1、平調飲對原發性肝癌患者AFPmRNA、MAGE-1mRNA表達的影響 作者：宋愛英,楊丹,曹德勝,李威,王麗芹【摘要】 目的 研究平調飲對原發性肝癌患者甲胎蛋白(AFP)mRNA、黑色素瘤抗原-1(MAGE-1)mRNA表達的影響,探討平調飲對原發性肝癌的抑癌基質。方法 原發性肝癌患者60例,隨機分為治療組和對照組,分別給予平調飲和華蟾素注射液,治療2個療程,采用RT-PCR技術檢測原發性肝癌患者治療前后外周血AFPmRNA、MAGE-1mRNA的表達,并取30例健康志愿者血樣作為參考對照,結果用SPSS13.0軟件統計。結果 平調飲使原發性肝癌患者的AFPmRNA、MAGE-1mRNA表達明

2、顯降低,2組治療前后比較差異均有統計學意義(P0.01),治療后治療組與對照組MAGE-1mRNA表達(灰度比)分別為0.07±0.01、0.13±0.02,組間比較差異有統計學意義(P0.01),治療組作用優于對照組。結論 平調飲能夠明顯降低原發性肝癌患者AFPmRNA、MAGE-1mRNA表達,對MAGE-1基因表達的降低作用優于對照組,說明抑制MAGE-1基因表達可能是平調飲抗肝癌機制的靶點之一。 【關鍵詞】 原發性肝癌；平調飲；黑色素瘤抗原-1基因；甲胎蛋白基因 Abstract：Objective To study the changes of expressio

3、n of AFPmRNA and MAGE-1mRNA in hepatocellular carcinoma (HCC) after oral Pingtiaoyin therapy, and explore its inhibitory action to HCC. Methods Sixty patients with HCC were randomly divided into treatment group (n30) and control group (n30). Oral Pingtiaoyin therapy and injection of Huachansu were g

4、iven for two courses of medical treatments to treatment group and control group respectively. RT-PCR was used to detect AFPmRNA and MAGE-1mRNA expression in peripheral blood of patients before and after treatment. At the same time, 30 healthy volunteers were selected as the control. The data was ana

5、lyzed by statistics of software SPSS13.0. Results The expression of AFPmRNA and MAGE-1mRNA were markedly decreased after oral Pingtiaoyin therapy. There was significant differences between before and after treatment in two groups (P0.01). The brightness ratio of the strap of MAGE-1 vs -actin after t

6、reatment in the treatment group and the control group was 0.07±0.01 and 0.13±0.02 respectively (P0.01), the result of the treatment group was better than that of the control group obviously. Conclusion Pingtiaoyin can effectively suppress the expression of AFPmRNA and MAGE-1mRNA in periphe

7、ral blood of human HCC, it was better than the control group in decreasing the expression of MAGE-1mRNA. Suppressing the expression of MAGE-1mRNA is possibly one of the function targets of the anti-tumor mechanism of Pingtiaoyin. Key words：hepatocellular carcinoma；Pingtiaoyin；MAGE-1mRNA；AFPmRNA 原發性肝

8、癌(Hepatocellular Carcinoma)是世界十大惡性腫瘤之一,據統計,每年全球新患肝癌人數為62.6萬人,因肝癌死亡者高達59.8萬人,居死亡原因第3位,而新發肝癌病例中55%發生于中國,我國的肝癌診治形勢十分嚴峻1。手術切除目前仍是肝癌首選的、最有效的治療方法,但在臨床中大多數肝癌患者在確診時已屬中晚期,手術機會多已錯過,且放、化療毒副反應大,療效較差。中醫藥作為綜合治療的組成部分,因其能穩定瘤體生長、改善癥狀體征、提高生存質量、延長生存期,故已被較多患者所接受。平調飲由黃芪、當歸、白芍、熟地黃、蚤休等藥物組成,是黑龍江中醫藥大學附屬第一醫院基于多年臨床實踐創立的中藥復方,在

9、臨床應用多年,對瘤體具有明顯的抑制作用,并有提高患者生活質量、延長生存期的作用。為闡明其抗肝癌機制及為臨床應用提供依據,我們觀察了平調飲對肝癌患者甲胎蛋白(AFP)及黑色素瘤抗原-1(MAGE-1)基因表達的影響,現報道如下。1 資料與方法1.1 一般資料 選取2007年10月2009年10月黑龍江中醫藥大學附屬第一醫院住院和門診原發性肝癌患者60例,隨機分為2組。治療組30例,男17例,女13例,平均年齡55.7歲；對照組30例,男20例,女10例,平均年齡56.7歲。2組患者性別、年齡、病程、病情輕重程度等方面差異無統計學意義(P0.05),具有可比性。健康組來自門診體檢的健康志愿者,共3

