遠，有40%同源性。但三組氨酸模體在蛋白理化性質、生物學活性中的作用還沒有被確定。在這類蛋白中，PhtB被研究得比較透徹，已證實在研究過的14個肺炎鏈球菌血清型中都有表達。在皮下和鼻內攻擊肺炎鏈球菌的動物模型中,PhtB能夠起到保護作用，并且可顯著降低鼻咽、肺部感染和菌血癥的風險。PhtE的免疫作用與PhtB相似，有免疫作用的位點均位于蛋

14、白的C末端,PhtA、PhtD刺激產生保護性抗體,在致死性實驗中保護作用為40%和80%oPhtB、PhtD、PhtE也可以作為候選疫苗蛋白，這些蛋白質的性質、生化功能、傳播路徑等還需要進一步研究。6 肺炎鏈球菌保護蛋白A(PneumococalprotectiveproteinA,PppA)PppA是肺炎鏈球菌候選疫苗蛋白中分子量最小的蛋白，分子量20kDo這種蛋白在用磷酸鹽緩沖液清洗完整菌體時可以大量獲得。免疫電子顯微鏡觀察可見，抗PppA血清可以與菌體表面結合，說明PppA是一種表達在菌體表面的蛋白。序列分析顯示,PppA蛋白不是大的開放閱讀框的一部分,也沒有典型的分泌用信號肽序列。這種

15、蛋白如何穿越膜的機制還不很清楚。該蛋白抗原性保守，序列也高度保守，在實驗的各個型別中同源性達92%97%。PppA的生化功能和在傳播中的作用等都還未知。PppA的免疫作用研究也很少,在鼻咽定植的動物模型中產生了高滴度血清抗體，降低了攻擊風險。關于PppA仍需要進一步研究。7 神經氨酸昔酶(Neuraminidase)Neuraminidase是一種酶，能夠把粘液素、糖蛋白、糖脂類的N-乙酰神經氨酸末端從菌體表面切開。生化研究顯示，肺炎鏈球菌至少有兩種神經氨酸酶：NanA和NanB,分子量分別是100kD和75kDw。兩個蛋白的氨基酸序列并不一致。目前對NanA研究相對較多。根據序列預測分析,N

16、anA可能有三個結構：氨基端區域、脯氨酸富集區和細胞壁錨定區。這種結構顯示，蛋白可能是共價結合在肽聚糖的菠基上，通過跨膜區穿越細胞壁，暴露它的氨基端在菌體外。NanA的發病機制在南美粟鼠耳炎動物模型中得到了驗證。如果使NanA突變失活，可以輕易減少實驗動物鼻咽部的肺炎鏈球菌菌體。證實NanA的作用就是在肺炎鏈球菌入侵時去除上皮細胞表面的硅酸位點，使下面的受體暴露，增強菌體在鼻咽部的定植能力【習。最新研究顯示，在不同型別間，NanA的氨基酸序列和抗原性存在較大變異，這種變化可能影響其成為疫苗的備選蛋白。8 自溶素(Autolysin)肺炎鏈球萌白溶素是一種酶，叫N-乙酰胞壁酰基L-丙氨酸酰胺酶(

17、LytA)oLytA能夠降解細菌細胞壁的肽聚糖骨架，能夠參與細胞的生長和分裂。這種自溶素的功能在所有肺炎鏈球菌中均有顯示。LytA分子約36kD,含兩個功能區，氨基端負責催化功能,歿基端有膽堿結合區域,使蛋白能夠和細胞壁結合'巧。電子顯微鏡觀察證實,LytA也是細胞外表面蛋白，抗LytA抗體可與肺炎鏈球菌結合。LytA序列在各個型別中都是高度保守有關LytA的免疫實驗進行的也很有限。用純化的LytA免疫鼻腔攻擊肺炎鏈球菌的小鼠，只能小幅度提高存活時間，不能提高存活率。但是，用腹腔內注射法LytA免疫攻毒的小鼠卻能夠提高存活率。目前,雖然對這種蛋白的基礎研究還很少，由于LytA蛋白序列在

18、各個性別間高度保守，使之成為了蛋白疫苗的候選目標。9 鐵離子轉運蛋白(Irontransportprotein,PiuAandPiaA)鐵離子在細菌的致病過程中有重要作用，但是,肺炎鏈球菌本身并不產生交換鐵的含鐵細胞。研究與肺炎鏈球菌同源的革蘭氏陰陽菌的基因時發現了ABC三種轉運蛋白的操縱子:Piu.pia.pit,每個操作子分別編碼結合蛋白、透酶、ATP酶。PiuA被研究的比較透徹，它是一種脂蛋白，處在膜外緣，可以結合血紅素和亞血紅素。但是最近研究顯示，高滴度兔抗PiuA和PiaA抗體可以在表面結合，提示這兩種蛋白可能存在于細胞的表面。PiuA和PiaA存在于所有23種型別的菌體中。目前，對

19、于這兩種蛋白作為備選疫苗的研究卜分有限10三種新表面蛋白典型的疫苗抗原是分泌蛋白和表面蛋白。對肺炎鏈球菌N4基因進行全基因序列搜索，以尋找這類蛋白，在2687個潛在開放閱讀框中，發現了110個基因帶有一個或者多個不同模體的表面蛋白，其中108個片段包括97個完整的基因被克隆出來。相應蛋白也被表達或純化,并進行了動物實驗。其中,6蛋白對通過腹腔注射攻擊的小鼠產生保護性作用。包括endo-p-N-acetylglucosaminidase(LytB,SP46),1,4-p-N-acetyimuraminidase(LytC,Sp91)和細胞壁相關絲氨酸蛋白酶(Spl28,Spl30)。這些蛋白在2

20、3個型別的菌體中無論是序列還是抗原性均保守,并且均可以發現于細胞壁和細胞膜，它們可能是好的疫苗備選蛋白，但是還需要做更進一步的研究。11總結21價莢膜多糖疫苗和7價結合疫苗已具有良好保護老人和孩子免受大部分肺炎鏈球菌攻擊的作用，但是由于型別的限制以及可能發生的致病菌株替換，都要求研制新的、保護力更強更廣的蛋白疫苗。由于肺炎鏈球菌致病機理并不是簡單的細胞毒素和細胞溶解，而是極其復雜。從最初鼻咽部的定植到入侵、到發展出癥狀，如中耳炎、腦膜炎、肺炎、菌血癥等,肺炎鏈球菌都是用不同的毒力因子，在不同的階段感染和破壞機體組織，同時逃避機體的免疫機制。這些不同的蛋白刺激機體產生的抗體有不同的保護作用。在所

21、研究的蛋白中，PsaA、PspA、PhtB、PppA、NanA能夠有效清除50%以上鼻內感染。PspA、PhiB蛋白能夠刺激機體產生具有保護作用的抗體，是好的疫苗備選蛋白。幾種蛋白的聯合應用會產生更加強大和復雜的保護作用，如PsaA、Ply、PspA的聯合使用可以在動物模型中產生更加強大的保護作用。如果這些蛋白不能作為疫苗提供有效的保護，它還可以作為一種蛋白載體服務于多糖疫苗，或者作為現在一些疫苗的補充成分,為疫苗中所不能提供保護的型別提供保護。制備蛋白疫苗相對簡單、廉價，又具有保護作用強、保護范圍廣等多糖疫苗所無法比擬的優點，所以，蛋白質疫苗取代多糖和多糖結合疫苗是發展的趨勢°12

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