1、影響禽流感血凝-血凝抑制試驗(yàn)的主要因素鐘蘊(yùn)珠，肖國雄（梅縣動(dòng)物衛(wèi)生監(jiān)督所，廣東梅縣514700）摘要：禽流感血凝-血我抑制試臉因其具有簡便、快速、準(zhǔn)確、實(shí)用的特點(diǎn)，在縣級獸醫(yī)實(shí)驗(yàn)室被廣泛應(yīng)用.但在試驗(yàn)過程中，人為因素的影響很大，常常因?yàn)椴僮鞑灰?guī)范等，導(dǎo)致試驗(yàn)結(jié)果不準(zhǔn)確，甚至失敗.關(guān)鍵詞：禽流感；血凝；血凝抑制；影響因素中圖分類號：S852.4'5文獻(xiàn)標(biāo)識碼：A文章編號：1005-8567（2013）06-0050-02禽流感血凝-血凝抑制試驗(yàn)是目前WHO和0IE進(jìn)行全球流感監(jiān)測所普遍使用的試驗(yàn)方法，可用于禽流感亞型抗體水平的檢測和流感分離株HA亞型鑒定。該試驗(yàn)因其具有簡便、快速、準(zhǔn)確、

2、實(shí)用的特點(diǎn)，在縣級獸醫(yī)實(shí)驗(yàn)室被廣泛應(yīng)用于禽流感亞型抗體水平的檢測。但在試驗(yàn)過程中，人為因素的影響很大，常常因?yàn)椴僮鞑灰?guī)范等，導(dǎo)致試驗(yàn)結(jié)果不準(zhǔn)確，甚至失敗。現(xiàn)就試驗(yàn)過程中常見的幾個(gè)主要問題總結(jié)如下。1試劑問題PBS的PH值試驗(yàn)用的pH7.2、0.01mol/LPBS應(yīng)按要求配制、調(diào)好pH值。pH值偏酸，易使紅細(xì)胞自凝，偏堿則易使凝集的紅細(xì)胞洗脫加快，從而影響試驗(yàn)結(jié)果的判定。1.1 1%紅細(xì)胞懸液的制備由于不同個(gè)體雞只紅細(xì)胞對病毒的敏感性不同而影響血凝抑制（HD效價(jià)，所以一般采用3只以上健康公雞的紅細(xì)胞混合使用，最好選用非免疫公雞。如果選用免疫公雞代替，則需增加洗滌次數(shù)和時(shí)間。在最后定容時(shí)，離心時(shí)

3、間要超過15min,以便壓實(shí)紅細(xì)胞泥、準(zhǔn)確讀數(shù)。一般紅細(xì)胞濃度偏低,HI滴度下降；紅細(xì)胞濃度偏高,HI滴度上升。1.2 4個(gè)血凝單位（HAU）抗原的配制4個(gè)血凝單位（HAC）抗原需現(xiàn)配現(xiàn)用。工作抗原效價(jià)的測定至關(guān)重要，抗原效價(jià)過高過低都對試驗(yàn)結(jié)果有著很大的影響。效價(jià)過高，則HI滴度偏低;效價(jià)過低，則H1滴度偏高。為保證4個(gè)血凝單位抗原的配制準(zhǔn)確無誤，必須做抗原回歸試驗(yàn)：在微量反應(yīng)板的1-4孔均加入0.025mLPBS；取4HAU混勻的抗原液0.025mL加入到第1孔中，混勻，然后倍比稀釋到第4孔，從第4孔中吸取0.025mL棄之：每孔均加入0.025mL1%雞紅細(xì)胞懸液。振蕩混勻,室溫下靜置約

4、40min后觀察結(jié)果一若前2孔完全凝集（第2孔為完全凝集的終點(diǎn)），則視為抗原配置正確（見圖1）。圖14HAU抗原回歸試驗(yàn)2非特異性凝集因子在進(jìn)行鴨、鵝等水禽的禽流感抗體檢測時(shí)，若使用雞而非相應(yīng)的鴨或鵝的紅細(xì)胞懸液，則水禽血清中可能存在的，對雞紅細(xì)胞有非特異性糅集作用的因子，使試驗(yàn)出現(xiàn)雞紅細(xì)胞不流淌或流淌不完全（非特異性凝集的滴度多集中在（1-3）log2,個(gè)別甚至達(dá)到61og2）,嚴(yán)重干擾了結(jié)果的判定（見圖2）。因此,最好采用與被檢血清同種禽類的紅細(xì)胞來進(jìn)行抗體效價(jià)的檢測。若無同類水禽紅細(xì)胞，則可用雞紅細(xì)胞吸附法對水禽血清進(jìn)行處理，以除去非特異性凝集素。處理方法為：每圖2非特異性凝集現(xiàn)象圖2非

