1、東南大學碩士學位論文生物細胞光學非線性成像技術研究 姓名:嚴丹申請學位級別:碩士專業(yè):光學工程指導教師:崔一平20080201摘 要雙光子熒光(Two Photon Fluorescence,TPF成像具有高穿透深度,離信噪比,低光損傷的 特點,二次諧波(Second Harmonic Generation,SHG技術婀具有探測深度深,對生物體的損 傷小,時間空間分辨率高以及對結構的對稱性敏感等特性,闋此艤光子熒光成像桐I二次諧波 成像成為近年米生物成像領域的研究熱點。.本論文首先舟緩了砹光子熒光拳l二次諧波的基本原理,綜述了這瑟種成像方法酶特煮及 其釹細胞成像中的應用。在此基礎上,論文闈繞上

2、述兩種方法進行了以”F的研究:r作:在雙光子熒光成像方囂,我們采磺自行合成豹苯乙烯基難乏啶鹽衍生物染料作為熒光標記, 基予熒光共焦顯微鏡獲得了高信嗓眈的般光予熒光成像。論文對染料溶液濃度、標記時聞等 影響熒光成像的因素進行了討論。此外,對染料的生物相容性,抗光漂向等特性進行了研究。 結卷表明,該類染料生物毒性小,標記細臌間細絲的能力較強,適合于K時間的細胞成像觀 測。最磊對鱺褥提高熒光成像的效采進行了展望。在二次諧波方面,首先概述了基于染料標記的二二次諧波細胞成像技術,特別是利用電壓 敏感染料,手性材料和金屬納米jiI子作為標記的兒種SHG細胞成像技術。實驗上,本論文研 究了金屬納米粒子的二次

3、諧波特性,勢探測到了基于金屬納米粒子聚集效應的二次諧波增強 特憔。另一方面,對銀膠和染料苯乙烯基毗啶鹽衍生物的復臺體系的二次諧波信譬進行了測 量,獲得了明顯增強的二次諧波信號。討論了影響增強因子的因素,包括銀納米粒子與染料 的混合比例、激發(fā)波&等。初步探討了增強的機制。最磊展望了該技術在生物成像領域的應 用前景。關鍵詞:雙光子熒光,二次諧波,細胞成像,標記,增強AbstractKey words:two photon fluorescence,second harmonic generation,cell imaging, label,enhacementII東南大學學位論文獨創(chuàng)性聲明

4、本人聲明所呈交的學位論文是我個人在導師指導下進行的研究工作及取得的 研究成果。盡我所知,除了文中特別加以標注和致謝的地方終,論文中不包含其 他人已經發(fā)表或撰寫過的研究成果,也不包含為獲得東南大學或其它教育機構的 學位或證書兩使用過的材料。與我一弱工作的同志對本研究所做的飪侮貢獻均已 在論文中作了明確的說明并表示了謝意。研究生簽名:東南大學學位論文使用授權聲明東南大學、中國科學技術信息研究所、國家圖書館有權保留本人所送交學位論 文的復印件和電子文檔,可以采用影印、縮印或其他復制手段保存論文。本人電 子文檔的內容積紙質論文的內容楣致。除在保密期內的保密論文外,允許論文 被查閱和借閱,可以公布(包括

5、刊登論文的全部或部分內容。論文的公布(包 括刊登授權東南大學研究生院辦理。曰期:加鏘、尋l第一章緒論1.1引言第一章 緒論生命科學是光子學的一個重要應用領域。生物光子學就是用光子米研究生命的科學,它 是光f學和生命科學相互交義、且相滲透而產生的邊緣學科。它涉及生物系統(tǒng)以光丫形式釋 放的能蕈與來自生物系統(tǒng)的光子的探測,以及這些光子攜帶的有關生物系統(tǒng)的結構與功能信 息,還包括利用光子對生物系統(tǒng)進行的加.工和改造。目前,生物光子學的主要研究內容主要 包括以卜.兒個方面:(1針對生命體系的特異和非特異性光學標記與探針;(2單粒子熒光與微區(qū)熒光分析;(3生物代謝超弱發(fā)光;(4生物體系中的1F線性光學效應

6、和量子光學效應;(5光鑷和單分子操作;(6激光共焦掃描顯微術;(7多光子熒光成像技術。在人類健康診斷和疾病治療方面,生物醫(yī)學成像已成為最可靠的方法之一。現在較多使 用的成像技術有X射線成像、計算機輔助層析成像(CAT掃描、超聲成像、核磁共振成像(MRI 等,然而這些技術主要集中在組織或器官層面的結構和解剖學意義上。只有把成像延伸劍細 胞和分子水平,獲取細胞和分子水平上的信息,才能實現在治療過程中對早期疾病(如癌癥 或早期分子變異的檢測。生物光子學成像基于生物體系中的光學效應,使用生命體系的特異或非特異性光學探針, 結合激光共焦掃描顯微技術,以實現對細胞、離體組織樣品等微小尺度的生物樣品離體或在

7、 體的無損傷成像。目前,生物成像技術的研究熱點主要包括:熒光成像,如單光子與雙光子熒光成像(壽 命成像,光譜成像,偏振成像,熒光漂白恢復測量,等等;散射成像;非線性光學成像(二 次諧波,三次諧波成像等;圖像處理與圖像分析方法,等等。這些基于成像技術對于生命 科學及其相關學科的發(fā)展具有非常重要的意義,在基因表達、蛋白質之間的相互作用、疾病 的早期診斷、藥學機理等方面的研究中發(fā)揮著重要作用。1.2激光共焦掃描顯微鏡技術特點在目前廣泛使用的各種成像技術中,共焦激光掃描顯微鏡是極其重要的一員。它的發(fā)展 是光學顯微鏡技術歷史上的一次革命12。3l。共焦激光掃描顯微鏡以光學系統(tǒng)的共焦成像為基 礎,結合光束

