1、食品與發酵工業FOODANDFERMENTATIONINDUSTRIES蘇云金芽孢桿菌晶體蛋白的制備方法郭艾英王碩(天津科技大學食品工程與生物技術學院,天津,300222)3摘要采用了2種液體培養基、2種培養條件對3種蘇云金芽孢桿菌進行培養。鏡檢觀察當90%以上的芽孢脫落時處理菌體,經堿液裂解后比較等電點沉淀和高速離心方法提取Bt蛋白的收率和純度。實驗得出,3種菌體在1/2NB培養基,28,200r/min培養3d,蛋白產量均較高,其中HD21型菌株高達107148mg/L。高速離心得到的蛋白收率低于等電點沉淀法,但其純度較高,滿足作為抗原的條件,為ELISA檢測轉基因食品中Bt蛋白奠定了基礎

2、。關鍵詞蘇云金芽孢桿菌,發酵,晶體蛋白,提取,電泳蘇云金芽孢桿菌(Bacillusthuringiensis,Bt)是一類對害蟲毒力強、致死速度快且對害蟲天敵無毒性的昆蟲病原微生物,在菌體的穩定生長期可形成伴胞晶體蛋白(parasporalcrystalprotein),又稱殺蟲晶體蛋白(insecticidalcrystalprotein,ICP)或2內毒素1,2。目前所發現的ICP可毒殺鱗翅目、雙翅目、鞘翅目的害蟲,此外還對膜翅目、同翅目、直翅目毛目的多種害蟲及植物病原線蟲控害作用3,中,Bt植物有煙草、馬鈴薯、甘蔗等,某。然而轉基因產品是否存在生態風險、危害人體健康目前尚未有定論,為滿足

3、廣大消費者的知情權和選擇權,有必要對轉基因食品進行檢測。Bt蛋白的獲得是采用酶聯免疫方法(ELISA)檢測轉Bt基因食品的關鍵環節,國內主要采用堿裂解法提取,該法比國外常用的不連續蔗糖密度梯度離心法簡便,且提取量大5。文中采用2種常規液體培養基、2種培養條件培養菌體,并對經堿液裂解后等電點沉淀和高速離心這2種方法提取蛋白進行了比較,以期為ELISA檢測轉基因食品中Bt蛋白奠定基礎。11211種子培養基LB培養基,NB培養基(g/L):牛肉膏5,蛋白胨10,NaCl10,調pH值712左右112122LB,蛋白胨5,Na2512g/L):牛肉膏215,蛋白胨5,Na2pH值712左右。113培養

4、條件從3種菌株的保藏斜面上分別挑取1環接種于裝50mL種子培養基的三角瓶中,28,150r/min搖床培養過夜。第2天按1%的接菌量轉接發酵培養基,分別按28,150r/min和28,200r/min搖床培養3d,鏡檢觀察90%以上的芽孢脫落時停止培養。1.4Bt蛋白的提取11411菌體的堿液裂解將發酵液于4500r/min,4離心20min,沉淀用含011%TritonX2100的生理鹽水洗滌,4500r/min,4離心后用無菌水洗滌3次,于4500r/min,4離心20min離心后沉淀溶于50mmol/LNa2CO3緩沖液(含1%22巰基乙醇,pH916),搖勻后于4放置2h。11412高

5、速離心法提取蛋白1材料和方法111材料取1/2菌懸液于18000r/min,4離心30min,除去菌體和其他不溶性碎片,取上清液得Bt蛋白溶液,置-20保存備用。11413等電點沉淀法提取Bt蛋白取1/2菌懸液于4500r/min,4離心30min,上清液用4mol/L乙酸鈉2乙酸溶液(pH410)調pH達510左右,4沉淀4h后于12000r/min,4離心菌種:蘇云金芽孢桿菌(Bacillusthuringiensis)HD21,HD22和HD273菌株,南開大學保藏菌種。112培養基第一作者:碩士研究生。32005年中國工業微生物研討會獲獎論文收稿日期:2005-04-238研究報告30

