1、在組織中檢測細胞增殖、分化和凋亡的方法一、 檢測細胞增殖的方法（1）直接方法：通過直接測定進行分裂的細胞來評價細胞的增殖力量1、 胸腺嘧啶核苷（3H-TdR）滲入法 胸腺嘧啶核苷（TdR）是DNA特有的堿基，也是DNA合成的必需物質(zhì)。用同位素3H標記TdR即3H-TdR作為DNA合成的前體能摻入DAN合成代謝過程，通過測定細胞的放射性強度，可以反映細胞DAN的代謝及細胞增殖狀況。但是具有放射性。2、羥基熒光素二醋酸鹽琥珀酰亞胺脂（CFSE）檢測法 羥基熒光素二醋酸鹽琥珀酰亞胺脂（CFSE）是一種可穿透細胞膜的熒光染料，具有與細胞特異性結(jié)合的琥珀酰亞胺脂基團和具有非酶促水解作用的羥基熒光素二醋酸

2、鹽基團，使CFSE成為一種良好的細胞標記物。CFSE進入細胞后可以不行逆地與細胞內(nèi)的氨基結(jié)合偶聯(lián)到細胞蛋白質(zhì)上。當細胞分裂時，CFsE標記熒光可平均安排至兩個子代細胞中，因此其熒光強度是親代細胞的一半。這樣，在一個增殖的細胞群中，各連續(xù)代細胞的熒光強度呈對遞減，利用流式細胞儀在488nm激發(fā)光和熒光檢測通道可對其進行分析。3、Brdu檢測法 Brdu中文全名5-溴脫氧尿嘧啶核苷，為胸腺嘧啶的衍生物，可代替胸腺嘧啶在DNA合成期（S期），活體注射或細胞培育加入，而后利用抗Brdu單克隆抗體，ICC染色，顯示增殖細胞。同時結(jié)合其它細胞標記物，雙重染色，可推斷增殖細胞的種類，增殖速度，對爭辯細胞動力

3、學有重要意義4、增殖標志檢測有些抗原 只存在于增殖細胞中，而非增值細胞缺乏這些抗原，您也可以通過特異性的單抗來對細胞增殖進行檢測。例如，在人體細胞中，Ki-67抗體識別同名蛋白，在細胞周期S期、G2期和M期表達，而在G0期和G1 期(非增殖期)不表達。用針對Ki-67蛋白的單抗就可以檢測細胞的增值狀況。由于需要組織切片，這種方法無法進行高通量分析。不過這一方法頗受癌癥爭辯者們的青睞，由于它能夠用來檢測體內(nèi)腫瘤細胞的增殖。其他普遍使用的細胞增殖或細胞周期調(diào)控標志還包括，增殖細胞核抗原PCNA、拓撲異構(gòu)酶IIB和磷酸化組蛋白H3。（2）間接方法：通過檢測樣品中健康細胞的數(shù)目來評價細胞的增殖力量1、

4、MTT檢測法 MTT檢測法主要反映細胞的能量代謝，是檢測細胞增殖活力的一種簡便精確的方法，其原理是在活細胞生長和增殖過程中，線粒體內(nèi)的脫氫酶可將黃色的MTT分解成蘭紫色的甲（Formazan），生成的甲量的多少與細胞的數(shù)量和細胞的活力成正比。2、ATP檢測細胞內(nèi)的ATP含量受到了嚴格調(diào)控，檢測ATP也可以得到細胞增殖的信息。死亡細胞或即將死亡的細胞幾乎不含ATP，在細胞溶解物或提取物中測得的ATP濃度與細胞數(shù)之間存在嚴格的線性關系。利用熒光素酶luciferase及其底物熒光素luciferin的ATP檢測以生物發(fā)光為基礎，能夠為您供應格外靈敏的結(jié)果。假如有ATP存在熒光素酶就會發(fā)光，而且其發(fā)

5、光強度與ATP濃度成正比，用能讀取發(fā)光信號的光度計和酶標儀都可以便利的進行檢測。這種方法格外適用于高通量細胞增殖檢測和篩選。二、 檢測細胞分化的方法1、 流式鑒定細胞表面標志，以推斷細胞是否分化2、 觀看細胞形態(tài)，與已分化的細胞進行對比3、 分化誘導評估其分化力量三、 檢測細胞凋亡的方法（1）形態(tài)學檢測1、光學顯微鏡和倒置顯微鏡染色細胞：凋亡細胞的染色質(zhì)濃縮、邊緣化，核膜裂解、染色質(zhì)分割成塊狀和凋亡小體等典型的凋亡形態(tài)。常用染色方法：蘇木精=伊紅染色 甲基綠-派諾寧染色：與壞死相比，細胞凋亡的細胞內(nèi)常有RNA表達的增加，用甲基綠特異性染色DNA，派諾寧對RNA親和力強，若胞質(zhì)呈派諾寧陽性為凋亡