8、掃描技術和樣品掃描技術對樣品進行三維動態(tài)測量。它利用激光作為光源,在 光學設計時,采用共軛焦點(共焦技術,使光源、被照物點和探測器處在彼此對應的共軛位 置。光源經物鏡在樣品內聚焦成衍射極限的光點,其熒光(或反射光再次通過物鏡或聚光 鏡到達空間濾波器的共焦針孔內,由靠近針孔后面的探測接收器接收信號。通過掃描聚光點 在樣品內的位置對樣品進行三維成像。圖1.1為共焦激光掃描熒光顯微鏡的原理圖。它的關鍵 技術是共焦d、:j:L(pinhole的引入。由于共焦小孔的存在,探測器只接收來自物鏡焦點處的信 息,焦點以外的光被共焦小孔屏蔽。因而共焦激光掃描顯微鏡的分辨率要比常規(guī)光學顯微鏡 高,圖像清晰度也有所

9、增強。同時,共焦小孔的存在使顯微鏡具有三維成像的特點,這是常 規(guī)光學顯微鏡所不能比擬的1引。、尤源圖卜1共焦顯徼鏡光路圖自共焦激光掃描顯微鏡誕生以來,其應用集中在生物醫(yī)學領域。它的特點主要體現在樣 品的反射熒光的觀察中,土要原岡如下:(1反射熒光與常規(guī)顯微鏡相比更容易得到高清 晰度和高分辨率的二維圖像; (2便于保持理想的共焦光學系統(tǒng),移動樣品和進行三維掃 描。但是單光子熒光成像存在光損害、光降解、光漂白等現象,限制了共焦激光掃描顯微鏡 更廣泛的應用。1990年,美國康奈爾人學Denk_k。Fr-.人提出將雙光子熒光應川到共焦激光掃描 熒光顯微鏡中15i,較女.地克服了單光子熒光共焦掃描技術的

10、缺點,而且有著較高的空間分 辨率。同傳統(tǒng)的單光子激發(fā)共焦激光掃描熒光顯微鏡相比,雙光子共焦激光掃描熒光顯微鏡 的光源多采閣鎖模的151秒鈦寶彳i激光器,實現對樣品進行雙光子激發(fā)。另外,由于材料的雙 光子吸收強烈地依賴于激發(fā)光強,岡而在緊聚焦的條件下,雙光子吸收僅局域于物鏡焦點處 的空間體積入3的小范同內,使人fIJ可以或甚至不使用共焦小孔,就能得劍高清晰的三維 圖像,從而使共焦顯微鏡的設計大為簡化,易于操作。這是雙光子激發(fā)的一大優(yōu)勢。圖1.2是一般雙光子激發(fā)共焦激光掃描熒光顯微鏡的配置圖。Xy亨J接圖1-2雙光子激發(fā)共焦激光掃描熒光顯徽鏡的配置圖.在激光共焦掃描熒光顯微鏡中還可以探測到生物組織

11、的其它非線性光學效應,例如光 學二次諧波效應。二次諧波成像反映的是樣品本身的非線性光學性質,無需染料標記,可以 避免由此帶來的光毒性。因此,利用二次諧波成像技術,可實現對活體進行動態(tài)測量。特別 是二次諧波技術與激光掃描共焦顯微技術的完美結合而形成的二次諧波層析成像技術,在實 現1仁侵入式的活體檢查,疾病的早期診斷等生物醫(yī)學領域具有廣泛的戍用前景,是一種極具 發(fā)展?jié)摿Φ尼t(yī)學診斷技術,己成為國際上十分活躍的研究熱點。除需要不同濾色片外,二次諧波成像與艤光子熒光成像的實驗裝置基本相同,二者的成像信息相互補充。1.3雙光子熒光成像和二次諧波技術方法和特點如一:所述,雙光子熒光成像及二次諧波成像技術都具

12、有十分突出的優(yōu)點,成為人們研究 的熱點。我們比較_二者的特點分別如卜:一、雙光子熒光成像的特點:(1高空間局域性和高分辨率;(2艤光r熒光遠離激發(fā)波K,避免了激發(fā)光對熒光探測的影響,能實現暗場成像, 并且瑞利散射產生的背景噪盧小,圖像對比度高;(3焦點以外不發(fā)生漂白現象;(4可Hj紅外或近紅外激光作光源,紅外光在生物組織中的穿透力強,能對生物組織 的深層進行觀察成像。二、二次諧波成像特點(1二次渚波產生不包括任何光吸收,如將光源的頻譜選在樣品的吸收譜之外,則樣 品沒有熱損傷或者光致漂白發(fā)生:(2二次諧波的產生成早現一種對稱性的選擇,只發(fā)生在1F對稱介質中,例如界面或 者電場誘導非中心對稱環(huán)境。

13、岡此二次諧波技術尤其適用于某些研究,例如探測 細胞膜的結構和功能及細胞膜勢能誘發(fā)膜內偶極分子的隊列;(3二次諧波信號的波長嚴格是泵浦波K的一.仁,易于從泵浦光和熒光中分離出來。 雙光子過程激發(fā)的發(fā)射譜則是展寬譜;(4-二次諧波成像技術可以應用于非熒光樣品或組織。在實驗裝置上,兩種成像方法非常類似,區(qū)別儀在丁需要采用不同的濾波片。但顯然, 二次諧波成像過程與艤光子熒光成像過程是完全不同的。二次諧波成像實質上是利用介質的.(2二階非線性極化率X 的空間分布進行成像,而雙光子熒光成像是利用介質的雙光子吸收 系數的空問分布進行成像,由于介質的非線性極化率和介質的多光子吸收系數(正比于多光 子躍遷概率是

14、完全不同的物理量,因此,從物理本質上來說,這兩種成像方式是完全不同 的,它們獲取的介質空問結構信息也不相同。特別對丁具有中心對稱的介質,是很難利用二 .f2次諧波進行成像的,因為其二階非線性極化率C 為零,但選擇合適的激發(fā)光波長,則可 以獲得其雙光子熒光圖像。1.4論文主要工作雙光子熒光成像中選擇具有很高雙光子吸收截面的熒光染料作為標記,在低濃度的情 況下對細胞進行標記,可以獲得清晰的細胞熒光成像。利用熒光染料既能改善成像條件,又 能維持細胞正常的生存和發(fā)育。本論文主要使用Olympus F1uoViewTM FVl000熒光共焦顯微 鏡系統(tǒng)進行生物成像觀測,將Ti:sapphire-飛秒激光

