1、碳酸鈣生物礦化的體外研究進展馮慶玲，侯文濤（清華大學 材料科學與工程系，北京100084）摘 要：研究生物礦化的機理，可以為仿生制備新材料提供理論依據和合成手段，而碳酸鈣是生物礦化的主要無機體系之一。本文首先綜述了近年來碳酸鈣體外研究中的一些重要結果，這些研究主要是使用不同的添加劑和模板調控碳酸鈣的晶型與形貌，對于有機無機界面誘導礦化的機理進行了進一步的驗證和更為深入的探討。然后介紹了一些最新的研究熱點，這些研究采用了較為新穎的研究方法和思路，為碳酸鈣生物礦化的研究提供了一些新的方向。關鍵詞：仿生材料；碳酸鈣；生物礦化中圖分類號: Q 811生物礦化過程廣泛存在于自然界中，是生命參與并通過細胞

2、、有機分子調制無機礦物沉積的高度控制過程。與合成材料相比，天然生物礦化材料具有特殊的高級結構和組裝方式，揭示其控制機理，可以為材料科學相似的控制問題提供思路，為材料合成提供新的理論指導和設計依據。碳酸鈣作為生物礦化的最主要的礦物之一，長期以來一直是材料學家、生物學家、礦物學家、醫學家所關注的研究對象。碳酸鈣具有多種晶型，比較穩定的有方解石和文石，在生物界中主要存在于軟體動物的外殼、鳥類的蛋殼當中；另外，還有球文石（介穩相）、無定型碳酸鈣（ACC）等晶型。研究者最為關注的問題就是生物體是怎樣通過蛋白質達到調控方解石/文石晶型，怎樣控制生長出復雜的微結構的。由于碳酸鈣晶體在礦物學和化學領域中具有較

3、深的研究基礎，并表現出良好的取向性和晶粒外形，因此也廣泛用于進行體外沉積，以探討“有機無機”界面的負電性、結構匹配等誘導作用。1 使用不同添加劑和模板的體外沉積實驗這類研究的目的主要在于分析有機的添加劑或模板對于碳酸鈣晶型、生長形貌的影響作用，通過機理討論以推測或者驗證有機無機的界面相互作用。沉積時可以通過滴定的方法，也可以通過擴散的方法提供碳酸根，使得溶液中的Ca2+CO32-活度積達到過飽和，導致碳酸鈣晶體的形核長大。按照添加劑和模板的不同，大致分為以下幾個類別。1.1 Mg2離子作為添加劑由于海水中含有0.13%質量的鎂，很早之前人們就在對海洋生物礦化的研究中發現了鎂離子對碳酸鈣晶體沉積

4、的影響。鎂離子可以替換方解石中的鈣離子位置，但卻無法進入文石晶體的晶格。當溶液中鎂離子含量較高時，這種作用可以抑止方解石晶核的形成而促使文石的晶核得以長大，達到調控晶型的目的1。因此在一些模擬生物體調控文石晶型的實驗中，也會采用鎂離子來誘導文石的生成2。鎂離子還可以穩定無定型碳酸鈣。Raz等人3研究了海膽幼體骨針中ACC過渡相，發現在沒有鎂離子時只有方解石相，而其中的蛋白質大分子不能誘導出ACC，這就說明鎂離子在對無定型相的穩定中起著重要作用，而含鎂量很高的方解石是通過含鎂無定型相的晶型轉變形成的。Meldrum等人4也發現了鎂離子結合在ACC中很大程度延緩了其向晶體相的轉變，這一影響隨結合在

5、ACC中的鎂離子含量增加而增大。在生物體系中，鎂與有機基質的共同作用對穩定ACC起到了重要的作用，含鎂的ACC在長時間內是穩定的，可以在結晶化之前預造出理想的微結構和形狀5,6。1.2 酸性氨基酸或表面活性劑作為添加劑酸性氨基酸由于側鏈帶負電，可以吸引游離的或者是晶體表面的Ca2離子，從而改變碳酸鈣的結晶過程7。Tong等人8使用左旋天冬氨酸調制出了多孔的球文石晶體，分析認為天冬氨酸與碳酸鈣表面有著強烈的吸附作用，這種吸附作用抑制了方解石的形成，導致多孔結構的球文石晶相。Manoli等人9研究了谷氨酸對碳酸鈣結晶的影響，認為其穩定了球文石晶型。表面活性劑在溶液中或界面處具有特殊的自組裝形態，因

6、此會影響沉積過程，使得無機晶體具有特殊的形貌。使用表面活性劑作為添加劑研究碳酸鈣沉積的工作近年來剛剛展開，Li等人10制得了活性劑致穩的ACC納米顆粒，這些幾十納米的顆粒在水溶液中可以轉變為球文石的粒狀或棒狀顆粒（圖1），而晶粒的外型可以通過調節Ca濃度、活性劑的濃度而達到。Donners等人11使用了另一種表面活性劑制得了ACC，并在幾天后外部轉變為方解石晶體。由于表面活性劑自組裝形態的多樣化，利用其控制碳酸鈣的晶型和形貌也具有多樣化的特點，這些工作有廣泛的研究前景。圖1 活性劑導致的球文石納米顆粒10 (a) 粒狀；(b)棒狀1.3生物中提取的大分子作為模板或添加劑(體外模擬礦化)碳酸鈣的

