1、蛋白質離子交換層析技術研蛋白質離子交換層析技術研究進展究進展蛋白質離子交換層析技術1 12 23 34 45 56 6 以離子交換劑為固定相，依據流動相中的以離子交換劑為固定相，依據流動相中的組分離子與交換劑上的平衡離子進行可逆組分離子與交換劑上的平衡離子進行可逆交換時的結合力大小的差別而進行分離的交換時的結合力大小的差別而進行分離的一種層析方法。一種層析方法。 蛋白質（以靜電引力為主）的離子交換層蛋白質（以靜電引力為主）的離子交換層析析兩性分子，不同兩性分子，不同pH，所帶電荷種類和數目不同，所帶電荷種類和數目不同高級結構，高級結構，大分子，大分子，多位點吸附多位點吸附除靜電力還有氫鍵、疏水

2、作用、范德華力等除靜電力還有氫鍵、疏水作用、范德華力等待分離的目標分子和雜質一起進入平衡后的離子交換劑，目標分子和待分離的目標分子和雜質一起進入平衡后的離子交換劑，目標分子和雜質因帶電量不同，與離子交換劑有不同的結合程度，通過逐漸增加雜質因帶電量不同，與離子交換劑有不同的結合程度，通過逐漸增加鹽離子濃度，將目標分子和雜質分別洗脫下來，從而實現目標分子和鹽離子濃度，將目標分子和雜質分別洗脫下來，從而實現目標分子和雜質的分離。雜質的分離。2.12.22.3基質應具備的特點：基質應具備的特點： 機械穩定性強，適合高流速機械穩定性強，適合高流速 化學穩定性好，在很寬的化學穩定性好，在很寬的pH范圍內保

3、持范圍內保持穩定，能耐去污劑、有機溶劑。穩定，能耐去污劑、有機溶劑。 球形，顆粒均勻。球形，顆粒均勻。 親水性。親水性。 高交換容量，要有較大的孔徑。高交換容量，要有較大的孔徑。平衡離子平衡離子：離子交換劑能結合溶液中可交離子交換劑能結合溶液中可交換離子的能力，通常用有效交換容量和實換離子的能力，通常用有效交換容量和實際交換容量來表示。際交換容量來表示。 膨脹度：膨脹度：干態的交換劑吸水后造成體積膨干態的交換劑吸水后造成體積膨脹的程度。脹的程度。 粒徑：一粒徑：一般都在般都在3-300m 交聯度及網孔結構：交交聯度及網孔結構：交聯度越高，機械強聯度越高，機械強度越好，耐壓性能越好。度越好，耐壓

4、性能越好。 電荷密度：電荷密度：基質顆粒單位表面積的取代基基質顆粒單位表面積的取代基數量。對于蛋白質，介質的電荷密度往往數量。對于蛋白質，介質的電荷密度往往較低。以免結合過牢，難以洗脫且易變性。較低。以免結合過牢，難以洗脫且易變性。粒徑粒徑分辨率分辨率，分離效果，分離效果，但流速，但流速實際交換容量實際交換容量有效交換容量有效交換容量 根據活性基團的酸堿性質和解離性質：根據活性基團的酸堿性質和解離性質： 酸堿性質：酸堿性質： 解離性質：解離性質：陽離子交換劑：活性基團為酸性，結合陽離子陽離子交換劑：活性基團為酸性，結合陽離子陰離子交換劑：活性基團為堿性，結合陰離子陰離子交換劑：活性基團為堿性，

5、結合陰離子強離子交換劑：強離子交換劑：活性基團為強酸強堿活性基團為強酸強堿弱離子交換劑：活性基團為弱酸弱堿弱離子交換劑：活性基團為弱酸弱堿類型類型名稱名稱英文符號英文符號陰離子陰離子強堿強堿季銨基季銨基Q Q季銨基乙基季銨基乙基QAEQAE弱堿弱堿二乙氨基乙基二乙氨基乙基DEAEDEAE陽離子陽離子強酸強酸磺丙基磺丙基SPSP磺乙基磺乙基SESE弱酸弱酸羧甲基羧甲基CMCM由于樹脂的孔徑過小，且電荷密度過高，疏水性過強由于樹脂的孔徑過小，且電荷密度過高，疏水性過強使得大分子結合過牢而不易洗脫，同時，會造成變性。使得大分子結合過牢而不易洗脫，同時，會造成變性。通常用于蛋白質的離子交換劑多為纖維素