15、引入熒光共焦顯微鏡,用于觀測雙光子熒 光成像。對,丁細胞熒光成像的研究,本論文首先選擇了兩種具有雙光子熒光特性的苯乙烯基吡 啶鹽衍生物染料作為標記。其次,對該染料的熒光特性進行了研究。在染料標記進細胞后, 可以觀察到清晰的細胞熒光成像,細胞形態(tài)良好。最后對于染料作為細胞標記的一系列特性 進行了探討,包括在細胞內的分散性、抗光漂白性等。此外,對染料溶液濃度、標記時間等 影響熒光成像的因素進行了討論。二次諧波成像技術對于結構對稱性敏感,適用于對處于對非中心對稱環(huán)境中的分子功能 的研究。由于細胞膜自身產生的SHG信號非常弱,難以探測到,因此人們采取了各種方法來 增大SHG信號的強度并提高成像的信噪比

16、,比如利用選擇電壓敏感染料,手性染料和量子點 等作為二次諧波染料進行標記,可以提高對于自身二次諧波信號較小的細胞的成像效果。本第一章緒論文對丁.染料和銀膠復合體系的二次i皆波信號的增強特性進行了研究。在研究金屬納米粒子的二次諧波特性的基礎上,討淪了基丁二金屬納米粒子聚集效應的_二 次諧波增強特性。另一方面,對銀膠和染料苯乙烯基吡啶鹽衍生物的復含體系以及對硝基苯 胺染料和銀膠的復合體系的二次游波信號分別進行了測精,均獲得了明顯增強的二次諧波信 號。討論了影響增強岡子的岡索,包括銀納米粒j二與染料的混合比例、激發(fā)波K等。初步探 討了增強的機制。最后展望了該妓術在生物成像領域的應JIj前景。第-=幸

17、活細胞熒光成像2.1引言第二章活細胞熒光成像當紫外或波K較短的可見光照射到某些物質時,這些物質會發(fā)射出各種顏色和不同強度 的可見光,而當光源停,I卜照射時,這種光線隨之消火。這種在激發(fā)光誘導卜.產生的光稱為熒 光,能發(fā)出熒光的物質成為熒光物質。盡管兒乎所有的物質分子都有吸收光譜,但不是所有物質都會發(fā)熒光。產生熒光必須具 備以下條什:(1該物質分子必須己有與_!ci射的光線相對慮的能級結構;(2必須具有較 高的熒光效率。許多吸光物質并不產生熒光,土要是因為它們將所吸收的能量消耗r與溶劑 分子或其它分子之問的相互碰撞中,還可能消耗于一次光化學反應中,因而無法發(fā)射熒光, 或熒光效率很低。原子熒光可分

18、為共振熒光、非共振熒光和雙光子熒光等。共振熒光是一個原子被特定波 長的光激發(fā)后,在其返回基態(tài)能級時發(fā)出和激發(fā)光相同波K的熒光。非共振熒光又分為斯托 克斯熒光和反斯托克斯熒光。前者的熒光波長比激發(fā)光的K,后者的熒光波長則比激發(fā)光的 短。艤光子熒光是源于同時吸收兩個光子的能量后躍遷至較高的激發(fā)態(tài),往馳豫返【丌J基態(tài)的 過程中發(fā)出熒光,闐而雙光子熒光的激發(fā)波長為單光子激發(fā)波長的二分之一。熒光染料經常使用在活細胞成像實驗中,用作單個蛋白分子,藥物或者其它生物分子標 記等,因此染料可以進行示蹤或反映活細胞的相互作用等。Schwartz等人(2003利用熒光 蛋白特異性靶定活細胞161,Tan等(2004

19、用激光掃描共焦熒光顯微鏡的方法研究了細胞信 號傳導系統(tǒng)中蛋白質,蛋白質相互作用的動力學過程171,Seisenberger等(2001首先利用單光 子熒光成像技術成功實時觀測劍了病毒感染Hela細胞的過程降j.在激光照射下,基態(tài)熒光分子或原f同時吸收兩個光子而成激發(fā)態(tài),這就是雙光子激發(fā) 過程。過去熒光通過入射激光束的錐形照明激發(fā)。由于只在焦點收集熒光,入量激發(fā)對于成 像效果并沒有改善,同時這還導致有毒物質的產生,改變并最終殺死被觀察的樣品。雙光子 熒光成像技術建立在廣泛采用的共焦熒光成像技術上,雙光子激發(fā)的激發(fā)波K被移至紅外波 長的區(qū)域,采用皮秒,皮秒和飛秒脈沖的高功率脈沖激光時,中等功率水平

20、不會破壞樣品, 而且使用此類激光器,光子密度足夠高,兩個光子可同時被染料吸收。所以激發(fā)僅在顯微鏡 焦點處發(fā)生,毒性和漂白較少。使.Ij具有很高雙光子吸收截面的熒光染料,在低濃度的情況 下對細胞進行標記,既能改善成像條件,又能維持細胞正常的生存和發(fā)育。此外,使用高效 雙光子吸收熒光團還可以降低激發(fā)激光束的強度,對細胞的損傷更小。由于雙光子熒光成像滿足生物成像中要求的低損傷高效率標記的特點,很多學者對于雙 光子熒光生物成像的特性非常關注。Oheim等人(2006對雙光子熒光技術做了較為全面的 闡述pJ。Jung等人(2004對活的老鼠腦部進行了單光子和雙光子熒光成像1101。Zoumi等人 (20

21、02利用同為二階非線性過程的雙光子熒光和二次諧波方法對細胞和細胞間質進行了成 像,兩種非線性方法對細胞結構成像相互補充J。還有更多利用雙光子熒光成像和二次諧 波成像相結合的手段進行細胞結構和相互作用的研究112.13J。2.2雙光子熒光原理簡介雙光子吸收是一種非線性光學現象,在強光激發(fā)下,介質通過一個虛擬中間態(tài)同時吸收 兩個光子,從基態(tài)躍遷到兩倍光子能量的激發(fā)態(tài)的過程f¨】.這種雙光予吸收過程的強弱,取 決于原子或分子體系相應的躍遷兒率或截面、光場與體系躍遷的共振或非共振特性以及光場 的強度。圖21為單雙光子吸收機理的示意圖。第一幸活細胞熒光成像S1%跚吣“ 島嚕t 笆3Virll坨