10、0例,男性15例,女性15例,平均36.2歲。1.2 診斷標準 符合1999年第四屆全國肝癌學術會議提出的原發性肝癌臨床診斷標準2。病理診斷：肝內或肝外病理學檢查證實為原發性肝癌。臨床診斷：AFP400 ?g/L,排除活動性肝病、妊娠、生殖系胚胎源性腫瘤及轉移性肝癌,并能觸及堅硬及有腫塊的肝臟或影像學檢查具有肝癌特征性占位性病變者；AFP400 ?g/L,有2種影像學檢查具有肝癌特征性占位性病變或有兩種肝癌標志物陽性及一種影像學檢查具有肝癌特征性占位性病變者；有肝癌的臨床表現并有肯定的肝外轉移病灶(包括肉眼可見的血性腹水或在其中發現癌細胞)并能排除轉移性肝癌者。1.3 納入標準 全部病例均經明

11、確的MRI、CT等影像學檢查,結合AFP或肝穿刺病理確診；患者年齡在1875歲；如經手術、放療、化療、介入治療、射頻消融等抗腫瘤治療,已結束1個月以上,而仍有實體瘤者；卡氏評分60分以上；預計生存期3個月以上；自愿接受臨床觀察者。1.4 排除標準 繼發性肝癌；不符合以上納入標準者；合并有嚴重心腦血管疾病、腎臟疾病、造血系統等原發性疾病以及精神病患者；正在服用其他中藥抗癌制劑或免疫調節劑(生物制劑)的患者；過敏體質或對本制劑過敏者。1.5 治療方法 治療組采用常規保肝治療,同時口服平調飲(黑龍江中醫藥大學藥廠制備),每日早晚各1次,每次150 mL。 對照組采用常規保肝治療,同時予華蟾素注射液(

12、批號030301、050515、060120,安徽金蟾生化股份有限公司,皖衛藥準字82884號)15 mL5%葡萄糖溶液250 mL靜脈滴注,每日1次。 2組均每3周為1個療程,療程間休息1周,共治療2個療程。治療中停止使用其他抗癌藥物,但允許必要時短時間給予對癥或支持治療。1.6 觀察指標與方法 治療組和對照組患者分別于用藥前、用藥后抽取周圍靜脈血液各10 mL,健康志愿者抽取一次10 mL靜脈血,采用常規方法分離單個核細胞,-70 保存。采用RT-PCR方法對AFPmRNA、MAGE-1mRNA表達進行檢測,反轉錄-聚合酶鏈反應(RT-PCR),具體方法如下：采用Trizol法提取標本的總

13、RNA,溶于DEPC處理過的水中。取少量樣本行分光光度測定和2%瓊脂糖凝膠電泳,以測定其純度、濃度和完整性。按照標準流程,單個試劑(M-MLV RT由Promega生產,貨號ML701；Rnase Inhibitor由寶生物工程有限公司生產,貨號D2313A；dNTP Mixture由寶生物工程有限公司生產,貨號D4030A)逐一完成反轉錄。MAGE-1mRNA引物1：5-TCTGTGAGGAGGCAAGGT-3,引物2：5-TGA TGGTAGTGGGAAAGG-3；AFPmRNA引物1：5-GCTGACCTGGCTACCA TA-3,引物2：5-AACTGTTGCTGCCTTTGT-3。反

14、轉錄反應體系為20 ?L,37 下擴增60 min,95 下變性5 min,4 保存。聚合酶鏈反應體系為50 ?L,94 下預變性5 min,94 下變性30 s,72 下延伸30 s；重復變性、退火、延伸35個循環；72 下充分延伸10 min,結束溫度為4 。取5 ?L產物,80 V下經2%瓊脂糖凝膠電泳30 min,利用凝膠電泳成像系統拍照,獲取條帶密度值和面積數據,利用與內標基因(ACTBmRNA)擴增產物的灰度比反映各基因轉錄表達水平。1.7 統計學方法 所有數據采用SPSS 13.0軟件進行統計學分析。數據均用(進)±s表示,以P0.05和P0.0l表示差異有統計學意義。

15、2 結果2.1 平調飲對原發性肝癌患者AFPmRNA表達的影響 2組治療前后AFPmRNA表達比較,差異均有統計學意義(P0.01)；2組治療后AFPmRNA表達比較差異無統計學意義(P0.05)；2組治療后與健康組比較,差異均有統計學意義(P0.05)。結果見表1。表1 平調飲對原發性肝癌患者AFPmRNA表達(灰度比)的影響(略)2.2 平調飲對原發性肝癌患者MAGE-1mRNA表達的影響 2組治療后MAGE-1mRNA表達均明顯降低(P0.01),但對照組治療后仍高于健康組(P0.05)；2組治療后MAGE-1mRNA表達比較差異有統計學意義(P0.01),平調飲組作用優于華蟾素注射液組