6、等多糖類。通常用于蛋白質的離子交換劑多為纖維素等多糖類。n纖維素纖維素n葡聚糖葡聚糖n瓊脂糖瓊脂糖n高效型高效型n非孔型非孔型n聚乙烯醇型聚乙烯醇型 開放性長鏈，較大的表面積，吸附容量最開放性長鏈，較大的表面積，吸附容量最大大 離子基團少，排列稀疏，與蛋白質結合不離子基團少，排列稀疏，與蛋白質結合不太牢固，易于洗脫太牢固，易于洗脫 良好的穩定性，洗脫劑的選擇范圍廣良好的穩定性，洗脫劑的選擇范圍廣 目前使用交聯葡聚糖主要來自目前使用交聯葡聚糖主要來自Pharmacia公司，主要有公司，主要有4種類型，都是種類型，都是以以SephadexG為骨架為骨架 商品名分別為商品名分別為SephadexA-

7、25 SephadexC-25 SephadexA-50 SephadexC-50SephadexA-25以以SephadexG，即交聯，即交聯葡聚糖為骨架葡聚糖為骨架A:陰離子陰離子C:陽離子陽離子凝膠吸水值的凝膠吸水值的10倍倍2525為每克凝膠膨脹時吸水為每克凝膠膨脹時吸水2.52.5克克123TECHNOSepharose系列系列SepharoseCL-6BBio-Gel系列系列34m90m200m90m大孔珠狀大孔珠狀顆粒狀顆粒狀Q型型SP型型SepharoseHP弱型（弱型（DEAE，ANXCM）強型（強型（Q，SP）SepharoseFFQ型型SP型型SepharoseBBDE型

8、型CM型型 高效型：高效型：SOURCE系列、系列、MonoBeads系系列列剛性的骨架結構：高硬度、高流速剛性的骨架結構：高硬度、高流速親水表面：低特異性吸附親水表面：低特異性吸附 非孔非孔型型：MiniBeads系列系列所有的結合都發生在顆粒表面所有的結合都發生在顆粒表面液膜擴散小，快速；顆粒小，分辨率高液膜擴散小，快速；顆粒小，分辨率高 聚乙烯醇型：聚乙烯醇型：Toyopearl系列系列多孔型三維網狀結構，富含羥基，高度親多孔型三維網狀結構，富含羥基，高度親水水無孔型無孔型有孔型有孔型無孔型無孔型微孔型微孔型大孔型大孔型 高效型：高效型：SOURCE系列、系列、MonoBeads系系列列

9、剛性的骨架結構：高硬度、高流速剛性的骨架結構：高硬度、高流速親水表面：低特異性吸附親水表面：低特異性吸附 非孔非孔型型：MiniBeads系列系列所有的結合都發生在顆粒表面所有的結合都發生在顆粒表面液膜擴散小，快速；顆粒小，分辨率高液膜擴散小，快速；顆粒小，分辨率高 聚乙烯醇型：聚乙烯醇型：Toyopearl系列系列多孔型三維網狀結構，富含羥基，高度親多孔型三維網狀結構，富含羥基，高度親水水3.13.23.3 按規模：按規模：分析型分離，一般用柱色譜；大分析型分離，一般用柱色譜；大規模工業化分離，有柱色譜、膨脹床吸附、規模工業化分離，有柱色譜、膨脹床吸附、分批分離等多種模式分批分離等多種模式

10、按目的：在預處理和初分級階段，目的是按目的：在預處理和初分級階段，目的是提取和濃縮目標分子；在細分級和最后的提取和濃縮目標分子；在細分級和最后的精制階段，目的是去除雜質，獲得單一組精制階段，目的是去除雜質，獲得單一組分。分。 目標分子的大?。哼x擇合適孔徑的基質目標分子的大小：選擇合適孔徑的基質 目標分子的電荷及目標分子的電荷及pH穩定性：穩定性： 在起始緩沖液中，目標分子和介質的功在起始緩沖液中，目標分子和介質的功能基團帶相反的電荷，以利于目標分子結能基團帶相反的電荷，以利于目標分子結合在色譜柱上，合在色譜柱上， 起始相洗脫，雜質和介質的功能基團帶起始相洗脫，雜質和介質的功能基團帶相反的電荷，

11、從而吸附在色譜柱上。這時，相反的電荷，從而吸附在色譜柱上。這時，收集流穿峰即可。收集流穿峰即可。 通常用高徑比較小的柱子通常用高徑比較小的柱子離子交換柱的高度一般在離子交換柱的高度一般在5-20cm確定基本參數后，可通過直徑確定基本參數后，可通過直徑擴大分擴大分離規模。離規模。 緩沖離子：與功能基團帶相同的電荷緩沖離子：與功能基團帶相同的電荷 pH：蛋白質的：蛋白質的pI緩沖液的緩沖液的pH緩沖液緩沖液的種類的種類 離子強度：離子強度離子強度：離子強度利于洗脫，不利利于洗脫，不利于吸附于吸附4.14.24.34.44.5 預裝柱：預裝柱：SOURCE、MonoBeads、MiniBeads系列

