1、肽核酸的研究進展及展望2004-11-04 肽核酸的研究進展及展望劉娜何蘊韶中山大學達安基因診斷中心，廣東廣州510080摘要 肽核酸(PeptideNucleicAcids,PNAs), 是 20 世紀 90 年代 初發現的新型DNA/RNA同類物，是一類人工合成的用蛋白質骨架 代替核酸中的磷酸核糖骨架而形成的新型分子，由于它擁有諸多 DNA/RNA不具備的優點，因此具有非常廣泛的分子生物學效應， 尤其在疾病的診斷和基因治療方面有著廣泛的應用前景。本文就 PNA寡聚體的結構、與核酸雜交的特點及雜交模式，分子生物學 效應，合成以及應用等方面予以綜述。關鍵詞肽核酸；反義；基因診斷自從1991年丹

2、麥Nielsen 設計并合成了肽核酸(PNA)以來，因 為其對核酸結合的高度特異性和高度親和力而備受關注。成為繼 寡核甘酸(oligodeolynucleotides,ODNs )以來更為有效而穩定 的反義，抗基因靶向性制劑。在基因診斷、基因治療、端粒酶活 性的抑制等各個分子生物學領域都得到了廣泛的應用，在基因調 節藥物研究方面也顯示了強大的潛力。1 PNA寡聚物的結構和分子生物學特性PNA是以電中性的肽鏈酰胺2-氨乙基甘氨酸組成的多聚酰胺鍵取 代了 DNA中的戊糖磷酸二酯鍵骨架而形成的類似核甘酸的物質， 每個堿基通過亞甲城基接頭(linker )與甘氨酸碳原子相連形成 與靶核酸雜交所需的序列

3、1 。 PNA的書寫方式是從5'端至3' 端，像傳統的DNA序列那樣,PNA寡聚體的氨基末端(NH2)相當于 DNA的5'端,PNA寡聚體的埃基末端(COOH)相當于DNA的3'末 端。盡管PNA單體也具有一個游離的氮末端和一個游離的碳末端，但嚴格說來它既非肽又非酸，僅僅具有一個擬肽骨架，因而化學 上和蛋白質（肽）更為接近。它與DNA的相同之處在于PNA也攜 帶ATCG四種堿基單體，這就保證了 PNA能夠按照堿基互補的原則 識別相應的堿基序列。與DNA不同的是它沒有磷酸戊糖骨架，因 在結構上與 傳統的寡核苷 酸 有所 不 同 ,故 其 與 寡 核 苷酸 相 比

4、,PNA寡聚體具有 獨特的特性:PNA 寡聚 體 具 有較 好 的 熱 穩定 性 、較 高 的結合親合力及不依賴于鹽濃度的特殊性。它們不被目前已知的任 何核酸酶或蛋白酶所降解2 , 3。PNA寡聚體的優越的特性還在 于它們形成三鏈體的能力及誘導雙鏈核酸分子產生鏈置換的能力 4。而且，PNA與相應的DNA mRNA勺轉錄及翻譯的啟動位點結 合后，可以抑制相應的轉錄及翻譯過程。這些特性使PNA在反義 藥物的研究設計上有潛在的應用價值。2 PNA 與 核 酸 雜 交 的 特 點 及 雜 交 模 式2.1 PNA 與 核 酸 雜 交 特 點由于PNA的電中性骨架，具分子中不含磷酸基團，因此PNA鏈更

5、容易和帶有負電荷的互補序列的DNA或RNA鏈結合2。而且形成 的復合物分子較之DNA/DNA雙鏈或DNA/RNA雜交鏈更為穩定1 ,3, 4 。有 報 道 證 實 4 ，在 同 樣 的 雜 交 條 件 下 ，同 樣 序 列 的 15mer 的 DNA/DNA雙鏈的Tm值是53.3 C , DNA/RNA為50.6 C ,而相應的 PNA/DNA 的 Tm 值為 69.5 C , PNA/RNA 更高，為 72.3 C。即 PNA/DNA, PNA/RNA與同樣 序歹U的DNA/DNA, DNA/RAN雙鏈相比，每增 加一個 堿基數，Tm值增加1C。PNA與核酸雜交不僅具有很高的親和性,還有很高