22、mate.一 u2LOul￥in81epho-two-l:pllolon Caoud 5詛協(xié) 圖21單雙光子吸收和熒光機理的示意圖。雙光子吸收截面是表示雙光子吸收強弱的物理鼉,其單位為:cmSphoton一。常用測 試方法包括非線性透過率法,上轉換熒光法,瞬態(tài)吸收法和四波混頻法。采用上轉換熒光法 計算雙光子吸收截面的公式為115】:一 一. ,C,盯,F。吼2q歹茄其中,下標r代表參比,s代表樣品,n是折射率,F是雙光子積分強度,是雙關子熒光 量子產率,由于雙光子量子產率很雉測定,通常假定單、雙光子熒光量子產率相同。雙光子 吸收過程以其特有的二維處理能力和極高的空間分辨本領而在生物、物理、化學

23、、醫(yī)學和微 電子技術等J.泛領域顯示山變革性的應片j潛力。近兒年來高效率的艤光子吸收材料得到很大 的發(fā)展。由丁高效艤光子吸收材料在艤光子熒光成像和顯微技術、3D信息存儲、光化學治 療、微加工、上轉換材料等方面的應用,引起了科學家們的巨人興趣,基于雙光子吸收過程 的分子設計、紐裝發(fā)性能研究成了光電子領域的熱門課題1161。在激光照射下,基態(tài)分子或原子吸收一個光子后躍遷到激發(fā)態(tài),隨后又弛豫到某一基態(tài), 同時以光子形式釋放能量而發(fā)出熒光,這一過程就是通常的單光子激發(fā)情況。而基態(tài)分子或 原子同時吸收兩個光子后躍遷到激發(fā)態(tài),隨后又弛豫到某共振能級態(tài),然后躍遷到某一基態(tài), 以光子形式釋放能量而發(fā)出熒光。這

24、種情況就是雙光子激發(fā)熒光過程。1961年,Kaiser等在CaF2:Eu什晶體中首次觀察到了這種雙光子激發(fā)現象。比如在單光 子激發(fā)情形下,NADH酶在350nm的光激發(fā)下產生450nm的熒光,而在艤光子激發(fā)情況下, NADH酶則需同時吸收兩個700nm的光子才能產450rim的熒光II¨。這就是說,雙光子技術可 以使我們無需使用紫外光源就能達到檢測紫外熒光探針的目的。單、雙光子熒光產生過程如圖2.2所示。由于雙光子激發(fā)所產生的熒光強度與激發(fā)光的 光強平方成正比,岡而與單光子激發(fā)的線性過程相比,雙光子激發(fā)就需要很強的激發(fā)光強。 由于單光子激發(fā)是非閉值過程,在整個激發(fā)光路里的樣品都發(fā)出熒

25、光,而對于雙光子激發(fā)而 言,只有在焦點處的微小區(qū)域內樣品才能吸收足夠的雙光子而發(fā)出熒光,這就使雙光子熒光 成像具有很高的空間局域特點。如圖2.2(b所示IJ引。(a鎊鎮(zhèn)鏜:平蠢圖2-2(a單光子激發(fā)下,樣品中光所經之處皆受到激發(fā)(b雙光子激發(fā)下,樣品中僅在光束聚焦面上受到激發(fā)。相對于單光子熒光而言,雙光子熒光使用紅外或近紅外激光作為光源,遠離激發(fā)波K=, 瑞利散射產生的背景噪聲小,圖像對比度高,可避免紫外光對樣品的傷害和使用紫外光學元 件的諸多限制。對細胞組織的毒性比較小,可延長對活體生物樣品的觀察時間。雙光子熒光 信號依賴-j:激發(fā)光強的平方,因此只有在焦點附近才有足夠的光子能量來激發(fā)。這種

26、1F線性 效應的強的局域特性限制了焦點外區(qū)域發(fā)光產生的背景干擾,具有高空問局域性和高分辨 率。此外,雙光子吸收截面小,因此焦點以外區(qū)域不會發(fā)生光漂白現象。同時,由丁.采刖紅 外光激發(fā),在生物組織中的穿透力強,能對生物組織的深層進行觀察成像i叼,并使得活生 物樣品可以在低卡擾下生長。另一方面,雙光子熒光成像也存在一些不足。由于生物組織有高度散射特性,岡此,隨 著激發(fā)深度增人,光強迅速減小。盡管增人激光平均強度可以提高雙光子熒光信號,但也將 導致更人的光損傷,從而使細胞失左活力。此外,叔光子熒光的高光子密度可能會產生高次 光子相互作用并產生比普通顯微鏡中更快的光漂白。為了改善光漂白特性,Chris

27、tophe等人 合成了具有抗光漂白特性的染料120,Alexander等人專門對雙光子熒光成像中的光損傷問題 進行了研剜2¨。2.3實驗儀器設備實驗中采用的主要儀器型號如下:l、激光掃描共焦顯微鏡:單光子熒光和多光予熒光的觀察是在OLYMPUS FluoViewTM FVl000熒光共焦顯微鏡上進行的,該顯微鏡配有Ar離子激光器(458nm,488nm和 543nm。單光子熒光成像使用Ar離子激光器(458nm作為激發(fā)光源,物鏡采用60×的浸油透鏡。2、飛秒激光器:采用Ti:sapphire飛秒激光器(Coherent美國相干公司產生的紅外激 光(波長700-960nm可調

28、,重復頻率76MHz進行雙光子激發(fā).雙光子熒光成像使 用800nm紅外激光作為激發(fā)光源,激光進入共焦顯微鏡前平均功率為22mw。線寬為 10。8nm。3、熒光光譜儀:采用Edinburgh Instruments公司的全功能穩(wěn)態(tài)/瞬態(tài)熒光光譜儀,型號為 FLS9004、Uv吸收光譜儀:采用Shimadzu公司的產品,型號為UV-3600PC。5、c02恒溫培養(yǎng)箱:采用Therme公司的產晶,型號為Ferma Series II。2。4實驗材料與方法實驗上采用了以下兩種染料分別進行細胞熒光標記成像的研究:苯乙烯基吡啶鹽衍生物 染料trans-4-【p一(9一ethylcarbazdevinyl一

