1、題目：乳酸中嗜鏈球菌分離及鑒 定作者:日期:分類號:2011屆本科生畢業論文題目：乳酸中嗜熱鏈球菌的分離及鑒定Title : Lactic acid streptococcus thermophilus cultured in theseparation and identification系 別：化學與生命科學學院專 業：07級牛物技術學生姓名：邵志國學 號：2007090223指導老師：郭志華職 稱：講師2011年4月17號-16 -目的從乳酸中將嗜熱鏈球菌分離出并進行鑒定。方法利用MRS培養基 將乳酸中的菌種培養，經過革蘭氏染色、鏡檢分離出嗜熱鏈球菌，最后選出7株，對它進行菌落形態的觀察

2、。最后對其進行各種理化鑒定。 結果鏡檢結果該 菌為革蘭氏陽性，經過生化鑒定該菌為嗜熱鏈球菌。關鍵詞：乳酸；嗜熱鏈球菌；分離；鑒定。ABSTRACTobjective the streptococcus thermophiluscultured from lactic acid will isolate and evaluations. method Use the media will lactic acid bacteria MRS cultivation, and after gram's staining, isolated anti-bma streptococcus ther

3、mophilus cultured, finally chosen for it, seven strains colony morphology observation. Finally the various physical and chemical identification. result microscopy results this for gram-positive bacteria, after biochemical identified the bacteria for streptococcus thermophilus cultured.Keywords: lact

4、ic acid; Streptococcus thermophiluscultured; Depart; appraisal目 錄緒論 51試驗材料與方法61.1 試驗材料 61.2 實驗試劑 61.3 實驗方法 61.3.1 乳酸菌的篩選61.3.2 乳酸菌的分離純化 61.4 理化性質的測定 72 結果與討論 82.1 菌落形態和細胞形態 82.2 生化試驗結果 113 小結 12參考文獻 13致謝 14緒論乳酸菌是一類能利用可發酵的糖產生大量乳酸的細菌通稱。這類細菌廣泛分 布在土壤、植物根莖、湖泊及動物的體內。酸菌從形態上可以分為球菌和桿菌， 并且均為革蘭氏染色陽性、在缺少氧氣的環境中生

5、長良好的兼性厭氧性或厭氧性 細菌。目前，對乳酸菌的應用研究，著重于發酵乳制品、發酵食品和醫藥工業等人 類生活密切相關的領域。乳酸是以新鮮牛乳經有效殺菌，用不同乳酸菌發酵劑制 成的乳制品。由于該產品營養價值較高，并能改善腸道正常微生物區系的穩定， 因此它已成為深受消費者青睞的營養保健食品。在我國市場上，生產銷售的各種乳酸制品中，作為發酵劑使用的乳酸菌，通 常為保加利亞乳桿菌和嗜熱鏈球菌。乳酸的生產是利用原始菌種進行逐級擴大培 養方式進行，活化復壯再進行擴大培養至乳酸菌的活力都達到可用程度后，投入生產進行發酵。在發酵劑的活化過程中，工序多，技術要求嚴格，稍有 不甚就會污染雜菌，通過對乳酸發酵劑嗜熱

6、鏈球菌的分離和鑒定能及時掌握研究 進程和生產控制。1實驗材料和方法1.1 材料和儀器乳酸：采購于超市 伊利；化學試劑：均為國產分析純。超凈工作臺、酒精 燈、接種環、滅菌鍋等。1.2 實驗試劑MRS固體培養基：蛋白豚10 g,肉膏10 g,酵母提取物5 g,檸檬酸二俊2 g,乙酸鈉 5 g , KHPO4 2 g, MnSO4.4H2O 0.25 g, MgSO 4.7H2O 0.58g, 葡萄 糖 20g ,吐溫 80 1ml,瓊月旨 25g,水 1000ml。調 PH6.26.4 , 121 C滅菌 15min。PY基礎培養基：蛋白豚0.5 g,酵母提取物1.0 g,鹽溶液4.0 g,蒸儲水

7、100ml。 調PH值6.0左右，113c滅菌20min。蛋白陳水培養基：蛋白陳 5g, Nacl2.5 g,蒸儲水500ml。調ph值7.0左右， 121c 滅菌 20min。葡萄糖蛋白陳水培養基：蛋白陳5g,葡萄糖5g , KHPO4 2g ,蒸儲水1000ml , 調 PH 值 7.07.2 ,過濾，121c 滅菌 30min。明膠基礎培養基：蛋白豚1.0 g,酵母提取物1.0 g,葡萄糖0.1g ,明膠12.0g , 鹽溶液 4.0ml,蒸儲水 100ml, ph 值 7.0,113 C 115 c 滅菌 1520min。可溶性淀粉培養基：向PY培養基中加入0.5%可溶性淀粉。1.3

8、實驗方法1.3.1 乳酸菌的篩選將乳酸均勻涂布于MRSS養基平板上，37c靜置培養48h01.3.2 乳酸菌的分離純化挑取培養基上的菌落，劃線分離純化 23次，最后選擇單菌落，經過鏡檢確認為純種，得到7株菌株，4c斜面保存。將菌落平板和細胞形態在顯微鏡下用 照相機照出。1.4 理化性質的測定1.4.1 KOH 試驗用滅菌的接種環加12環5%勺KOH容液于干凈的載玻片上，調菌于溶液中， 用環將其混合攪勻，短時間內KOH式劑陽性菌會越攪越稠，抬起接種環會產生拉 絲現象，而KOHK性菌則無拉絲現象。1.4.2 過氧化氫酶測定用滅菌的接種環加12環10%i氧化氫溶液于干凈的載玻片上，挑菌于溶液 中，攪