6、的特異性。PNA 對互補DNA的錯配容忍程度比相應的DNA/DNA更低，一個15mer 的PNA/DNA分子在其中間段出現一個錯配堿基，其Tm值下降8c 20 ， 兩 個 堿 基 錯 配 則 完 全 不 能 雜 交 4 ， 5 。PNA的一個獨特性質是以平行或反平行的方式與核酸結合4。所 謂平行，就是PNA的氨基末端對著寡核甘酸5'端，反平行，就是 PNA的氨基末端對著寡核甘酸3'端。PNA與DNA（或RNA）形成的 雙 螺旋 傾 向 于 反 平 行 結 合 4, 而 形 成 的 三 螺 旋 傾 向 于平行結合6 。且 兩 種 結 合 方 式 都 得 到非 常 穩 定 的 復

7、合 物 4 。當一個PNA分子侵入靶DNA序列時，一條DNA鏈被置換1.2,通過Watson-Crick 堿基配對原則迅速而高度特異的與其互補DNA結合 4。此后，第 二個PNA分 子又與PNA/DNA雙 螺旋以Hoogsteen 鍵 形 成 非 常 穩 定 的 ( PNA) 2/DNA 三 鏈 結 構 ， 留 下 未 結 合 的 鏈 呈 單 鏈 狀態。PNA的這些特性引起了反義和雜交技術領域眾多研究者的 興趣。2.2 PNA 與DNA RNA雜交模式如前所述，PNA單鏈可以通過堿基互補配對原則與相應的DNA RNA 單鏈形成穩定的雙鏈結構4.7。同時，PNA多聚同源喀呢單鏈在 dsDNA 雙

8、 螺 旋 的 外 側 以 Hoogsteen 鍵 的 方 式 與 互 補 堿 基 配 對 ， 形 成 PNA-dsDNA 三 鏈 體 。2.2.1 常規的PNA-dsDNA三鏈體模式 PNA多聚同源喀呢單鏈在 dsDNA 的 雙 鏈 外 側 ， 以 Hoogteen 鍵 的 方 式 與 互 補 的 堿 基 配 對 ， 形 成PNA-dsDNA三鏈體。當PNA富含胞喀呢時，這種結合較為穩定。2.2.2 三 鏈 侵 襲( Triplex invasion )模 式 這 種 方 式 形 成 的 復 合 物相當穩定，而且可以有效的抑制轉錄活性，從而在反義核苷酸 的研究上具有非常重要的意義。這種模式通常

9、發生在多聚同源嘧 噬PNA和相應的多聚喋吟dsDNA靶序列之間。Nielsen 等1在合 成PNA之初就觀察到他所合成的連續10個胸腺喀呢PN A PNA-T10) 可以在DNAM螺旋內部,以Watson-Crick 方式替換原靶序列dsDNA 中的dT10,與靶序列的dA10相結合，形成PNA-DAN-PNA復合物的 結構；另一條dT10 PNA單鏈則在復合物外側以Hoogsteen 鍵的方 式與復合物結合，從而形成穩定的四鏈體結構。預計該反應機理 是當“DNA呼吸”發生時，DNA雙螺旋結構在瞬間變為單鏈結構， PNA利用它和DNA鏈的超強結合作用侵入到DNA雙螺旋的內部， 以類似“拉鏈的方

10、式”完成侵襲反應1。這一利用DNA呼吸的原 理在隨后的實驗中被證實，當dsDNA存在負超螺旋結構而使雙鏈 打開時，PNA結合效率明顯提高8。而在轉錄過程中由于轉錄泡 的形成而導致雙鏈暫時打開時，PNA也更容易侵入dsDNA雙螺旋 內 部 9 。2.2.3 雙 鏈 侵 襲 ( Duplex Invasion ) 模 式 這 種 結 合 方 式 常 發 生 在多聚同源喋吟PNA和dsDNA的同源喀噬靶序列之間,PNA侵入 到dsDNA雙螺旋內部，以Watson-Crick 氫鍵的方式和靶序列結合， 形成DNA-PNA-DNA三體復合物。當PNA中的腺喋吟被二氨基喋吟代 替 時 ， 復 合 物 的