29、Nmethypyridinium Iodide(以下文中簡稱;/,JCSPI染 料211trans-4一lp一(N,N-Diphenylaminostyryl-N-methylpyridinium Iodide(以下文中簡稱為 DPASPI染料。其中,csPI的結構如圖2.3所示,按照文獻的方法合成。合成步驟簡述如下:取8.69咔唑,69的4一氟苯甲醛和5.59叔J醇鉀在無水二甲基甲酰胺巾加熱劍110。持續(xù)36d、時,冷卻 舉謇溫,放置冰水中,Hj:氯甲烷從水層中分離出,有機層川冷水沖洗兩次。有機溶劑通過 脫水除去。再將得劍的棕黃色的漿重新濟丁.乙醇中,通過色譜分析利川法精制輕質溶劑汽油 混合

30、磚膠進行提純得劍。取CSPl染料溶丁.玄離子水,配成5×10-4M, 104M,2。5×105M濃 度溶液,超盧使分散均勻。H圖2-3CSPI染料結構式trails一4一【P一(9-ethylcarbazdevinyl卜N-methypyridinivm lodide(CSPIDPASPI染料的結構如圖2.4所示。按照文獻182J的合成方法合成,合成步驟簡述如下:取 4.99-Z.苯胺,3.09的二甲基甲酰胺混合進行反應,稍后,J1A309磷氧化物進行冰浴。混合溶液 回流一小時,倒入冰水,利用氫氧化鈉進行中和,過濾得-蟄JDPASPI染料。實驗中,馭DPASP染料溶丁.太離

31、子水,染料配成5×10一M,5×105M濃度溶液,超聲 使分散均勻,備娟。QNo圖2-4DPASPI染料結構式trans一4一p-(N,NDiphenylaminostyrylNmethylpyridinium Iodide(DPASPI.HeLa細胞購買于南京凱基生物科技有限公司。用含10%,b牛血清的DMEM培養(yǎng)液,、1 %青鏈霉素,于37"C含5%C02的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。實驗前接種3-3520cm培養(yǎng)皿中,培養(yǎng)24d', 時。DMEM、青鏈霉素、小牛血清均購自南京凱基生物科技有限公司。細胞標記的方法如下:培養(yǎng)皿中分別加入染料0.2ml,放入37&quo

32、t;C培養(yǎng)箱中培養(yǎng)數小時后, 吸取培養(yǎng)皿中的培養(yǎng)液,用PBS液洗滌5次,再加入PBS液2ml,進行觀察。2.5實驗結果與討論實驗內容主要包含以卜.兩個方面:1.觀察染料的單、雙光子熒光細胞成像,討論CSP!染料對細胞的標記能力。實驗對CSPl染料的吸收和熒光等光學特性進行了研究,將CSPl染料作為熒光染料標記 在細胞上之后,再分別采用458nm的激光_jfll800nm的激光作為光源,進行單光子和艤光子的 熒光成像。(1吸收譜和發(fā)射譜將CSPI染料溶丁.水中,濃度為2.5×10M,使用UV光譜儀測得其吸收譜,如圖2.5所示。 由圖可見,CSP!染料的吸收峰在417nm處,330nm附

33、近較小吸收峰為苯環(huán)的吸收峰。用熒光 光譜儀自帶氙燈為光源,482nm波長激發(fā),測得其單光子熒光光譜如圖26所示。由圖可見 染料CSPI水溶液的熒光峰位置在590nm左右。在熒光光譜儀中引入800nm匕秒激光作為激發(fā) 光源,測量染料的艤光子熒光,x義光子熒光光譜如圖27所示,熒光峰值位置與單光子相同。8%e2乏Wavelength(nmI蛩2-5CSPI染料5x 10。5M濃度水溶液的吸收光譜釜芝旦.量8C8療m塵。三u.Wavelength(nm圖2-6,482nm激發(fā)下,染料2.5x 10。M水溶液的單光子熒光光譜Wavelength(nm圖2-7800nm飛秒激光激發(fā)下染料2.5X 10濃

34、度水溶液的雙光子熒光譜(2細胞內熒光成像單光子熒光成像使用共焦顯微鏡自帶Ar離子激光器對CSPI染料標記的Hela細胞進行成像。激發(fā)波長為 458nm。圖2.8是細胞的單光子熒光成像。物鏡采用60倍浸油物鏡。掃描范圍為70.41am×52.272lam,象素為1600×1188pixel,掃描速度為101as/pixel。m.此幔像一目28459nm激發(fā)下5x10M濃度縶科標Z的自胞的單光子黃光戚像積光子熒光成像川csP】染料塒細胞進行標記厲枉共焦顯微鏡F進行戕光r熒光成像,使刪60倍浸汕物 鏡.光淵為Ti:sapphi re E秒激光器輸出的800hm馓光。E秒激光進入批

35、焦顯微鏡2前功率為 22row,線寬為108rim.掃描范嗣為704um×52272lam.象索為1600×II 88pixel,掃描 述腰為10岫mixel。實驗獲得細胞的般光F熒光成像如削2-9(a所示。目29(b址該細胞熒光像和細胞 透射成像重臺。透射成像和染料熒光成像位置的對席反映了熒光成像對于細胞形態(tài)反映的準 確性。吲時.也展示了細胞內染料的對庶分布情況。瀵 o。襲 t.Jj3:'、目2_9(a800nm教發(fā)T 5×I O-5M堆度染料標t自胞的月光f熒光成像(b特t自胞m子熒光威使和自胞遘射成像H§重告從CSPI染料對細胞杯記裝光成像

36、的結果可咀看.咳染料作為l|以標記生物體的水溶 性染料.單光子刊烈光子熒光敏半較高。熒光成像巾細胞清晰川見,細胞膜tu外界界線清楚。 細胞核巾染4進入報少.可見CSPI染料對核的標記能力比較弱。進入細胞內的CSPI染料染 料分布較山均勻,有部分聚焦現象.聚集處熒光比較強。經過12小時的染色.仍可以觀察到 眾多正在分裂的細胞.如幽2-iO左邊較大細胞為正在分裂中的細胞,細胞核己分裂成兩個. 但細胞質還未分開。結果發(fā)明,CSP染料染料的生物兼容性較好,對細胞毒害較小。此外, 實驗發(fā)現,該染料對細胞胞問細絲的標記能力較強,我們剃洲到丁清晰的處。細胞分裂末期 的胞間細絲的烈光于熒光幽像.如圖2一】I所