7、體外模擬礦化研究主要基于軟體動物殼系統。通過對殼層中有機質的提取，在體外環境中模擬貝類的體內微環境進行碳酸鈣的沉積實驗，以期了解是何種因素導致了方解石/文石的晶型選擇。Levi等人12在2001年對傳統的有機基質五層結構做了修正，發現類絲纖蛋白在晶體形成前是以膠體形態存在于層間的（圖2）。這對未來的體外模擬實驗設計提出了新的思路和要求。圖2 貝殼有機基質在晶體形成前的分布狀態12Thompson等人14通過原子力顯微鏡觀察到了在珍珠層蛋白存在時方解石的104面上會生長出(001)的文石晶體。Marxen15等人通過鈣同位素在淡水蝸牛殼SM和IM表面的吸附發現，弱堿性條件下鈣離子的吸附強于弱酸性

8、條件，在使用類似外套膜溶液的環境下，鈣離子在SM表面發生了更強烈的吸附作用。一些研究者主要采用生物化學的方法，用SDS-Page凝膠電泳分離珍珠層中的蛋白13，得到不同分子質量的可溶性蛋白，并且通過沉積實驗發現某些組分可以特異性的誘導出文石晶體。Zhang等人16通過克隆分析珍珠牡蠣的一種特定分子量的SM，發現其具有類似表面活性劑的特征，中部為甘氨酸富集區，一端為親水段，另一端為中性端，這樣自組裝以后就可以形成周期性的結構誘導無機晶體的生成。這些結果都證明了酸性大分子在決定碳酸鈣晶體的晶型和取向上具有重要作用，而且其原因在于酸性大分子中具有很多的天冬氨酸和谷氨酸序列，其二級結構為反折疊片，這樣

9、在酸性大分子的表面，就會分布著較多的酸性側鏈-COO，由于負電荷可以吸引鈣離子。這種周期性的結構便會導致晶體的生成。1.4非生物提取大分子作為添加劑使用人工合成的大分子對于碳酸鈣晶體進行調控的實驗，基本上都是受上節提到的控制機理的啟發。模仿生物體中的結構匹配原理，采用具有特殊的周期性結構的大分子，期望可以通過人為的方式從理論上預測并從實驗上獲得想要得到的晶型或者晶體取向，真正達到控制的目的。Gower等人17使用聚天冬氨酸沉積出了表面具有螺旋狀坑洞的方解石，以及中空螺旋狀形貌的球文石，在更高的聚天冬氨酸濃度下還可以在玻璃基底上形成膜層。分析認為這種形貌是由于晶核在溶液中沿著聚天冬氨酸表面形成并

10、長大導致的。Falini18，19使用了含有聚天冬氨酸和聚谷氨酸的凝膠作為模板，通過改變凝膠中聚合物的含量，分別誘導出了具有一定取向的方解石、文石和球文石晶型，證明了微環境對決定晶體的晶型有著重要的作用。Kato等人2，20使用幾丁質作為基底，類似酸性大分子的聚丙稀酸作為添加劑，也得到了文石薄膜。目前此類研究中并無非常理想的晶型控制結果。2 近期研究熱點前面介紹的研究屬于比較傳統的體外研究范疇。近幾年來，出現了一些較為新穎的研究角度和方法，并獲得了很好的實驗結果。2.1微印法實現結晶位點控制在體外模擬實驗中，研究者關注的主要是晶體晶型和形貌的變化，而使用微印法 21,22控制固體表面的碳酸鈣形

11、成位點、大小、取向的研究則更偏重于工藝，為界面誘導控制提供了一個新的思路。Aizenberg等人23,24所使用的膠印是使用具有微米圖案結構的橡膠印，用特制的“墨水”例如HS(CH2)nX (X=COOH， SO3H， OH)，在基底上進行微接觸印制以后，含硫的一端會連接在基底上，露出X基團，而未接觸的部分需要用HS(CH2)nCH3清洗而露出甲基基團，這樣的表面倒置于碳酸鈣過飽和溶液中時，由于X基團對于鈣離子的吸附、形核誘導作用，刻印過的部分會生長出晶體而其他部分則沒有。如圖3，實驗中如果選用不同的基底和墨水，可以得到取向不同的方解石晶體；使用不同的圖案的橡膠印也可以得到不同的結晶圖案；使用

12、不同的鈣離子濃度，則可以控制晶粒的數量和大小。圖3 使用花樣橡膠模板印制后沉積的方解石晶體圖案24 (a)單晶粒點陣；(b)多晶粒構成的花樣DSouza等人25使用的是另一種制印方法，首先在方解石或者文石的模板晶表面通過自組裝形成膜層，然后使用交聯劑將膜固定在聚合物上，通過酸溶除去模板晶體就得到了刻印面，刻印面置于碳酸鈣過飽和溶液時就會在表面形核并長大為晶體。形成晶體的位置、大小等在很大程度上與模板晶類似。2.2 使用AFM研究方解石在過飽和溶液中的生長原子力顯微鏡(Atomic Force Microscopy，AFM)的優勢在于可以掃描得到樣品表面的細微起伏信息，其精確度可以達到原子高度。