16、。結果見表2。表2 平調飲對原發性肝癌患者MAGE-1mRNA表達(灰度比)的影響(略)2.3 RT-PCR結果 ACTBmRNA、AFPmRNA和MAGE-1mRNA PCR產物分別為475、498、359 bp,在2%瓊脂糖凝膠電泳上可見清晰明顯的條帶(見圖1)。內參照ACTB的表達在各組間無明顯差異,治療組與對照組治療后AFPmRNA和MAGE-1mRNA的表達均比治療前明顯降低。3 討論原發性肝癌屬于中醫學“積聚”、“黃疸”、“臌脹”、“脅痛”、“癥瘕”等范疇,具有起病隱匿、潛伏期長、高度惡性、進展快、易轉移、預后差等特點。中醫學認為,肝癌的病因病機外有六淫之邪侵襲人體,內有飲食不節、

17、七情內傷、肝脾腎虛損等因素導致氣機阻滯、瘀血內停、濕熱郁蒸、火毒蘊結,日久而成。但作為外因的致病因素,一定要在陰陽不和、氣血虧虛和臟腑功能失調等內在虛損的基礎上才能導致癌瘤的發生,即所謂“正氣存內,邪不可干；邪之所湊,其氣必虛”。臨床上,原發性肝癌的患者多表現為臟腑虛損、氣血不足、陰陽失調,以陰血虛為主。平調飲是基于多年臨床實踐創立的中藥復方,具有補益氣血、調整陰陽、解毒散結的功效,本方以補血滋陰藥味居多,經臨床觀察治療效果良好。近些年中藥治療肝癌的研究逐漸增多,但大多停留在抑瘤作用的動物實驗和臨床觀察階段,或單味藥對肝癌治療作用的研究,未見復方中藥對肝癌患者MAGE-1mRNA與AFPmRN

18、A表達影響的系統研究報道。中藥復方是中醫辨證施治的體現,經過配伍更能發揮重要的作用。當前,肝癌的治療多采取中西醫結合的綜合治療方法,西醫更多注意的是局部治療,而中醫重視的是整體調理,因人而異,辨證施治,若二者有機結合,取長補短,定會相得益彰。MAGE是一類腫瘤特異性抗原,由位于X染色體長臂末端的MAGE基因家族編碼,由至少12個基因成員組成3。在肝癌組織中,MAGE-1基因呈特異性高表達4-5,而在肝硬變和正常肝組織中不表達。有研究表明,只有肝癌組織表達MAGE-1基因的原發性肝癌患者外周血中,才有可能檢測到相對應的MAGE-1mRNA,而健康志愿者外周血中未檢測到MAGE-1基因表達6。AF

19、P基因位于第4號染色體上,主要由胎兒肝細胞和卵黃囊合成,出生后即隨白蛋白的合成增多而迅速下降。AFP基因在正常成人肝細胞中僅微弱表達,在肝癌細胞中高表達。作為肝癌腫瘤標志物,據Yamashita等7報道,原發性肝癌患者癌組織中MAGE-1基因的陽性表達率為80%(16/20),Matsumura等8用巢式RT-PCR檢測肝癌患者外周血中的AFPmRNA,結果表明,33例患者中AFPmRNA的陽性率為52%(17/33)。因而,聯合檢測外周血中MAGE-1mRNA與AFPmRNA,二者互補,能增加檢測的特異性,提高準確率。本研究結果顯示,平調飲使原發性肝癌患者的AFPmRNA、MAGE-1mRN

20、A表達明顯降低,且在降低MAGE-1mRNA表達方面治療組作用優于對照組(P0.01)。平調飲為口服給藥,患者痛苦小,毒副反應輕,不失為一種較為理想的非手術治療肝癌的有效藥物。對于平調飲的抑癌機制,我們將進一步探討和研究。【參考文獻】 1 Parkin DM, Bray F, Feday J, et a1. Global cancer statistics, 2002J. CA Cancer J Clin,2005,55(2)：74108.2 中國抗癌協會肝癌專業委員會.原發性肝癌診斷標準J.中華肝臟病雜志,2000,8(3)：135.3 De Plaen E, Arden K, Traversari C, et al. Structure chromosomal localization, and expression of 12 genes of the MAGE familyJ. Immunogenetids,1994,40(5)：360369.4 Chen HS, Cai SL, Wang Y, et al. Expression of the MAGE-1 gene i