1、水中大腸菌群的測定報告題目水中大腸菌群的測定作者姓名班級生科1104班指導教師完成時間2013年6月生物學實驗教學中心目 錄引言11 實驗材料12 實驗步驟12.112.212.312.412.5數據分析與結果處理13 結果與分析13.1圖片13.21總結1參考文獻1水中大腸菌群的測定（指導老師：）（湖北師范學院生命科學學院 生物技術1104班 湖北 黃石 435002）摘 要：測定青山湖水中的大腸菌群的含量。將待測水分別稀釋10倍、100倍、1000倍3種梯度在三倍濃縮培養基 37培養24h后挑選出產酸或產氣的菌畫線接種到伊紅美藍平板中37培養24h，將培養基中表現為陽性的菌落做革蘭氏染色鏡

2、檢為陰性的菌種接種到乳糖蛋白胨培養基中37培養24h,挑選大腸桿菌陽性菌。結果稀釋10倍的水有3管大腸桿菌陽性菌，稀釋100倍的水有3管，稀釋1000倍的有2管，即青山湖水中大腸桿菌的含量為MPN=11000.關鍵詞：大腸桿菌、多管發酵法 青山湖水水中大腸菌群的測定（指導老師：）（湖北師范學院生命科學學院 生物技術1104班 湖北 黃石 435002）引言水對我們的生命起著重要的作用，它是生命的源泉，是人類賴以生存與發展的不可缺少的最重要的物質資源之一。人的生命一刻也離不開水，水是人生命需要最主要的物質。水也是大腸菌群的天然環境，一般地面水比地下水含菌數量多，并易被病原菌污染。人飲用后引發疾病

3、。水質細菌學檢驗是培水與污水水質分析工作中的一項重要指標。水的微生物學的檢驗，特別是腸道細菌的檢驗，在保證飲水安全和控制傳染病上有著重要意義，同時也是評價水質狀況的重要指標。國家飲用水標準規定，飲用水中大腸菌群數每升中不超過3個，細菌總數每毫升不超過100個。1 實驗材料藥品：蛋白胨，牛肉膏，乳糖，蒸餾水，1.6%溴甲酚紫乙醇溶液，2%伊紅（曙紅）水溶液，0.5%美藍（亞甲藍）水溶液，氫氧化鈉水溶液。工業酒精、草酸銨結晶紫染液、盧戈氏碘液，番紅復染液，香柏油，二甲苯。儀器(生產廠家)：顯微鏡，天平，培養箱，水浴鍋，平皿，德氏管，刻度吸管，洗耳球，無菌涂布棒，量筒，滅菌鍋，酒精燈，接種環，棉花，

4、棉線，報紙。菌種：青山湖水中大腸桿菌2實驗步驟（參照實驗書）：2.1 配制培養基及滅菌1. 乳糖蛋白胨培養基的配制（供多管發酵法的復發酵用）（1）蛋白胨1g牛肉膏0.5g乳糖0.5g氯化鈉0.5g1.6%溴甲酚紫乙醇溶液0.1mL蒸餾水100mL 2、三倍濃縮乳糖培養基（1）蛋白胨3g牛肉膏1.5g乳糖1.5g氯化鈉1.5g1.6%溴甲酚紫乙醇溶液0.3mL蒸餾水100mL3.滅菌l 移液管的包裝：將移液管的尖端，放在4-5cm寬的長紙條的一端，移液管與紙條約成30°夾角，折疊包裝紙包住移液管尖端，用左手將移液管壓緊，在桌面上向前搓轉，紙條螺旋式地包在移液管外面，余下的紙折疊打結。多

5、支包裝，待滅菌。l 培養皿的包裝：培養皿由一底一蓋組成一套，用報紙將10套培養皿（皿底朝里，皿蓋朝外，5套、5套相對而放）包好。l 棉塞的制作：按試管口或錐形瓶口大小估計用棉量，將棉花鋪成中間厚、周圍逐漸變薄的近正方形，折一個角后（成五角形）卷成卷，一手握粗端，將細端塞入試管或錐形瓶的口內，棉塞不宜過緊或過松用手提棉塞，以管、瓶不掉下為宜。棉塞四周應緊貼管壁或瓶壁不能有褶皺，以防空氣微生物沿棉塞皺折侵入。棉塞的直徑和長度視試管和錐形瓶的大小而定，一般約3/5塞入管內。必須做到松緊合適，緊貼管壁，拔出時不松散、不變形。l 將所有準備待滅菌物品，包扎好后置于高壓蒸汽滅菌鍋中，121高壓蒸汽滅菌20

