1、HPVHPV基因分型檢基因分型檢測及臨床意義測及臨床意義主講者：蘇桂華 人類乳頭瘤病毒（人類乳頭瘤病毒（Human PapillomaHuman Papilloma virus virus，簡稱簡稱HPVHPV）是一種嗜上皮性病毒，有高度的）是一種嗜上皮性病毒，有高度的特異性。長期以來，已知特異性。長期以來，已知HPVHPV可引起人類良可引起人類良性的腫瘤和疣，如生長在生殖器官附近皮膚性的腫瘤和疣，如生長在生殖器官附近皮膚和粘膜上的人類尋常疣、尖銳濕疣以及生長和粘膜上的人類尋常疣、尖銳濕疣以及生長在粘膜上的乳頭狀瘤。像乙肝病毒一樣，在粘膜上的乳頭狀瘤。像乙肝病毒一樣，HPVHPV也是一種也是一

2、種DNADNA病毒。病毒。 HPV是一種性傳播微生物。它能通過皮膚或黏是一種性傳播微生物。它能通過皮膚或黏膜的微小損傷，進(jìn)入接觸者的皮膚黏膜，膜的微小損傷，進(jìn)入接觸者的皮膚黏膜，HPV刺激表皮基底細(xì)胞，產(chǎn)生分裂，使表皮產(chǎn)生增刺激表皮基底細(xì)胞，產(chǎn)生分裂，使表皮產(chǎn)生增殖性損害。在殖性損害。在1954年，年，HPV便被證實是性傳便被證實是性傳播疾病的病原之一，與泌尿生殖系尖銳濕疣有播疾病的病原之一，與泌尿生殖系尖銳濕疣有關(guān)，并具有傳染性。關(guān)，并具有傳染性。 HPV引起宮頸癌的機(jī)制復(fù)雜。病毒引起宮頸癌的機(jī)制復(fù)雜。病毒DNA與宿與宿主染色體的整合，主染色體的整合，HPV E6、E7蛋白的異常表蛋白的異常

3、表達(dá)，以及癌基因、端粒酶等都參與其中。達(dá)，以及癌基因、端粒酶等都參與其中。p HPV HPV感染有高危型和低危型。所謂的高危感染有高危型和低危型。所謂的高危型就是說這種人比較容易導(dǎo)致宮頸癌。如果感型就是說這種人比較容易導(dǎo)致宮頸癌。如果感染的是低危型的染的是低危型的HPVHPV，將來可能導(dǎo)致宮頸癌前，將來可能導(dǎo)致宮頸癌前病變，或者尖銳濕疣這一類病變的可能性比較病變，或者尖銳濕疣這一類病變的可能性比較大 ， 導(dǎo) 致 癌 的 可 能 性 相 對 小 一 些 。大 ， 導(dǎo) 致 癌 的 可 能 性 相 對 小 一 些 。p 根據(jù)致病力強(qiáng)弱，根據(jù)致病力強(qiáng)弱，HPVHPV被分為高危型和低被分為高危型和低危型

4、兩種，危型兩種，“是否能致癌是否能致癌”是危險度大小的主是危險度大小的主要標(biāo)志。國際癌癥研究協(xié)會（要標(biāo)志。國際癌癥研究協(xié)會（IARCIARC）資料表明，）資料表明，1313種低危型種低危型HPVHPV主要引起生殖道、肛門周圍皮主要引起生殖道、肛門周圍皮膚等濕疣類病和低度子宮頸上皮內(nèi)瘤變；膚等濕疣類病和低度子宮頸上皮內(nèi)瘤變；1515種種高危型高危型HPVHPV，尤其是，尤其是1616和和1818型，主要導(dǎo)致高度型，主要導(dǎo)致高度子 宮 頸 上 皮 內(nèi) 瘤 變 和 宮 頸 癌 的 發(fā) 生 。子 宮 頸 上 皮 內(nèi) 瘤 變 和 宮 頸 癌 的 發(fā) 生 。 按感染部位分類按感染部位分類上皮型上皮型 HP