37、示。目2-10CSPI豢科(5xI O染色12十時后800hm教光礅發(fā)T,胞的&光子熒光成像.&邊鞍太自胞分裂中自胞,目見細胞植B舟裂戍M個.但自胞質還未分開目ill CSPI摯科(5x10M染色l 2十目月￥OOna擻光擻發(fā)T,自胞的m光子熒光成像自胞E&分裂為3個自胞.但是自胞舟裂豐期的胞閘自4的光子黃光成像仍清%irZ叔光r熒光的高光于密度可能會產生高次光_r相U怍¨J”產生比通顯微鏡巾史快的 光漂白。我Wj發(fā)現,采用濃度為5X101M的染料水溶液作為熒光標記的光漂白現琢較弱。 而聚州104M濃度的始料水溶液!lllj報容易發(fā)生光漂II現象。岡此將CSP

38、I染料染料在5X 10“M濃度r刈細胞進T12小時染色培養(yǎng)后進行觀察較為適。對t熒光染單對細胞的奄性.我 們也進“九口論。將5×j 04M的CSPI染料染料加入細胞中,放置14火厲觀察.發(fā)現細胞仍 然生K良好,形態(tài)d常,如凹2一12所示,上幽為染料標記12dql'寸_后觀察到的處丁分裂巾的細 胞,而在r斟中,經過14天染料標記的樣品中仍然能夠找到處丁分裂中的細胞,細胞的烈光 于熒光成像消晰,田此辯料并沒有影響細胞的n“常生理活動。另一方面,在細胞環(huán)境中,染 料性質沒有發(fā)牛政變,艱光子熒光效率依然較高。,見CSP染料染料對細胞的標記能力, o細胞的棉彝性m常好。*“戈m“像一目

39、212±目為CSPl染料f 5x】01M染色12小時后800nm激光澈發(fā)T,自胞的A光f黃光&倬. ”“引5“。箍;:囂盞i鼗j“光子“”1雖然染料對J:細胞的標記能力比較強,與細胞的隹物相袢性,抗光漂白的能力也較好, 世是在觀察過“cl一,當激光照射時間較長時,仍然觀察到細胞現捅亡的情況。由酗2.13可以看山,中間明亮處為兩個絀胞,激光持續(xù)J!Ii射F,州細胞產生捅亡小體。|胞外側的細 胞膜發(fā)生變化.擴jk泡泡形狀。一|目2一J 3CSPI染#5x1o】柴色I 2小時目800hm激光激發(fā)下.自胞的光黃光成像中目”亮弛為日十自胞,m自胞產±凋小體,自胞膜發(fā)生擴張2,

40、52DPASPI染料熒光細胞標記成像實驗內窖主要包含以F兩個方面:J觀察r染料的雙光子熒光細胞成像.討論rDPASPI染料對細胞的標jd能力2觀察了染料在細胞內的生物相容性和抗光漂白特性。笫一二章活細胞熒光成像(1吸收譜和發(fā)射潛將DPASPI染料配制成濃度為5×104M以及5×101M的水溶液,備J|J。DPASPI水 溶液的吸收譜如圖2.14所示,吸收峰鈕458nm。選川360nm波K激發(fā)單光1f熒光,測得染 料5×104M濃度水溶液的的單光子熒光光譜如圖2一15所示,熒光峰為585nm。在熒光光譜 儀中引入800nm匕秒激光,測得該染料水溶液的烈光子熒光光譜,

41、峰值位置與單光子熒光 光譜相同。8Ceo口Wavelength(nm圖2-145x 10-sM濃度DPASP染_:粵吸收譜線wavelength(nm圖215360hm激光激發(fā)下染料5x 10一|M濃度水溶液的的單光子熒光光譜,熒光峰在585nm處.(2染料標記成像用DPASPI染料對細胞進行標記后在共焦顯微鏡下進行了雙光子熒光成像,使用60倍 浸油物鏡,光源為Ti:sapphire飛秒激光器輸出的800nto激光。飛秒激光進入共焦顯微鏡之 前功率為22mw,線寬為10.8nm,掃描范圍為70.4um×52.272“m,象素為1600×1188 pixel,掃描速度為10l

42、as/pixei。圖2.16中,上圖為800nm飛秒激光激發(fā)下的雙光子熒光成像, 下圖為該細胞的透射成像。15*一5m撐目2】6±囤.自800nml秒激光墩發(fā)T染料5,10'm￥度m镕磕的光熒光成像下目為教光掃描的諄自胞透射成像實驗結果表明,DPASPI染料本身且有良好的熒光特性,在800rim光撒發(fā)下,烈光子熒 光較強,塒其作為般光于熒光染料對細胞進行標記后在批焦顯微鏡F進行熒光成像效果較 好,可以得到清晰的細胞的單光于和取光子熒光成像。染料進細胞之后分散較為均勻,細 胞形志清晰可見,有部分聚集現象.聚集處熒光比較強。仙是與CSPI染料相同,DPASPI染 料對丁細胞核的標

43、記能力同樣根弱.在熒光成像中不能反映細胞核的具體形態(tài)特征。相對于 CSPI染料染料而肓,DPASPI染料對J:細胞的標記能力和抗光漂白能力要弱一些。在激光照 射下,DPASPI染:很容易發(fā)生熒光漂白效應,因此不適實時長期對生物細胞過程的標記 和成像。第一二章活細胞熒光成像2.6總結采用Ar離子激光器輸出的458nm激光和摻鈦監(jiān)寶彳i匕秒激光器輸出的800nm激光作為 光源,我們利川染料標記對細胞進行了單光子和烈光f熒光成像,獲得了高信噪比、清晰的 熒光成像。實驗中使j了CSP!染料,DPASPI染料分別對細胞進行了標記成像,研究了兩種 染料作為活細胞熒光標記的特性。相比較而言,CSPI染料染料