11、穩 定 性 進 一 步 提 高 。 每 替 換 一 個 腺 嘌 呤 ， Tm 值 提高2c4c 10。這種結合方式至少在某些負超螺旋DNA靶序 列上是有效的。2.2.4 雙 螺 旋 侵 襲 （ Double helix invasion ） 的 模 式 這 種 模 式 是在上種模式的基礎發展而來的。在這種模式中，dsDNA兩條鏈 上的某段序列同時作為靶片段，分別設計兩條PNA探針，也稱“假 互補PNA”（ Pseudocomplementary PNA,pc PNA ）。 探 針 中 的 腺喋吟（A）全部用二氨基喋吟（D）取代，胸腺喀呢（T）全部用琉 基尿嘧 啶 （sU） 取 代 。 這 樣

12、一 來 ， 當 兩 條 含有 D、sU 的 pcPNA 與相應的dsDNA發生反應的時候，pcPNA可同時與dsDNA兩條鏈中 相應的靶序列結合，形成穩定的PNA- dsDNA- PNA復合物。而 pcPNA本身兩條鏈間由于D和sU立體結構的位阻作用卻無法結合， 這 就保證了pcPNA 在識別靶序列的同時不會自 己互 補。 Lohse等11的實驗結 果 證 實這種結合特異而高效，估 計80以 上 的 靶序列是考 Watson-Crick 鍵的方式與PNA結合的。Demidov等12更 是對這種模式的動力學過程和可能的機制進行了詳盡的探討。與 以上幾種鏈侵襲的模式比較，這種模式顯然更具有廣泛的應

13、用前 景。因為PNA不需要非得是多喀呢不可，它可以設計成任何與靶 序列互補的堿基序列。3 PNA 的 合 成PNA的合成目前采用固相肽核酸合成法合成PNA5。此法是使用 9- 氟烯 基甲氧碳酰（Fmoc） 肽合 成技 術 。 其中 單 體中 的 氨 基 主鏈 被Fmoc保護起來，這種方法使PNA結合于肽以及象生物素或熒光染 料 這樣 的標記物上，每 一 合成 周期 大 約 需要 30 分鐘 ，主 要 分為 以下幾個步驟：裝柱。與常規的將被合成的C末端氨基酸連接于固 相支持物的肽合成柱有所不同，PNA合成柱僅含有聚苯乙烯周相 支持物。洗滌。合成開始前，用二甲苯甲酰胺（DMF）洗滌PNA合 成 柱

14、 。 去 封 閉 。 以 六 氫 吡 啶 /DMF 去 除 Fmoc 保 護 基 團 。 洗 滌 ， 通過DMF洗滌去除過量試劑。活化和偶聯。在存在二異丙基乙 胺和六氟代磷酸酯混合物的情況下，將新合成的PNA單體活化偶 聯到固相樹脂（或者偶聯到延伸的PNA鏈上）。洗滌。用DMF洗 滌 去 除 過 剩 試 劑 。 加 帽 。通 過 溶 于 二 甲 基 吡 啶 /DMF 中 的 乙 酸 酐 將未反應基因加帽。洗滌。以DNF洗滌去除多余試劑。將PNA 產物與比例為4:1的三氟三酸及m-甲酚混合物共同溫育以進行切 割和最終脫保護。這種切割和去保護的PNA寡聚體在260nm波長 下定量，通過反向液相色譜

15、和質譜進行純度分析及PNA產物定量。 260nm下OD值為1時,PNA產物含量相當于26 g。4 PNA 應 用4.1 PNA 在 分 子 生 物 學 技 術 上 的 應 用PNA不帶電荷，不會被核酸酶或蛋白酶降解，也不會與血清蛋白結 合，并且PNA與DNA或RNA連結能力強、特異性很高。PNA具有 普通寡核苷酸所沒有的眾多特性，在分子生物學技術方面應用廣 泛。分析DNA中的點突變：PNA與DNA或RNA鏈結合形成的 PNA/DNA和PNA/RNA熱穩定性高且對堿基錯配敏感，一個堿基的 錯配可使T m值大幅度下降，利用PNA此特點可以不用測序就能 分析DNA序列中的點突變。Czerny 等13