6、min。l 將上述滅菌物品貯存于冷暗處備用。1.2 初發酵實驗。配制350ml三倍的乳糖蛋白胨培養液（每組取45ml），分裝到9支試管中，每支試管內加入一個倒放的布氏小管，保證小管內無氣泡。取水樣并作梯度稀釋，分別稀釋出10倍，100倍，1000倍，在培養基中加入3中濃度的菌液10ml，每個稀釋濃度各重復3個，混勻37度培養24h。2.3平板分離。培養后產酸，產氣或僅產酸的發酵管為陽性反應，否則為陰性。配制伊紅美藍培養液1200ml（每組取200ml），然后倒12個平板，分別將9支試管中的菌用畫線法接種到培養基上，。再隨機從3種濃度的菌液中隨機取一管進行接種。37度培養24h。將培養基中的菌種

7、挑取少許進行革蘭氏染色，再做鏡檢。革蘭氏染色：將帶有上述典型特征的菌落（在伊紅美藍平板上大腸桿菌群的典型菌落為深紫黑色，具有金屬光澤；或者為紫黑色，不帶或略帶金屬光澤；或者為紫紅色、中心較深的菌落）做革蘭氏鏡檢：將大腸桿菌菌落涂片，干燥，固定。然后加草酸銨結晶紫一滴，染色1分鐘后傾去染液，水洗至流出水為無色。用盧戈氏碘液覆蓋1分鐘，傾去碘液，水洗至流出水為無色。再用濾紙吸去玻片上的殘水，將玻片傾斜，并襯以白紙背景，用95%乙醇滴洗至剛剛無紫色為止，25S，然后立即用水沖去乙醇。將玻片上殘留的水用吸水紙吸去，用番紅復染液染色2分鐘，水洗，吸去殘水，晾干。干燥后，油鏡觀察。以分開的細菌顏色為準，革

8、蘭氏陽性菌呈紫色。陰性菌呈紅色。 2.4 復發酵。配制100ml乳糖蛋白胨培養基，分裝10管（每管均加入布氏小管），高溫滅菌。將鏡檢結果為陰性的菌種對應的培養基上的菌種接種到乳糖蛋白胨培養基上，37度培養24h，仍產酸，產氣的是大腸菌群陽性。2.5結果計算。根據三個稀釋度中的陽性管數組成的一個數量指標，查表計算結果。3 結果與分析1.大腸桿菌初發酵后的實驗現象：稀釋度 0.10.010.001管號123123123現象氣泡較多，溶液變黃有氣泡，溶液變黃有氣泡，溶液變黃有氣泡，溶液變黃氣泡較少，溶液變黃2. 伊紅美藍培養基的篩選后的實驗現象： 稀釋度0.10.010.001管號123412341

9、234鏡檢現象陰陰陰陰陰陰陰陰陽4陰陰陰3.大腸桿菌復發酵的實驗現象：稀釋度0.10.010.001陽性管數332大腸桿菌MPN11000實驗分析：大腸桿菌是一大類群的總稱并不是哪一種的種名，這一類群中包括好多種，這些種中有的僅產酸有的既產酸又產氣。大腸桿菌在伊紅美藍中菌落具有典型的特征，依據菌落的特征可以進行篩選再由革蘭氏染色進行確認。本次實驗中初發酵中現象均為陽性，在進行篩選中有6個培養皿中鏡檢為陰性，但鏡檢中發現大腸桿菌的密度很低。在復發酵的實驗結果中培養一天各管并未產氣且僅有一管產酸，可能是復發酵挑選的菌中大部分不是大腸桿菌，也有可能是菌濃度過低，還有可能是在挑菌是挑的太少或是在操作時

10、不規范如在灼燒接種環時未待冷卻使菌受到損傷或直接燒死了，這些均會是結果不理想。總結釋10倍的水有3管大腸桿菌陽性菌，稀釋100倍的水有3管，稀釋1000倍的有2管即青山湖水中大腸桿菌的含量為MPN=11000.實驗內容與安排的建議、實驗感受、實驗改進想法等操作分析1、培養基的配制滅菌1）在培養基分裝過程中注意乳糖培養基與三倍乳糖培養基的量，其中三倍乳糖培養基是每管10ml,乳糖培養基每管5ml。2）杜氏小管在傾斜的放入裝有培養基的試管內出現了氣泡，將試管倒立使氣泡排空后再正放即可排除氣泡。3）在整理所需滅菌物品時，由于訓練不足整體上還是有點混亂，不過能及時解決。4）培養基的配制儀器的包扎與包裝