44、的熒光成像效果比較女r,成像清晰,對細胞損傷小。成像 結果可以規(guī)察劍細胞的形態(tài)和分稚,并可以脫察劍細胞分裂末期細胞間相連接的細絲,表明 該染料的單,艤光子熒光效率較高,在細胞內的穩(wěn)定性較好,損傷比較小。此外,染料水溶 液的濃度和染色時間對成像的信噪比和抗光漂r1特性有較人影響。實驗結果表明,使用5X 10-4M濃度的染料水溶液對細胞染色12小時后觀察細胞熒光成像較為合適,此時進入細胞 的染料比較多,在細胞內分布較為穩(wěn)定,岡此成像細節(jié)清楚,信號強度較高。在染料對細胞 相察性的實驗中,細胞被CSPI染料標記14天期間,維持了正常的分裂活動,而且可以脫察 劍清晰的雙光子熒光成像,因此,CSPI染料染

45、料對細胞的相容能力比較好,染料分子在細 胞內比較穩(wěn)定,長時間可以保持較高的雙光子熒光效率,非常適合丁用作生物活動的長期實 時觀察。DPASPI染料對細胞的標記能力也比較強,可以觀察到細胞的單光子和雙光子熒光成像, 反映細胞的形態(tài),但是缺點是比較容易被漂白。在激光照射卜-,熒光猝滅得1卜常快,不適合 于對丁持續(xù)的生物過程的變化的觀察。由于長時間觀察,激光的能量會對細胞產生損傷,細 胞將產生凋亡小體。因此,改進染料的叔光子熒光效率,從而進一步減弱入射激光能量,減 少對細胞的傷害,同時又不降低清晰成像所需的艤光子熒光強度,是我們下一步的研究目標。 兩種染料還有一個共同的特點是染料不能或者僅有極少苗進

46、入細胞核,對丁.細胞核的形 態(tài)不能進行熒光標記。因此,需要對染料的結構進行進一步的優(yōu)化,提高染料的熒光效率, 提高抗光漂白特性,減少毒性,加強生物相容性,在保持高的熒光量子效率的同時,連接上 抗體或者酶等特異蛋白質,從而改善染料的靶向標記能力,對丁.細胞研究中關注的細胞核, 線粒體,DNA,RNA等部分進行特異性標記,為更好的研究其功能及變化提供手段。17箱二章二次i許波及jE增強特性硼f究3.1引言第三章二次諧波及其增強特性研究光學-二次諧波(Second Harmonic Generation,SHG是一種一:階非線性光學現象。這個 過程僅允許在1=中心對稱介質如m線性光學晶體中,或者是在

47、兩個中心對稱介質的界面處發(fā) 生。W此SHG技術尤其適jj丁.處丁非中心對稱環(huán)境中的分子功能的研究,有序界面或細胞膜、 結構蛋白序列等的研究。此外,SHG成像采j釘近紅外的飛秒激光作為光源,具有探測深度深, 對生物體損傷小,分辨率高的優(yōu)點。相對于雙光子熒光成像技術而言,二次諧波技術具有以下特點:(1二次諧波產生不 包括任何光吸收,光源的頻譜選在樣品的吸收譜之外的話,則樣晶沒有熱損傷或者光致漂白 發(fā)生。(2二次諧波生成警現一種對稱性的選擇,只發(fā)生在非對稱介質中才發(fā)生,例如界 面或者電場誘導1F中心對稱環(huán)境。因此二次喈波技術對于某些研究,例如探測細胞膜的結構 和功能及細胞膜勢能誘發(fā)膜內偶極分子的隊列

48、。雙光子過程不能選擇和探測非對稱性。(3 二次諧波信號嚴格是泵浦波長的一半,并可以很容易的從泵浦光和熒光中分開。戲光子過程 激發(fā)后的發(fā)射譜則是展寬譜。(4二次諧波成像技術可以被Hj在非熒光樣品和組織。繼Fine平llHansen最早應用SHG技術對生物體系進行研究之后F引,Feund等人在非中心對 稱結構的鼠尾膠原纖維中發(fā)現了SHG信號,并成功利用該信號獲得了SHG成像12川。研究發(fā) 現,膠原體是生物組織所產生的二次諧波中最主要的轉換源。大多數膠原體,包括膠原體l、 ll、lll、v和Xl可以組成膠原纖維。這些膠原纖維旱螺旋結構,因而具有一1F中心對稱性。可 以產生SHG信號。它們“泛分布丁骨

49、骼、肌腱、皮膚、角膜、韌帶和內臟器官中。值得注意 的是,膠原體1v不能組成膠原纖維,岡此不具備非中心對稱結構,不能產生SHG信號124J。 此外,組織中的另一種結構微管也能產生強二次諧波信號,比如細胞分裂過程中的紡錘 體。3.2二次諧波原理及其發(fā)展概況介質在強激光作用下,電極化強度與入射輻射的場強E之間的關系司以表不為:尸=X(1E+X(2E2+X(3E3+ (31 其中,P是感應極化強度,E是入射光的電場矢量,凡 是一階電極化率或線性電極化率, ,、,x舢、父分別為二階、三階非線性電極化率張量。x(2E2正是二次諧波等二階非線性第帝一:次滸波及je增強特r研究光學效應的根源。SHG產生的t要

50、條件是介質的_卜中心對稱性。在l乜偶極近似卜I,介質的二階電極化率張,-,鬣元 為零,不產生SHG。同時,SHG還需要滿足相位匹配條件,傳播中的倍頻光和不斷 產生的倍頻極化波之問保持相位一致,相互干涉,這樣一:次潴波輸i:最人1321。臺中心對稱 介質中,由丁每個分r都有各臼的方向,有的方向近乎是完全相反的,如圖3一l所示。al 8枷k.MediaX-C;u。j一X >予、。 /一.、聾 一、 /, 、。芝巾毒島i蠢,。M廟b“巾耋如,蘆 :蔓.蠢,M¨”嘩L山 jr式,口,”。 ? ?'“ 、,./,b,Intrrfh'ee c MicrosL.opic Su

51、r6c譬圖3-1(a是在介質體中,每個分子有一個方向,因此有的處于相反方向中,二階極化相互抵消,不產生SHG 信號。b在界面,由于不對稱的作用,分子方向特殊. 因此,界面區(qū)域可以產生StlB信號.(c在顯微鏡 表面,直徑在入射光波長尺度的粒子增加了相干性,在相反表面產生了E,。,也就是產生了SHG信號“”.由這些方向相反的分子引發(fā)的二階極化相位相反,所以抵消了,如圖3.1(曲。介質體中 沒有SHG信號產生。而在界面的分子與在體內的分子不同,它們對非中心對稱有貢獻,如圖 3.1(b。因此,界面上可以產生二次諧波場,從界面出射頻率為2(o的光。給出下式E劫%但-N s<僅“>瓦瓦 (2