6、，陰性為壞死。（前提是已經(jīng)推斷細胞處于死亡形態(tài)，通過形態(tài)學推斷） 吖啶橙染色法：。它與細胞中DNA和RNA結(jié)合量存在差別，可發(fā)出不同顏色的熒光，與DNA結(jié)合量少發(fā)綠色熒光，與RNA結(jié)合量多發(fā)桔黃色或桔紅色熒光。該染料具有膜通透性，能透過細胞膜，使核DNA和RNA染色。因此，在熒光顯微鏡下觀看，吖啶橙可透過正常細胞膜，使細胞核呈綠色或黃綠色均勻熒光；在凋亡細胞中，因染色質(zhì)固縮或斷裂為大小不等的片斷，形成凋亡小體。吖啶橙使其染上致密濃染的黃綠色熒光，或黃綠色碎片顆粒；而壞死細胞黃熒光減弱甚至消逝。吖啶橙染液有毒，操作時要戴手套，需避光。 （凋亡小體）2、熒光顯微鏡和共聚焦激光掃描顯微鏡一般以細胞核

7、染色質(zhì)的形態(tài)學轉(zhuǎn)變?yōu)橹笜藖碓u判細胞凋亡的進展狀況。常用的DNA特異性染料有：HO 33342 (Hoechst 33342)，HO 33258 (Hoechst 33258), DAPI。三種染料與 DNA的結(jié)合是非嵌入式的，主要結(jié)合在DNA的A-T堿基區(qū)。紫外光激發(fā)時放射光明的藍色熒光。Hoechst是與DNA特異結(jié)合的活性染料，儲存液用蒸餾水配成1mg/ml的濃度，使用時用PBS稀釋成終濃度為25mg/ml。DAPI為半通透性，用于常規(guī)固定細胞的染色。儲存液用蒸餾水配成1mg/ml的濃度，使用終濃度一般為0.5 1mg/ml。結(jié)果評判：細胞凋亡過程中細胞核染色質(zhì)的形態(tài)學轉(zhuǎn)變分為三期：期的細

8、胞核呈波紋狀(rippled)或呈折縫樣(creased)，部分染色質(zhì)消滅濃縮狀態(tài);a期細胞核的染色質(zhì)高度分散、邊緣化;b期的細胞核裂解為碎塊，產(chǎn)生凋亡小體（如圖）。3、透射電子顯微鏡觀看凋亡細胞體積變小，細胞質(zhì)濃縮。凋亡期（pro-apoptosis nuclei）的細胞核內(nèi)染色質(zhì)高度盤繞，消滅很多稱為氣穴現(xiàn)象（cavitations）的空泡結(jié)構(gòu)(如圖)；a期細胞核的染色質(zhì)高度分散、邊緣化；細胞凋亡的晚期，細胞核裂解為碎塊，產(chǎn)生凋亡小體。 （2）檢測凋亡標記物質(zhì)1、磷脂酰絲氨酸外翻分析(Annexin V法)磷脂酰絲氨酸(Phosphatidylserine, PS)正常位于細胞膜的內(nèi)側(cè)，但

9、在細胞凋亡的早期，PS可從細胞膜的內(nèi)側(cè)翻轉(zhuǎn)到細胞膜的表面，暴露在細胞外環(huán)境中(圖3)。Annexin-V是一種分子量為3536KD的Ca2+依靠性磷脂結(jié)合蛋白，能與PS高親和力特異性結(jié)合。將Annexin-V進行熒光素(FITC、PE)或biotin標記，以標記了的Annexin-V作為熒光探針，利用流式細胞儀或熒光顯微鏡可檢測細胞凋亡的發(fā)生。碘化丙啶(propidine iodide, PI)是一種核酸染料，它不能透過完整的細胞膜，但在凋亡中晚期的細胞和死細胞，PI能夠透過細胞膜而使細胞核紅染。因此將Annexin-V與PI匹配使用，就可以將凋亡早晚期的細胞以及死細胞區(qū)分開來。2、線粒體膜勢

10、能的檢測線粒體在細胞凋亡的過程中起著樞紐作用，多種細胞凋亡刺激因子均可誘導不同的細胞發(fā)生凋亡，而線粒體跨膜電位的下降，被認為是細胞凋亡級聯(lián)反應過程中最早發(fā)生的大事，它發(fā)生在細胞核凋亡特征(染色質(zhì)濃縮、DNA斷裂)消滅之前，一旦線粒體DYmt崩潰，則細胞凋亡不行逆轉(zhuǎn)。線粒體跨膜電位的存在，使一些親脂性陽離子熒光染料如Rhodamine 123、3，3-Dihexyloxacarbocyanine iodideDiOC6(3)、Tetrechloro-tetraethylbenzimidazol carbocyanine iodideJC-1、Tetramethyl rhodamine methy