13、方解石表面的溶解和沉積微觀信息就可以通過AFM的實時掃描被觀察到。Teng等人26,27的研究發現，當臺階的產生和推移以一個螺位錯為中心時，就會生長為一個螺旋生長小丘。當一個螺旋位錯點開始螺旋生長時，其它的步階因為超過了臨界長度而開始向外生長，這些步階的生長又導致原來沒達到臨界長度的步階突破生長臨界值。因此步階的生長形成了一個循環促進的方式，使得在104面上的臺階沿著48+、48和41+、41四個易生長方向生長，形成一個類金字塔形的螺旋小丘（圖4a）。當飽和生長溶液中有Mg2+或者有機添加劑時，晶體螺旋生長的形態就會有所改變28，如圖4b。而分別使用左旋和右旋天冬氨酸時(圖4c&d)，

14、得到的形貌也具有鏡面對稱性，分析認為天冬氨酸在步階負方向的特異性吸附改變了臺階邊緣自由能，從而導致了步階方向、推移速率的變化并最終造成了小丘外形的變化。另外，Tang等人29也使用類似的方法，對檸檬酸存在時的方解石表面螺旋生長進行了觀察，發現檸檬酸改變了螺旋生長的臨界長度，延遲了步階的生長。圖4 方解石表面螺旋生長的AFM觀察27，28 (a) 螺旋生長小丘；(b) 鎂離子存在時的小丘；(c) 左旋天冬氨酸存在時的小丘；(d) 右旋天冬氨酸存在時的小丘這些研究通過對螺旋生長的動力學分析和計算，可以一定程度上將添加劑對碳酸鈣晶體的界面作用進行量化表征。如果這種分析方法可以大量應用于有機無機界面作

15、用分析，積累足夠的數據，必會大大促進礦化理論的完善，并為晶體控制提供可能的手段。2.3 生物礦化的相轉變機理生物礦化的傳統觀點認為控制的主要因素在于有機無機的界面作用，貝殼殼層中的文石晶體是通過 “異型形核”或者“礦物橋”得到的。前者認為，每個晶片都是由有機質誘導形核長大的，而后者認為層間基質中的孔洞使得晶片之間存在著物理上的連續生長。但是近期一些實驗證據和研究焦點開始傾向于“相轉變”理論。這些研究認為，殼層中的碳酸鈣晶體并不是直接形成的，而是通過無定型碳酸鈣作為前驅體，經過一段時間的相轉變后才形成晶體。Hasse等人30與Weiss等人31通過對不同種類的幼生貝殼的研究發現，不論是棱柱層還是

16、珍珠層當中都含有較多ACC相，而ACC在成年貝殼中含量很少，因此認為貝殼中的方解石或者文石相都是由ACC轉變得到的。ACC在生物礦化過程中所起的作用，可能會比界面作用更為重要。Nassif等人32最近通過TEM高分辨相觀察，發現貝殼珍珠層的文石板片邊緣部分都存在著ACC相（圖5），很可能是在發生ACC文石相轉變過程后殘留下來的，這為上述觀點提供了新的實驗依據。圖5 珍珠層中文石板片邊緣處的ACC相32結合1.1節中的一些研究結果，鎂離子和有機基質在礦化過程中，可能穩定ACC相并減緩其向方解石或者文石相轉變的過程，之后通過一定的規律決定晶相轉變后的晶體取向。這與現有的異型形核、礦物橋理論是不同的

17、思路。可以預見，相轉變理論將會引起研究者們的更多關注，ACC在礦化過程中的作用和機理的論文，也會逐漸增多。3 展望以碳酸鈣為代表的生物礦化機理研究的進展（界面誘導機理、自組裝機理等），常會給材料學家以啟發，提供一些可能的新材料合成思路。例如，A. Sellinger等人33模仿珍珠層的微組裝過程，使用硅酸溶液、表面活性劑和有機單體，通過預組裝的有機微泡先驅體，形成了有機無機復合的納米涂層。隨著人們對礦化機理的進一步研究，對礦化過程的更深入理解，必然使得體外實驗的類型從“模擬并分析機理”轉向“理論預測并驗證結果”，這樣的實驗將產生更多的具有潛在應用價值的新材料和新方法。在結構仿生、過程仿生、功能

18、仿生等思路引導下，新進展可以在新型結構材料和功能材料等各方面得到廣泛應用。參 考 文 獻 (References)1 Mann S. Biomineralization: Principles and Concepts in Bioinorganic Materials ChemistryM. New York: Oxford University Press, Inc., 2001.2 Sugawara A, Kato T. Aragonite CaCO3 thin-film formation by cooperation of Mg2+ and organic polymer matri

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