52、式中,k是入射光的電場強度,N。是表面的密度,P2。是二二階極化強度。而二階極化率a(2, 包括界面的化學種類,尖括號表示分子方向的平均。最后探測刨的二次諧波場E2。與界面分 子的化學組成和結構排列直接相關。SHG被證明是個研究微粒子界面的新方法(Wang et a1., 1996I”J。因為局部區(qū)域的表面微粒子是非中心對稱的,即使微粒子是中心對稱的也可以由 基頻入射光照射產生界面二次諧波場,如圖3.1(c1341。細胞膜就屬于這類界面,可以產生界 面SHG信號。細胞膜是細胞內外選擇性物質運輸的通道和橋梁,是細胞抗原一抗體特異性識別的物 質基礎和位置。膜除了有物質轉運功能外,還有跨膜信息傳遞和

53、能量轉換功能。細胞外液中 的各種化學分子,并不需要自身進入它們的靶細胞后才能起作用,它們大多數是選擇性地同 靶細胞膜上具有特異的受體性結構相結合,再通過跨膜信號傳遞(transembrane signaling 或跨膜信號轉換(transmembrane sognal transduction過程,最后才間接地引起靶細胞膜的 電變化或其他細胞內功能的改變。因此對于細胞膜的研究對揭示細胞的生命活動和功能具有 十分重要的意義。19。q.-第二章二次衍波及je增強特性研究細胞膜f1身產生的SHG信號1卜常弱,雉以探測劍,岡此人們采取了各種方法米增人SHG 信號的強度并提高成像的信噪比。比如說使Hj-

54、些無毒或低毒害的SHG染料來標記細胞膜。 作為,卜物體內源性籃門的綠色熒光蛋白(GFP,Green Fluorescence Protein是一種生物相容性 1F常女r的內源性染料,Anisha等人利朋GFP對Hela細胞膜進行標記,獲得了艤光f熒光 (Two Photon Fluorescence,TPF成像和SHG成像I”1。而種類J“泛的外源染料,比如某些具 有電胝敏感特性的SHG標記則為膜電壓的實時探測尤其是腑神經信號傳導機制的研究提供 了年f效途徑。一些熒光標記兼只SHG信號,比如JPW和ANEP系州的染料,岡而它們可以 同時Jj丁.SHG_冪fI TPF成像。Paul等人在研究中發(fā)

55、現Di一4一ANEPPS,Di一8一ANEPPS,JPWl 259和JPW2080這四種染料盡管具有不同的分子結構,仇具有相胤的熒光發(fā)色墓團。內此,除 了可以和JYtJ這四種染料的TPF和SHG信號進行細胞標記成像以外,還可以利川它們的TPF 信號強度作為參考,對具有相同熒光基團的不同結構和手性特性的這四種染料的SHG信號 進行對比分析1361。關于染料標記的化學結構對其怍線性特性的影響,AlbertI”J,Thierry 13Sl 等人進行了深入的研究。另外,利Jj具有靶向性的蛋白質端特異性的靶定在樣品上,另一 端與染料連接,可以實現對樣品的特異性標記和成像ljI3910超瑞利散射(Hype

56、r Rayleigh Scattering,HRS技術是一種測量溶液或氣體中分子的一 階超極化率的有效jI:具。當高強度激光照射分子時,在散射光中可以檢測到以入射光頻為基 頻的二次諧波光子。這種現象就稱為超瑞利散射(HRS。它是一種1F相干的二階1F線性散 射過程,散射光的頻率恰好是入射光的二二倍。它的發(fā)生機理在于,強激光的照射引起中心不 對稱分子的電荷分布、極化態(tài)以及分子取向的改變,從而誘導出偶極f作為二次波源。同時 由于分子的濃度漲落及熱漲落引起誘導偶極矩的漲落,改變了分子局部環(huán)境的對稱性。破壞 了諧波的相干性,最終形成1F相干的二次散射。至丁具體的理論方法已有詳細的文獻報導 【404&#

57、168;。由以上敘述可以看到,HRS技術不僅實驗裝置簡單,易于實現,而且實驗方法和數 據處理方便易行。不僅如此,HRS技術還克服了傳統(tǒng)的SHG技術所存在的一些局限, 因 而能夠被使用來研究納米粒子的二階光學一1+線性。SHG技術是一種相干的方法, 通常用來 測定宏觀物體的二階非線性極化率C”。雖然后來發(fā)展的表面/界面SHG技術能夠被廣泛 用來作為表面和界面的探針|42,431,甚至擴展劍能夠探測微米和皿微米粒子的表面144,4引,成為 一種有效的表面/界面表征T具。但是對這種相干的SHG方法, 由于入射激光的有限的相 干K度,使得這種方法所能研究的樣品尺寸不能再小,而存在著一個卜限(微米到微

58、米114n471。顯然,對于納米尺寸的粒子體系,這種SHG方法已不適用。近20年來,納米粒子的三階非線性光學性質,如激子漂白效應、局域場效應、非線性 吸收和熒光以及粒子尺寸和表面修飾對非線性的影響等,已被廣泛研究。但是,由于艮期以 來人們認識(球形對稱的納米粒子沒有二階非線性和研究工具(傳統(tǒng)的相干SHG技術對 納米粒子的研究存在固有的尺寸限制的局限,納米粒子的二階光學非線性的研究一直被忽 視或很難進行。令人欣慰的是近四五年來,HRS技術,一種非相干二階光散射方法,或稱 做1卜相干二次諧波發(fā)生,被應用于研究納米尺寸粒子的二階光學非線性獲得成功,并取得了 一些重要的進展。HRS現象最初發(fā)現于1965年【4馴但由于當時激光技術和光檢測手段比較落 后,這項技術沒有得到廣泛應用。直至1991年,Clays等lZ馴再次提出并發(fā)展了HRS技術, 并首次測量了有機分子pN