5、特異性凝集現(xiàn)象0.5mL的血清中加入0.025mL的雞紅細(xì)胞，輕搖后靜置至少30min；800r/min離心約25min,收集上清液即為處理后的血清。3微量反應(yīng)板的清洗反應(yīng)板不潔凈、不光滑，都會(huì)直接影響試驗(yàn)的結(jié)果。使用過的反應(yīng)板先用流水沖凈孔中的反應(yīng)物,然后浸泡在清潔液中(新反應(yīng)板可直接放入清潔液中浸泡)，24h后取出，用流水沖洗干凈后，再在蒸飼水中沖洗1遍，甩干，擺放在恒溫箱中，70°C以下烤干備用。4環(huán)境溫度的控制試驗(yàn)感作溫度，從4C到37C,隨著溫度上升，HA與HI滴度上升，但在37.C時(shí)，凝集的紅細(xì)胞容易洗脫,4.C紅細(xì)胞易產(chǎn)生自凝。溫度過高，試驗(yàn)結(jié)果出現(xiàn)快，但凝集解脫也快，

6、使整個(gè)反應(yīng)板凝集現(xiàn)象消失：溫度過低，則試驗(yàn)結(jié)果出現(xiàn)慢。故試凝環(huán)境溫度應(yīng)按規(guī)范要求控制在室溫2025,Co5其它應(yīng)注意的問題5.1加樣時(shí)應(yīng)細(xì)致認(rèn)真，避免樣品、試劑加在孔壁上或?yàn)R出板孔:移液器吸頭應(yīng)垂直加入液體，要保持吸頭管嘴與凝集板孔間的距離，不能與孔內(nèi)液面接觸，以免產(chǎn)生污染。5.2稀釋血清時(shí)，速度不能過快，吸頭不要離開液面，以免產(chǎn)生氣泡，造成移液量不準(zhǔn)確，影響試驗(yàn)結(jié)果。5.3病毒懸液和紅細(xì)胞懸液如沒有搖勻，加入時(shí)濃度高低不一，會(huì)人為造成誤差。因此，抗原和紅細(xì)胞使用前-定要搖勻，保證每一孔中加入的濃度準(zhǔn)確一致。紅細(xì)胞懸液應(yīng)輕輕慢搖，避免劇烈搖動(dòng)，以免造成紅細(xì)胞破裂。試驗(yàn)操作中不僅要嚴(yán)格按照規(guī)定的

7、操作方法操作、細(xì)致耐心，更要在一些操作技巧和熟練程度上下功夫，同時(shí)綜合考慮各方面的因素，發(fā)現(xiàn)問題及時(shí)糾正處理，這樣才會(huì)獲得滿意的試驗(yàn)結(jié)果。(上接第47頁)檢測與分析。4討論豬場可結(jié)合豬瘟抗體檢測報(bào)告，選擇適合自己豬場使用的疫苗。超前免疫后應(yīng)在6070日齡時(shí)加強(qiáng)接種1次。豬瘟病毒嚴(yán)重污染地區(qū)還應(yīng)在25-30H齡時(shí)再接種1次。定期檢查并淘汰帶豬痕野毒的母豬，對于豬瘟的防控至關(guān)重要。這樣的母豬不僅會(huì)使胚胎期或出生前仔豬感染豬瘟病毒而致免疫失敗，同時(shí)又是豬群持續(xù)發(fā)生非典型性豬瘟的根源，其后患無窮，必須給予高度重視。為了便于管理，可使用白天分娩技術(shù)。建議經(jīng)產(chǎn)母豬在預(yù)產(chǎn)期前23天的早上68時(shí)，每頭母豬肌注氯前列烯醇0.2mg來調(diào)控母豬于白天分娩，有利于仔豬的豬瘟超前免疫,減少超前免疫失敗的兒率。但要注意母豬的預(yù)產(chǎn)期推算-淀要準(zhǔn)確。參考文獻(xiàn)：1 程鐵城.規(guī)模化豬場消滅豬瘟的措施LH.北京農(nóng)學(xué)院學(xué)報(bào)，1993,8(2):