5、V1,5,8,14,20,21,25,47型 黏膜型黏膜型 HPV6,11,16,18,31,33,35,39, 41,45,51,52,56,58,59,68,70型 按發(fā)癌性分類按發(fā)癌性分類低危險群 HPV6,11,41,42,43,44型 高危險群 HPV16,18,31,33,35,39,45, 51,52,56,58,59,68,70型 目前，PCR實驗室采用 來檢測HPV分離法分離法檢測分離法檢測HPV的主要原理的主要原理 利用細(xì)胞裂解液使細(xì)胞膜破裂，利用細(xì)胞裂解液使細(xì)胞膜破裂，染色體染色體DNA和蛋白質(zhì)變性，再利用和蛋白質(zhì)變性，再利用某些有機(jī)溶劑抽提取使核酸分離或某些有機(jī)溶劑抽提

6、取使核酸分離或使核酸吸附于某些顆粒表面，再進(jìn)使核酸吸附于某些顆粒表面，再進(jìn)行 沉 淀 ， 從 而 獲 取 核 酸 。行 沉 淀 ， 從 而 獲 取 核 酸 。樣本要求樣本要求下生殖道分泌物、下生殖道分泌物、宮頸脫落細(xì)胞等樣本宮頸脫落細(xì)胞等樣本實驗過程應(yīng)穿著專用工作服和使用一次性手套實驗過程應(yīng)穿著專用工作服和使用一次性手套實驗前應(yīng)該對實驗室進(jìn)行紫外線消毒，并用實驗前應(yīng)該對實驗室進(jìn)行紫外線消毒，并用75%75%乙醇清洗工作臺和微量加樣器乙醇清洗工作臺和微量加樣器實驗所用移液器（加樣器）的移夜吸頭不應(yīng)重實驗所用移液器（加樣器）的移夜吸頭不應(yīng)重復(fù)試用復(fù)試用操作人員應(yīng)受過專業(yè)培訓(xùn)或具有一定操作經(jīng)驗操作人

7、員應(yīng)受過專業(yè)培訓(xùn)或具有一定操作經(jīng)驗使用一次性用品使用一次性用品取取500l 500l 混勻的臨床標(biāo)混勻的臨床標(biāo)本，加入本，加入1.5ml1.5ml離心管離心管14000rpm 14000rpm 離心離心1min1min100 15 min100 15 min加入加入400l400l溶液溶液，混勻，放置混勻，放置2 min2 min14000rpm 14000rpm 離心離心5 min5 min加入加入400l400l溶液溶液（預(yù)（預(yù)先溶解），重懸細(xì)胞先溶解），重懸細(xì)胞去上清去上清14000rpm 14000rpm 離心離心1 min1 min去上清去上清去上清，務(wù)必去干凈去上清，務(wù)必去干凈室溫

8、放置室溫放置5 min5 min晾干晾干加入加入60l60l溶液溶液重新懸浮沉淀，重新懸浮沉淀，充分溶解。加樣前充分溶解。加樣前14000rpm14000rpm離心離心5 min5 min，上清即，上清即DNADNAPCRmix PCRmix 提前解凍；提前解凍；TaqTaq酶使用時拿出冰箱酶使用時拿出冰箱在潔凈離心管中按比例在潔凈離心管中按比例混合混合PCRmixPCRmix、TaqTaq酶，混酶，混勻，短暫離心勻，短暫離心24l/24l/管管 分裝到分裝到PCRPCR管管將臨床樣本將臨床樣本DNADNA（1l1l）按）按相應(yīng)順序加入到各相應(yīng)順序加入到各PCRPCR管管標(biāo)記各管，混勻，標(biāo)記各