16、發明了一種PNA定向 PCR鉗技術，它不需要測序，僅用簡單的一步就能發現點突變的 存在。這種技術主要用來探測DNA片段中某種已知的點突變，在 C zerny設計的PCR反應體系中含有待擴增的模板DNA以及一個 PNA片段和兩條DNA弓|物。其中，PNA與野生型DNA的5'端互補， DNA引物中一條與DNA突變型的5'端互補而另一條則是兩者共有 的3'端引物。如果待擴增的DNA模板中沒有發生點突變，則PNA 片段與DNA模板相連，PCR反應被終止；反之，則DNA引物與DNA 模板相連，PCR反應得以進行。通過改變相應DNA引物和PNA片 段 ,不 同 的 點 突 變 可

17、以 用 這 種 方 法 檢 測 出 來 。 擴 增 較 長 序 列 的 DNA: PCR技術由于可以特異性擴增極微量的DNA片段，而在法醫 學 、親 子 鑒 定 和 分 子 生 物 學 研 究 中 得 到 廣 泛 的 應 用 。但 是 , 被 擴 增 的DNA片段中可能含有多個不規則重復序列。這些含重復序列的 基因可以在退火時發生模板鏈內或鏈間雜交從而妨礙較長序列DNA的擴增。PNA的出現解決了這個問題。在PCR反應體系中，力口 入與DNA模板中間重復序列互補的PNA片段，該PNA片段與DNA模 板退火雜交，從而封閉已變性的DNA模板中的重復序列。PNA與DNA 模 板 退 火 雜 交 溫 度

18、 一 般 較 高 (78), 在 此 溫 度 下 , 模 板 中 間 的 重 復序列彼此不會雜交，當PNA封閉已變性的DNA模板中的重復序列 后，降低溫度使PCR引物與變性的DNA模板兩端雜交(溫度一般為 60C ),然后升高溫度(72 C )以完成PCR反應的延伸過程，與此同 時將PNA與模板分離。用此方法可以擴增出較長序列的DNA片段 14。特異性切割DNA:同源喀呢組成的PNA可以與含有一段同 源 嘌 呤 的 模 板 牢 固 結 合 , PNA 這 個 特 性 可 以 使 限 制 性 內 切 酶 只 對個別位點進行特異性切割。Veselkov 等15合成了一段由同源 喀呢組成的PNA,然

19、后用它去封閉DNA上一段同源喋吟組成的序 列。在未被封閉的DNA的其它部分甲基化后，再去掉PNA片段。因 為DNA模板中的同源喋吟部分受到了 PNA的保護，所以只有此段避 免 了 被 甲 基 化 ,因 此 也 只 有 此 段 能 被 限 制 性 內 切 酶 有 效 的 切 割 。 另 外，PNA可以用來從復雜的混合物中捕獲特異性DNA和RNA片段， 并且在捕獲的效率和特異性方面比使用DNA更好。B offa 等16 用生物素標記的PNA先與染色體中互補DNA片段結合，再與磁性親 和素微球連接后將含CAG重復序列的轉錄基因從染色體中分離出 來。DNA雜交實驗亦證實用該法提取的基因特異性高，信息量

20、完整。4.2 PNA 在疾 病 診斷領域的 應 用4.2.1 PNA用 于 熒光原位雜 交 （ FISH ） 分 析 這 是 目 前 為 止 發 展 較為成熟的一種技術，這項技術可以針對病原微生物的分子化石 rRNA的序列來設計PNA探針，利用該探針結合FISH的方法來分 離，鑒定，計數病原微生物。這項技術也可以利用衛星重復序列 來設計針對人類染色體的特異性PNA探針，用于染色體異常性疾 病的診斷。還可以設計出端粒酶PNA探針用于檢測癌癥及衰老問 題。4.2.2 PNA 用于“PCR夾”的研究 這是利用PNA與DNA的高親和 力及高特異性，結合PCR技術檢測目的核酸序列中的單堿基突變。 由于P