12、系列 無需處理，直接使用。無需處理，直接使用。 濕膠濕膠：無需預處理，使用前傾去上清，添：無需預處理，使用前傾去上清，添加起始緩沖液，攪勻后裝柱即可加起始緩沖液，攪勻后裝柱即可 干膠干膠：需溶脹。通常室溫：需溶脹。通常室溫1-2d，沸水浴，沸水浴2h。 Sephadex系列：不能用蒸系列：不能用蒸餾水，避免強烈攪拌。餾水，避免強烈攪拌。 纖維素系列：纖維素系列： 制造制造的過程中，產生一些細顆粒，將的過程中，產生一些細顆粒，將纖維素在水中攪纖維素在水中攪 勻后，自然沉降，傾勻后，自然沉降，傾去上清漂浮物，反復數次即可。去上清漂浮物，反復數次即可。 制造完后，未經處理，含很多雜質成制造完后，未經

13、處理，含很多雜質成分，需洗滌，用分，需洗滌，用 0.5mol/L的的NaOH和和0.5mol/L的的HCl進行進行“堿堿-酸酸-堿堿”反復浸反復浸泡，每次半小時，期間用蒸餾水洗至中性。泡，每次半小時，期間用蒸餾水洗至中性。4.2裝柱、平衡 裝柱：排空柱底部的死體積，輕輕攪勻交裝柱：排空柱底部的死體積，輕輕攪勻交換劑與緩沖液的混合液，玻棒引流，使液換劑與緩沖液的混合液，玻棒引流，使液體沿柱壁流下，盡可能一次性注入，讓介體沿柱壁流下，盡可能一次性注入，讓介質自然沉降。質自然沉降。 保持柱的垂直狀態，防止產生氣泡、防保持柱的垂直狀態，防止產生氣泡、防止分層。止分層。 平衡：用起始緩沖液平衡，檢測下端

14、流出平衡：用起始緩沖液平衡，檢測下端流出液與起始緩沖液在液與起始緩沖液在pH、電導、離子強度、電導、離子強度方面是否達一致。方面是否達一致。 對于弱離子交換劑，本身具有一定的緩對于弱離子交換劑，本身具有一定的緩沖能力，平衡時間很長。通常用酸或堿將沖能力，平衡時間很長。通常用酸或堿將pH調至起始調至起始pH；或用與起始緩沖液；或用與起始緩沖液pH相相同，但離子強度更大的緩沖液，加快同，但離子強度更大的緩沖液，加快pH平衡，最后用起始緩沖液平衡。平衡，最后用起始緩沖液平衡。4.3上樣、洗滌 上樣上樣 加樣量：目的物含量為有效交換容量的加樣量：目的物含量為有效交換容量的10-20%。 方法：方法：

15、預裝柱，通過恒流泵加樣。預裝柱，通過恒流泵加樣。 自裝柱，采用排干法：自裝柱，采用排干法： 加樣時，不能攪動床面，要保持床面的加樣時，不能攪動床面，要保持床面的完整。完整。 洗滌洗滌 加樣完后，用起始緩沖液填滿柱上端，加樣完后，用起始緩沖液填滿柱上端，擰緊上口，用恒流泵泵入起始緩沖液擰緊上口，用恒流泵泵入起始緩沖液 緩沖離子：與功能基團帶相同的電荷緩沖離子：與功能基團帶相同的電荷 pH：蛋白質的：蛋白質的pI緩沖液的緩沖液的pH緩沖液緩沖液的種類的種類 離子強度離子強度：離子強度離子強度利于洗脫，不利利于洗脫，不利于吸附于吸附 -般采用分部洗脫和連續洗脫。般采用分部洗脫和連續洗脫。 分部洗脫：

16、分部洗脫：幾種不同洗脫能力的緩沖液相幾種不同洗脫能力的緩沖液相繼進行洗脫繼進行洗脫優點：設備和操作簡單；洗脫迅速；洗脫優點：設備和操作簡單；洗脫迅速；洗脫液體積小液體積小缺點：性質相近的組分不易分開；同一組缺點：性質相近的組分不易分開；同一組分出現多個峰分出現多個峰 連續洗脫連續洗脫：逐漸增強洗脫緩沖液的洗脫能：逐漸增強洗脫緩沖液的洗脫能力，分辨率力，分辨率 一般，高濃度鹽（通常是一般，高濃度鹽（通常是2M的的NaCl）溶）溶液清洗液清洗 對于一些結合較牢固的物質，如變性的蛋對于一些結合較牢固的物質，如變性的蛋白，沉淀而聚集的蛋白，疏水性蛋白或脂白，沉淀而聚集的蛋白，疏水性蛋白或脂蛋白等一些膠