9、拌均勻。觀察產氣泡情況，有氣泡產生，則判斷為過氧化氫酶陽性反應。1.4.3 需氧試驗將分離純化后的各菌株分別接種于高層 MR儆體培養基中，37c靜置培養 2d后，觀察生長情況。1.4.4 淀粉水解試驗將各菌株分別接種到可溶性淀粉培養基中，37c培養12天。然后向培養液 中加入34滴盧戈氏碘液，如不顯色表示淀粉水解陽性反應，顯藍黑色或藍紫色 時，表示淀粉水解或水解不完全，為陰性反應。1.4.5 明膠液化試驗菌株接種后適溫培養，觀察結果時需經低溫處理。如對照管（未接種） 凝固而接種管液化則為陽性反應，同時凝固或者液化為陰性反應。1.4.6 呷咪試驗向培養2d后的含菌蛋白陳水培養基內加34滴乙醴，搖

10、動數次，靜置1min3min,待乙醴上升后，沿管壁徐徐加入 2滴呷咪試劑，在乙醴和培養物之 間產生紅色環狀物為陽性反應，否則為陰性反應。1.4.7 V-P 試驗將各菌株接種于葡萄糖蛋白陳水培養基中，置37c培養2d后，向培養物內加入510滴40%勺KOH然后加入等量的5% a-蔡酚溶液，用力振蕩，再放入 37c溫箱中保溫15min30min,以加快反應速度。若培養物成紅色，則為 V-P反 應陽性。1.4.8 產葡聚糖測試將菌株接種于加有10晚糖的MRS斗面培養基上，適溫培養24d,如斜面培 養物形成粘稠狀菌苔，表明產生葡聚糖，為陽性反應，否則為陰性反應。1.4.9 碳水化合物產酸試驗采用PY基

11、礎培養基，在其中加入碳水化合物，終濃度達到 1%管內培養基 高度約45cm.滅菌后接入菌株各1環，37c培養2d。取未加入碳水化合物的培 養基作為對照，結晶紫試劑比較顏色的變化記錄產酸的強弱。2結果與討論2.1 菌落形態和細胞分離到的7株菌，菌落乳白色、灰色或略顯黃色；大而平坦或小而厚，菌落 濕潤且大及邊緣整齊。鏡檢細胞形態、大小、排列方式及革蘭氏鑒定結果見表一表一 7株菌的形態特征及大小Table 1 7 strains bacteria the morphological characteristics and size染色大小/um形態1G+1.0*(1.0-1.5)橢球單個或呈短鏈2G

12、+1.0*(1.0-1.3)橢球單個或成對或呈矩鏈3G+1.0*(1.0-1.4)橢球單個或呈短鏈4G+1.0*(1.0-1.3)橢球單個或呈短鏈5G+1.0*(1.0-1.4)橢球單個或呈短鏈6G+1.0*(1.0-1.5)橢球單個或呈短鏈7G+1.0*(1.0-1.5)橢球單個或成對或呈矩鏈從表F出，從酸奶中分離出的7株為嗜熱鏈球菌符合乳酸菌的特性。下面附平板和細胞的照片嗜熱鏈球菌的細胞形態Streptococcus thermophilus cultured cell type嗜熱鏈球菌的菌落形態Streptococcus thermophilus cultured colony mor

13、phology2.2 生化試驗檢測結果對篩選的7株菌進行進一步的試驗鑒定結果見表 2、表3。從表2、表3可 見，所有7株菌種都能水解淀粉，KOH式驗、接觸酶試驗、明膠液化試驗、呷咪 試驗均為陰性，但對于多種糖的利用情況不同。表2 7株菌株的生化試驗結果Table 2 7 strains isolated biochemical test result1234567KOH試驗-淀粉水解+接觸酶試驗-需氧試驗好氧好氧兼性厭氧微好氧微好氧微好氧微好氧明膠試驗-呷咪試驗-V-P試驗-+-產葡聚糖-+注：“+”表示陽性反應：“-”表示陰性反應。表3 7株菌的碳水化合物發酵產酸試驗結果Table 3 7

14、strains bacteria carbohydrates ferment produce acid test results合物1234567+麥芽糖+乳糖+-+-+注：“+”表示陽性反應：“-”表示陰性反應小結市售的乳酸中的乳酸菌多為保加利亞乳桿菌和嗜熱鏈球菌其中球菌較少。采用常規的革蘭氏染色、形態觀察的方法對分離到的菌株進行簡單鑒定，該方法操作簡單、快速、實驗結果可靠。分離到的嗜熱乳酸鏈球菌菌株經活化后可以應用 到生產中。參考文獻1陳曉平,劉華英,魏曉川.自然發酵酸菜汁中乳酸菌的分離篩選與鑒定研究J.食品科學.2006(2):91-93.2楊曉暉，籍保平，李博，等.泡菜中優良乳酸菌的分離鑒定及其發酵性能的研究J.食品科學.2005(5):130-133.3黃秀梨.微生物學實驗指導M.北京：高等教育出版社,1999:58-594鄧放明，李羅明，尹華.碎鮮辣椒發酵制品發酵用乳酸菌的選育與接種發酵試驗J.食品科學.2005(3):106-108.5黃君紅，成潔珊，陳青荷.乳酸菌生長最佳培養基的篩選J,中國釀 造.2001(2):9-11.致謝在本論文完成之