21、NA無法被Tag酶所識別，因此尚無法作為PCR引物。利用 這 一 特 性 ， 可 以 針 對 目 的 堿 基 設 計 出 一 對 單 個 堿 基 差 異 的 寡 聚 PNA 和DNA加入反應體系中，其中PNA僅能和野生型目的堿基配對， DNA引物則與突變型目的堿基配對。當模板是野生型時，PNA利用 它與DNA的高度親和力競爭性徹底抑制了 PCR反應的進行，使反 應無任何產物生成。而當模板是突變型時，DNA引物即可以結合 到模板上，經過足夠多的循環數，擴增出目的條帶。該技術已經 被 廣 泛 應 用 于 各 種 基 因 點 突 變 的 檢 測 17 。4.3 基 因 組 切 割 和 圖 譜 分 析

22、喀呢同聚體PNA與dsDNA結合形成的D-環結構為單股DNA,它對 S1酶和綠豆核酸酶敏感1,因此可以用S1酶對基因組DNA進行 定點切割和基因克隆。但這樣切割的DNA有片段缺失。采用PNA 對，即一分子PNA與基因的模板鏈結合，另一分子PNA與非模板 鏈結合，如此形成的P-環能限制S1酶的切割范圍1.18 。S1酶 定點切割dsDNA雖然簡單、有效，且不需要甲基化的步驟，但它 不能產生粘性末端，也不能進行基因組DNA酶切圖譜的分析。PNA與dsDNA結合后，可以保護重疊區內或距結合區23個核甘 酸以遠的核酸限制性內切酶位點不被甲基化酶所甲基化，也不被 限制酶所切割19。PNA與染色體或大片段

23、DNA結合后，用甲基 化酶處理，PNA結合區以外的甲基化酶識別位點被甲基化，不會 被匹配限制酶所切割。當PNA從dsDNA鏈上洗脫下來后，PNA結 合區內的限制酶位點因未被甲基化而可被特異的限制酶切開，從 而達到對染色體和大基因組片段進行定點切割的目的。4.4 基 因 表 達 調 控從基因到蛋白質要經過轉錄形成mRNA再以mRNA為模板譯成蛋白 質的過程。PNA通過與dsDNA或RNA結合而影響轉錄和翻譯的過 程。用T3、T7及哺乳動物細胞pol II所做的實驗表明20.21, PNA與dsDNA中的模板鏈結合能抑制轉錄的延伸。這種抑制效率 與PNA組成有關，一般1015聚體PNA即可有效抑制

24、。T10同聚 PNA導致的轉錄在PNA的第一位堿基，T5C1T4PNA在第2或第3位 堿基上。T2C1T2C1T4PNA則在最后的3位堿基上。PNA抑制轉錄延 伸的作用比寡核苷酸強，且不需要進行修飾。實驗證明同聚嘧啶 PNA與dsDNA進行結合形成的P-環可以作為轉錄的啟動子，與DNA 自身啟動子競爭轉錄系統22。啟動反義RNA鏈的合成，這是很 有意思的結果。如果PNA將來能作為基因打靶的藥物，它可從反 基 因 ( antigene ) 和 反 義 mRNA( antisense ) 兩 個 環 節 阻 斷 基 因 表達。PNA與RNA結合能阻斷逆轉錄合成cDNA,與寡核甘酸不同,這種阻 斷

25、是 直 接 的 。 在 轉 染 了 SV40 大 T 抗 原 的 細 胞 內 注 射 PNA， 發 現 大 T抗原的表達從PNA靶序列處剪短，而對B -半乳糖甘酶蛋白則能 完整表達，說明這種阻斷作用是特異的，與用細胞漿提取物所做 的實驗結果一致，說明PNA在細胞內至少能從RNA水平上發揮基 因靶向藥物的作用20, 一般15聚體PNA即可。4.5 PNA 在 基 因 治 療 上 的 應 用 基因治療是指制備正常基因代替遺傳缺陷基因或關閉、抑制異常基因。基 因 原位修 復 是 最 理想 途 徑 , 但 目 前在 技 術 上 很難做 到 。由于肽核酸 具 有廣泛 生 物 學 效應 ,作 為 基 因