11、l ester(TMRM)等可結(jié)合到線粒體基質(zhì)，其熒光的增加或減弱說明線粒體內(nèi)膜電負性的增高或降低。將正常培育的細胞和誘導凋亡的細胞加入使用終濃度為Rhodamine 123(1mM)或終濃度為DiOC6(25nM)，JC-1(1mM)，TMRM(100nM)，37°C平衡30min，流式細胞計檢測細胞的熒光強度。3、TUNEL法細胞凋亡中, 染色體DNA雙鏈斷裂或單鏈斷裂而產(chǎn)生大量的粘性3'-OH末端，可在脫氧核糖核苷酸末端轉(zhuǎn)移酶(TdT)的作用下，將脫氧核糖核苷酸和熒光素、過氧化物酶、堿性磷酸酶或生物素形成的衍生物標記到DNA的3'-末端，從而可進行凋亡細胞的檢測

12、，這類方法（稱為脫氧核糖核苷酸末端轉(zhuǎn)移酶介導的缺口末端標記法(terminal -deoxynucleotidyl transferase mediated nick end labeling, TUNEL)。由于正常的或正在增殖的細胞幾乎沒有DNA的斷裂，因而沒有3'-OH形成，很少能夠被染色。TUNEL實際上是分子生物學與形態(tài)學相結(jié)合的爭辯方法，對完整的單個凋亡細胞核或凋亡小體進行原位染色，能精確地反應細胞凋亡典型的生物化學和形態(tài)特征，可用于石蠟包埋組織切片、冰凍組織切片、培育的細胞和從組織中分別的細胞的細胞形態(tài)測定，并可檢測出極少量的凋亡細胞，因而在細胞凋亡的爭辯中被廣泛接受。（

13、3）DNA片斷化檢測1、大分子染色體DNA片段的測定細胞凋亡的早期,染色體斷裂成為50300 kbp長的DNA大片段。全部超過肯定分子量大小的雙鏈DNA分子在瓊脂糖凝膠中的遷移速度相同。線性DNA的雙螺旋半徑超過凝膠半徑時，即達到辨別力的極限。此時凝膠不再按分子量的大小來篩分DNA，DNA像通過彎管一樣，以其一端指向電場一極而通過凝膠，這種遷移模式稱之為"爬行"。因此，細胞凋亡早期產(chǎn)生的50300 kbp長的DNA大片段不能用一般的瓊脂糖凝膠電泳來分別。通常接受脈沖電泳技術可圓滿地解決這一問題。這個方法是在凝膠上外加正交的交變脈沖電場。每當電場方向轉(zhuǎn)變后，大的DNA分子便滯

14、流在爬行管中，直至新的電場軸向重新定向后，才能連續(xù)向前移動。DNA分子量越大，這種重排所需要的時間就越長。當DNA分子變換方向的時間小于電脈沖周期時，DNA就可以按其分子量大小分開。 2、DNA Ladder 測定細胞凋亡時主要的生化特征是其染色質(zhì)發(fā)生濃縮, 染色質(zhì)DNA在核小體單位之間的連接處斷裂, 形成50300 kbp長的DNA大片段, 或180200 bp整數(shù)倍的寡核苷酸片段, 在凝膠電泳上表現(xiàn)為梯形電泳圖譜(DNA ladder)。細胞經(jīng)處理后，接受常規(guī)方法分別提純DNA，進行瓊脂糖凝膠和溴化乙啶染色，在凋亡細胞群中可觀看到典型的DNA ladder。假如細胞量很少，還可在分別提純D

15、NA后，用32P-ATP和脫氧核糖核苷酸末端轉(zhuǎn)移酶(TdT)使DNA標記，然后進行電泳和放射自顯影，觀看凋亡細胞中DNA ladder的形成。3、凋亡細胞DNA含量的流式細胞計分析 （4）Caspase-3活性的檢測Caspase家族在介導細胞凋亡的過程中起著格外重要的作用，其中caspase-3為關鍵的執(zhí)行分子，它在凋亡信號傳導的很多途徑中發(fā)揮功能。Caspase-3正常以酶原(32KD)的形式存在于胞漿中，在凋亡的早期階段，它被激活，活化的Caspase-3由兩個大亞基(17KD)和兩個小亞基(12KD)組成，裂解相應的胞漿胞核底物，最終導致細胞凋亡。但在細胞凋亡的晚期和死亡細胞，casp

16、ase-3的活性明顯下降。1、western blot2. 熒光分光光度計分析活化的Caspase-3能夠特異切割D1E2V3D4-X底物，水解D4-X肽鍵。依據(jù)這一特點，設計出熒光物質(zhì)偶聯(lián)的短肽Ac-DEVD-AMC。在共價偶聯(lián)時，AMC不能被激發(fā)熒光，短肽被水解后釋放出AMC，自由的AMC才能被激發(fā)放射熒光。依據(jù)釋放的AMC熒光強度的大小，可以測定caspase-3的活性，從而反映Caspase-3被活化的程度。（5）凋亡相關蛋白TFAR19蛋白的表達和細胞定位分析TFAR19(PDCD5)是促進細胞凋亡的增加劑。利用熒光素(FITC)標記的TFAR19單克隆抗體為探針，對細胞凋亡過程中TF