6、min,沉淀用無菌水洗滌數次后溶于20mmol/LTris,pH916的緩沖液中,置-20保存備用5,6。115蛋白質濃度的測定晶體蛋白質濃度的測定采用Lowry法7。116SDS2聚丙烯酰胺凝膠電泳采用恒流的方式將得到的Bt蛋白進行SDS2聚丙烯酰胺凝膠電泳。10%的分離膠,319%的堆積膠,10mA保持20min后加大電流至30mA,當染料的前沿遷移至凝膠的底部時結束。考馬斯亮藍染色10min,經脫色后觀察。在芽孢旁形成菱形或雙錐形的伴胞晶體,它們具有殺蟲活性。對菌體饑餓培養有利于芽孢和伴胞晶體的生成。根據此特性,選用LB和NB培養基作為種子培養基得到更多有活性的菌體,1/2LB和1/2N

7、B培養基作為發酵培養基對該菌進行饑餓培養,使其利于芽孢和伴胞晶體的生成。21112搖床轉速對Bt菌生長的影響蘇云金芽孢桿菌是好氧菌,培養該菌要有足夠的氧氣來滿足它們的需要,所以培養基中的溶氧量越多越利于菌體的生長。增大搖床的轉速可以增加培養基中的溶氧量,從而促進菌體的生長,縮短培養時間。3種Bt菌株在相同的溫度下,分別在1/2LB、1/2NB培養基和不同轉速下生長3d,鏡檢觀察的情況如表1所示。2結果與討論211培養基和搖床轉速對Bt菌生長的影響21111培養基對Bt菌生長的影響蘇云金芽孢桿菌在生長的穩定期生成芽孢,同時表11/2LB,28,150r/minHD21HD22HD2731/2LB

8、,28,200r/min1/2NB,200r/min較多的芽孢,少量的晶體蛋白較多量的芽孢,部分伴胞晶體出現,較多的芽孢脫落,蛋白產生,芽孢脫落,較多的晶體蛋白產生較多的芽孢脫落,大量的晶體蛋白產生,少數晶體蛋白溶出大量芽孢脫落,大量晶體蛋白產生大量的芽孢脫落,部分晶體已溶出根據表1,速下,3種Bt1/2NB培養基上的生長周期較1/2LB培養基短,且HD21和HD273生長速度較快;用Lowry法檢測等電點沉淀和高速離心2種方法提取的Bt蛋白含量,以小牛血清蛋白(BSA)作為標準物質做標準曲線,計算蛋白質產量,所得標準曲線見圖1。在相同的培養基和培養溫度下,搖床轉速為150r/min時,菌體生

9、長緩慢,要使90%的芽孢脫落,產生更多的伴胞晶體則需要超過72h的培養時間。212Bt蛋白的提取21211堿裂解法蘇云金芽孢桿菌產生的伴胞晶體是一種堿溶性蛋白,由cry基因和cyt基因所編碼。在pH值高于915時大多數的cry毒素和cyt毒素溶解,少數需要在pH12時才能完全溶解。因此選用了pH916的Na2CO3緩沖液保證大多數的蛋白從菌體中溶出。21212提取方法的影響圖1BSA吸收標準曲線根據回歸方程計算出從每升發酵液中得到的晶體蛋白產量,數據結果見表2。表2兩種蛋白提取方法所得蛋白產量mg/L提取方法1/2LB,150r/min1/2LB,200r/min1/2NB,150r/min1

10、/2NB,200r/min等沉HD21等沉HD22等沉HD273離心HD21離心HD22離心HD2739食品與發酵工業FOODANDFERMENTATIONINDUSTRIES由此可見,當采用等電點沉淀處理堿裂解液時,3種菌所得蛋白產率均較高,約是高速離心法的2倍,這是因為調裂解液pH值為510時,在此等電點范圍內的蛋白質都會沉淀下來;3種菌在1/2NB培養基種培養得到蛋白的量高于1/2LB培養基,這與牛肉膏和酵母膏的組成成分有關;搖床的轉速對蛋白質的產量也有一定的影響,但對1/2NB培養基影響較小。總的來說,HD21型菌株蛋白產量高于HD22和HD273型,最高產量達107148mg/L。而