26、治療 藥 物 有 很大潛 能 。4.5.1 PNA 作為反義藥物 PNA的反義性質是指PNA與mRNA吉合, 從 而 阻 斷 翻 譯 , 使 蛋 白 質 的 合 成 不 能 進 行 。 理 論 上 ,PNA 是 最 有 前 途的反義藥物。PNA不受血清及體液中的核酸酶及蛋白酶降解， 是作為反義藥物的重要前提。P NA與RNA的結合力強，特異 性高，因而抑制特定基因表達所需的劑量很小。PNA與單鏈RNA 結合，同時也與其相應單鏈DNA結合，而且PNA/RNA復合物的穩定 性遠較PNA/DNA的穩定性為高。PNA可特異地阻遏翻譯過程，形 成雙螺旋的PNA如果與起始密碼子區域互補，可阻遏翻譯，并表現

27、 出劑量依賴型；如果與編碼區互補則無阻遏作用；而形成三螺旋 的PNA在兩種區域均可阻遏翻譯23。4.5.2 PNA反基因藥物 反基因策略的作用靶是DNA,通過在每個基 因組中形成PNA/DNA復合物，理論上就可抑制轉錄。當作用靶是 mRNA寸,PNA必須與細胞中大量m RNA結合才可抑制翻譯，所以反 基因策略更有吸引力。PNA能與雙鏈DNA結合形成很穩定的鏈取 代 復 合 物 ,因 此 它 們 是 很 好 的 反 基 因 試 劑 。 已 有 實 驗 證 實 這 種 PNA2/ds DNA復合物在體外能阻斷原核及真核RNA聚合酶的延伸 24。其中的一個實驗研究了 PNA對噬菌體RNA聚合酶T 3

28、及T 7 參與的轉錄的影響，靶序列位于bluescript K S +質粒上T 3或 T 7啟動子的下游。實驗發現，結合于模板鏈針對高喋吟位點的10 聚PNA可阻止轉錄，而非結合于模板鏈的PNA則不能阻止轉錄。Nielsen 等25進行引物延伸實驗發現在PNA結合的位點,Tag DNA 聚合酶和Ecoli DNA聚合酶大片段受到抑制。同樣PNA可抑制RNA 聚合酶，終止基因的轉錄。另外,PNA除了阻止RNA RNA聚合酶外， 針對DNA結合蛋白識別基因控制區的PNA也可能下調基因復制和 轉錄。5 PNA 展 望根據PNA的代謝穩定性，主要將其用于抑制基因表達的反義藥物研 究 領 域 ， 國 外

29、 幾 家 制 藥 及 生 物 技 術 公 司 ， ISIS 、 PE 等 公 司 均 投入大量精力從事開發研究；根據其與DNA優良的雜交穩定性，PNA 又被廣泛用于DNA分子識別和操縱。PNA可以廣泛用于病原體、 遺傳病檢測的分子雜交、原位雜交、突變分析、抗癌、抗病毒反 義核酸研究和應用。尤其是PNA可以取代寡核甘酸用于基因芯片 的制備，將比普通基因芯片更穩定，特異性也更好，被認為是基 因芯片的升級產品，相信在臨床診斷芯片的開發方面。PNA也可 用于定量PCR,可以用于實時檢測PCR的擴增反應；也可將其做 成PNA Beacon ,用于實時監測細胞內的RNA表達。隨著PNA基礎 研究的不斷深入

30、和新技術的不斷出現，PNA將顯示出無比優越的 性能和更為廣闊的應用前景。參考文獻1 Nielsen PE et al. Science, 1991; 254:1497.2 Peffer NJ et al . Proc Natl Acad SciUSA ,1993;90(22):10648.3 Ecker DJ et al . Natl Biotechonl,1998;16:332.4 Egholm M et al. Nature, 1993; 365: 566.5 ScarfiS,GA et al.BiochemBio-physResCommun,1997；236(2):323-326.6 NielsenPE,EgholmM,BuchardtO.Bioconjug