9、管，混勻，短暫離心短暫離心各管放入各管放入PCRPCR儀，儀，按程序擴(kuò)增按程序擴(kuò)增95 9 min95 9 min，（，（ 95 30 sec 95 30 sec ， 55 30 55 30 secsec， 72 30 sec 72 30 sec ）40 Cycles 40 Cycles 72 5 min72 5 min，4-16 Incubation4-16 IncubationPCRPCR儀需熱蓋加熱（若無熱蓋，需添加石蠟儀需熱蓋加熱（若無熱蓋，需添加石蠟油）；油）；PCRPCR產(chǎn)物可于產(chǎn)物可于44或或-20-20保存?zhèn)溆帽４鎮(zhèn)溆脺?zhǔn)備：水浴鍋，準(zhǔn)備：水浴鍋，4545，雜交，雜交液，溶液液，

10、溶液B B預(yù)熱；制備冰水預(yù)熱；制備冰水PCRPCR產(chǎn)物：產(chǎn)物：PCRPCR儀儀/95/95變性變性5 min5 min迅速放入冰水中迅速放入冰水中開雜交儀，蒸餾水充滿反應(yīng)室開雜交儀，蒸餾水充滿反應(yīng)室開泵，排出多孔板上的水，關(guān)泵開泵，排出多孔板上的水，關(guān)泵安放安放 分隔膜分隔膜- -雜交膜雜交膜- -分隔室分隔室- -壓壓扣蓋，雜交液扣蓋，雜交液0.8 ml0.8 ml，預(yù)雜交，預(yù)雜交開泵開泵- -排干雜交液排干雜交液- -關(guān)泵，加雜交液關(guān)泵，加雜交液0.5 ml0.5 ml開泵：導(dǎo)流雜交開泵：導(dǎo)流雜交4545雜交液雜交液0.8 ml0.8 ml清洗三次，設(shè)溫度清洗三次，設(shè)溫度25 25 加封阻

11、液加封阻液0.5 ml0.5 ml，排液盡，關(guān)泵，排液盡，關(guān)泵（液體排盡后，在清洗下一次）（液體排盡后，在清洗下一次）20l PCR20l PCR產(chǎn)物：加入各反應(yīng)槽雜交液中，雜交產(chǎn)物：加入各反應(yīng)槽雜交液中，雜交（槍頭吸吹（槍頭吸吹2-32-3次混勻槍頭勿戳破雜交膜）次混勻槍頭勿戳破雜交膜）15 min15 min4545加封阻液加封阻液0.5 ml0.5 ml，封阻，封阻（封阻液少時在補(bǔ)加！）（封阻液少時在補(bǔ)加！）5 min5 min開泵開泵- -排液盡排液盡- -關(guān)泵；加關(guān)泵；加 酶標(biāo)液酶標(biāo)液0.5 ml0.5 ml：酶標(biāo)：酶標(biāo)（待溫度至（待溫度至252533后，再加酶標(biāo)液）后，再加酶標(biāo)液）

12、3 min3 min開泵開泵- -溶液溶液A 0.8 mlA 0.8 ml清洗四次清洗四次- -設(shè)溫度設(shè)溫度36-36-排液盡關(guān)泵排液盡關(guān)泵（清洗第二次時設(shè)溫度（清洗第二次時設(shè)溫度3636） 加顯色液加顯色液0.5 ml0.5 ml，蓋好雜交儀蓋板；顯色，蓋好雜交儀蓋板；顯色5 min5 min開泵開泵- -加溶液加溶液 B 0.8 ml B 0.8 ml 清洗三次清洗三次- -加蒸餾水清洗加蒸餾水清洗1 1次次- -關(guān)泵關(guān)泵結(jié)果判讀結(jié)果判讀1、宮頸病變及宮頸癌的篩查、宮頸病變及宮頸癌的篩查不同型別致癌能力不同，通過分型檢測，對患者進(jìn)行個體化評估，預(yù)測宮頸病變發(fā)生的風(fēng)險度，從而決定篩查的間隔、治療方案的制定。2、未明確診斷意義的非典型鱗狀細(xì)、未明確診斷意義的非典型鱗狀細(xì)胞和腺細(xì)胞（胞和腺細(xì)胞（AS-CUS/AGUS）和宮頸上皮內(nèi)低度病變（和宮頸上皮內(nèi)低度病變（LSIL）的分流的分流HPV基因分型檢測可排