11、比較熟練，未出現問題。2、水樣采集及稀釋，初發酵實驗1）用移液管移取菌液時，單手操作能力還是欠缺，總習慣性的把試管塞放到桌面上。在微生物實驗過程中，最重要的就是要時刻保持無菌條件，因此一些試管塞應該放到手上而不是桌上。在打開每一個試管塞時應該將試管口在火焰上灼燒，操作時盡量距離酒精燈近一些。2）移液管依然是用吸耳球吸取液體，由于無菌操作臺的玻璃門開啟幅度不能過高，以不超過下巴為宜，因此雙手在操作臺里操作很僵硬，受到限制，移取液體很不方便；多熟悉在無菌操作臺條件下進行實驗的環境并且要培養自己單手操作的能力，在無菌操作臺里盡量避免用吸耳球輔助移液管移取液體，而是訓練用口操作。3）還是準備的不充足，

12、在無菌操作臺里需要提前把實驗過程中需要用到的一些儀器與試劑等放到里面提前滅菌消毒二十分鐘，考慮不全面總會時不時突然想到還有什么東西沒拿進來滅菌消毒，于是在這個地方耽誤了很長時間。因此每次用無菌操作臺之前，應該在實驗室里將所需物品準備齊全，最好能考慮周到，可以小組互相討論，將遺漏的物品補齊。4）初發酵將稀釋好的樣液倒入試管中應注意將樣液緩緩地倒入以免倒入過猛而導致氣泡進入杜氏小管，或導致培養基的飛濺。5）在加入樣液前未做好標記，增添了實驗的復雜度，應注意實驗前應貼好標簽以使實驗過程更清晰。3、平板分離1）倒平板時培養基的量倒的過多，導致培養皿的培養基層過厚；倒平板時，右手持裝有培養基的三角瓶，左

13、手將瓶入培養基約15ml，量不能過多，然后蓋上蓋子，輕輕晃動培養皿，使培養基均勻分布在培養皿底部，最后平置于桌面上，冷卻凝固。2）劃線分離時劃線的方式有誤，如接種環在酒精燈灼燒后未完全冷卻就立即劃線，可能會引起某些菌由于局部過熱而喪失生命活性；劃線太過密集，稀釋次數少，可能無法形成單菌落。平板劃線分離：a.接種環蘸取菌液的度是菌液在接種環上形成一個可見的水液面 b.劃線時,培養皿在左手,接種環在右手,皿蓋打開的范圍足夠接種環伸進去劃線c.劃線時先將接種環在酒精燈上灼燒,然后放在培養皿中間的培養基上輕輕劃動冷卻接種環,然后蘸取少量菌液在培養基上劃線d.劃線的力度要控制好,第一次三條線將接種環傾斜

14、一點平劃,是環上菌液落入培養基表面,再轉動培養皿,用同樣的方法劃線,重復此類操作三至四次.4、革蘭氏染色、復發酵實驗1）革蘭氏染色，五個裝片做了兩次才成功，可能原因是：a.涂片時菌液過少,在顯微鏡下觀察時,一個視野類的菌太少,很難判定革蘭氏染色的結果是陰性菌還是陽性菌b脫色時間不夠,紫色未完全褪去c.番紅復染時間不夠,視野里的菌大部分未被上色,對判斷是陰性菌還是陽性菌有干擾;d.菌液在載玻片上分布不均勻。解決的方案：(1)可以重復涂片幾次,但避免涂片過厚,導致視野里菌過多；(2)用乙醇脫色的標準是乙醇滴洗至剛剛無紫色為止,為了便于分辨顏色可以在玻片下墊一張白紙；(3)番紅染色的時間最終是控制在

15、4min左右,盡量控制染色時間適宜；(4)雖然復發酵實驗在操作上沒有什么問題,但我們根據實際情況對書上的一些操作進行了調整,在將革蘭氏染色鏡檢為陰性無芽孢桿菌的菌落按無菌操作接種到裝有乳糖蛋白胨培養基的試管中時,由于一次挑取的菌種比較少,因此每個試管都各自接種了三次,保證每個試管里都有足夠的大腸桿菌進行復發酵實驗。實驗感受：經過我們小組各成員的積極配合、共同努力，我們的實驗得到了圓滿結束。在實驗過程中，我們也遇到了不少困難，但大家齊心協力，一起討論問題的解決方法，才使的這兩個實驗都順利地完成。這兩個實驗，讓我們更好地水中細菌及大腸菌在我們的生產、生活中的作用，明確飲用水的符合標準，更好地應用到我們的實踐中去。同時，也學到了水中微生物在保證安全用水和控制傳染病上有著重要意義，同時也是評價水質狀況的重要指標。通過此實驗，讓我們懂得只有大家團結合作，不怕困難才能更好地克服各種困