17、狀物，用酸和堿洗脫蛋白等一些膠狀物，用酸和堿洗脫 疏水性更強的蛋白、脂蛋白以及脂類，用疏水性更強的蛋白、脂蛋白以及脂類，用非離子去污劑或有機溶劑（非離子去污劑或有機溶劑（70%的乙醇或的乙醇或30%異丙醇）逆向清洗。異丙醇）逆向清洗。纖維素：纖維素：葡聚糖葡聚糖：避免在：避免在pH小于小于3的環境，可用的環境，可用1M的的NaAC 0.5M的的NaOH交替清洗。交替清洗。5.5.15.25.35.4n增加柱壓并輕敲柱壁的方法以除去氣泡，增加柱壓并輕敲柱壁的方法以除去氣泡，確保在引入任何溶液時不要產生氣泡確保在引入任何溶液時不要產生氣泡n樣品蛋白質損失量允許的情況下，支撐樣品蛋白質損失量允許的情

18、況下，支撐物應取出并清洗物應取出并清洗n用高徑比較小的柱子用高徑比較小的柱子n過柱前的樣品要超聲或超濾處理過柱前的樣品要超聲或超濾處理n產生氣泡產生氣泡n樹脂基質發生粘連樹脂基質發生粘連n層析柱太細層析柱太細n細小顆粒堵柱細小顆粒堵柱n降低初始上樣緩沖液離子強度降低初始上樣緩沖液離子強度n注意計算蛋白質的等電點注意計算蛋白質的等電點n樹脂應充分平衡或用嚴格的再生方法樹脂應充分平衡或用嚴格的再生方法n初始上樣緩沖液離子強初始上樣緩沖液離子強度過大度過大n樹脂樹脂pH值因解吸作用值因解吸作用而發生變化而發生變化n樹脂未進行適當平衡或樹脂未進行適當平衡或再生的樹脂未洗凈再生的樹脂未洗凈n樹脂上的蛋白

19、質未洗凈樹脂上的蛋白質未洗凈npH值不合適或蛋白質值不合適或蛋白質發生沉淀發生沉淀n水解酶破壞了目的蛋白水解酶破壞了目的蛋白或樹脂中有微生物滋生或樹脂中有微生物滋生n增強溶液離子強度；更換活性高的反離增強溶液離子強度；更換活性高的反離子或使用去垢劑等方法解決。子或使用去垢劑等方法解決。n適當調節適當調節PHn蛋白提取過程中應加水解酶抑制劑抑制蛋白提取過程中應加水解酶抑制劑抑制蛋白水解蛋白水解n流速太快或層析柱過短流速太快或層析柱過短n梯度洗脫時洗脫液濃度梯度洗脫時洗脫液濃度變化太快變化太快n上柱蛋白質過多上柱蛋白質過多n降低流速降低流速n可采用連續洗脫等梯度變化較慢的洗脫可采用連續洗脫等梯度變

20、化較慢的洗脫n減少上樣量減少上樣量6.16.2 Bio-Rex70層析分離眼鏡蛇神經毒素的層析分離眼鏡蛇神經毒素的6種單乙?；苌锓N單乙?；苌?眼鏡蛇神經毒素，一種小分子堿性蛋白，眼鏡蛇神經毒素，一種小分子堿性蛋白，分子中分子中6個氨基（個氨基（5個側鏈個側鏈Lys殘基和一個殘基和一個游離的游離的N端氨基）均能被乙酰化生成乙酰端氨基）均能被乙酰化生成乙?；苌锘苌?形成的形成的6種單乙?；苌镏袃舴N單乙酰基衍生物中凈電荷數相同，但表面的電荷分布不同。據電荷數相同，但表面的電荷分布不同。據此，可以用此，可以用Bio-Rex70將它們分開。將它們分開。 兩步連續離子交換制備色譜分離純

21、化兩步連續離子交換制備色譜分離純化PEG-rhG-SCF 蛋白質聚乙二醇化的反應，生成非蛋白質聚乙二醇化的反應，生成非PEG化蛋白和不同程度的化蛋白和不同程度的PEG化蛋白的混合化蛋白的混合物。因蛋白質物。因蛋白質PEG化程度越高，其等電化程度越高，其等電點越低，根據電荷量的差異，通過點越低，根據電荷量的差異，通過SP-SepharoseFF和和SOURSE Q30作為陽、作為陽、陰離子色譜連續兩步將之分離開來。陰離子色譜連續兩步將之分離開來。 蛋白質蛋白質PEG化程度越高，其等電點越低?；潭仍礁撸涞入婞c越低。 在陽離子交換色譜，在陽離子交換色譜，PEG化蛋白與介質化蛋白與介質結合較弱，主要出現在流穿峰中，通過洗結合較弱，主要出現在流穿峰中，