11、HD273型菌株蛋白最高產量達101168mg/L,高于采用ZM培養基培養38h的產量(大約70mg/L)4。213Bt蛋白的分子量和純度SDS2聚丙烯酰胺凝膠電泳是對蛋白質進行量條蛋白帶,等沉HD273還存在有較多的雜質蛋白帶,而高速離心方法得到的蛋白條帶比較單一均在130kD左右。由此我們可以利用離心得到的蛋白作為抗原進行免疫大白兔獲得多克隆抗體。3結論蘇云金芽孢桿菌的發酵周期、晶體蛋白的產量與培養溫度、時間、搖床的轉速有很大關系,實驗中發現,選用1/2NB培養基,28,200r/min培養3d,90%以上的芽孢都已脫落,部分伴胞晶體溶出;在蛋白質提取方面,等電點沉淀或高速離心提取Bt蛋白

12、均能得到較高的收率,其中HD21型菌株產量最高;雖然采用高速離心的方法得到蛋白收率低于等電點沉淀,但它不僅簡化了實驗操作程序、耗時短,而且其純度較高。Bt蛋。:、蔡俊博士;感。參考文獻化,比較及特性鑒定的一種方法。在電泳最初時間里選用10mA的小電流可使Bt蛋白在進入分離膠之前得到很好的濃縮。對每種培養條件下得到的蛋白進行電泳檢測,結果見圖2。圖210%SDS2聚丙烯凝膠電泳圖16依次為:等沉HD273、等沉HD22、等沉HD21、離心HD273、離心HD22、離心HD21所得到的蛋白從圖2可以看到,3種蘇云金芽孢桿菌的蛋白電泳后主要蛋白帶均在130kD左右,其中3種菌在采用等電點沉淀方法提取

13、的蛋白在66kD左右都有11羅志軍1Bt毒蛋白基因工程研究進展J1重慶師專學報,2000(2):89912李雪雁,李照會,許維岸1蘇云金芽孢桿菌cry基因研究進展J1昆蟲知識,2003,40(1):9133SchnepeE,CrickmoreN,VanRJ,MicroBiolMolBio.Rev,1998,62(3):7758064LereclusD1OverproductionofencapsulatedinsecticidalcrystalproteinsinaBacillusthuringiensisspoOAmutantJ1Bio/Technol,1995(13):67715左雅慧,丁

14、之銓,張杰1蘇云金芽孢桿菌培養條件及晶體蛋白提純方法初探J1植物保護,1999(4):32346戴經元,軒海連,孫明1用血清學方法測定蘇云金芽孢桿菌晶體蛋白含量J1中國生物防治,1996,12(4):1781817JohnMWalker1TheproteinprotocolshandbookM1HumanPress,2002179ExtractionofCrystalProteinfromBacillusthuringiensisGuoAiyingWangShuo(FacultyofBiotechnology,TianjinUniversityofScienceandTechnology,Ti

15、anjin,300222,China)ABSTRACTThreespeciesofBacillusthuringiensiswereculturedattwoconditionsbytwokindsofmedium.Thethalluswasinitiallytreatedwithlysiswhen90%ofsporesleftcells,andthenwastreatedbyisoelectricpointdepositionandhigh2speedcentrifugationrespectively1ResultindicatedthattheyieldofBtproteinwasveryhighwhenthethreespecieswerefermentedin1/2NBmedium,28,200r/minfor3days,especiallyforHD21,amountto107148mg/L1AlthoughthequantityofBtproteinfromhigh2speedcentrifugationwaslowerthanthatfromiso2el