1、可溶性TAT PTD-Ngb融合蛋白的原核表達、鑒定與純化及其對皮質(zhì)神經(jīng)元的跨膜轉(zhuǎn)導(dǎo) 作者：周國鈺， 胡學(xué)強， 胡 駿， 陸正齊， 樓之茵， 朱燦勝， 熊潔萍【摘要】 【目的】 構(gòu)建含蛋白轉(zhuǎn)導(dǎo)域(protein transduction domain, PTD)與腦紅蛋白(neuroglobin, Ngb)融合基因的表達質(zhì)粒，原核表達可溶性TAT PTD-Ngb，并鑒定、純化，檢測TAT PTD-Ngb對皮質(zhì)神經(jīng)元的跨膜轉(zhuǎn)導(dǎo)功能。【方法】 提取SD大鼠腦組織總RNA，通過RT-PCR法構(gòu)建編碼TAT PTD-Ngb的融合基因，克隆入pET28b原核表達載體，轉(zhuǎn)化入大腸桿菌BL21（DE3）pL

2、ysS，誘導(dǎo)表達，表達產(chǎn)物進行SDS-PAGE、Western-blot分析及可溶性鑒定，利用所表達的目的蛋白上的6個組蛋白用Ni-NTA瓊脂進行親和層析純化，將不同濃度純化的融合蛋白與原代培養(yǎng)皮質(zhì)神經(jīng)元共孵育2 h，用Western-blot分析融合蛋白的跨膜轉(zhuǎn)導(dǎo)?！窘Y(jié)果】 成功構(gòu)建了含有TAT PTD-Ngb的原核表達載體，插入片段500 bp，成功表達并純化了可溶性TAT PTD-Ngb融合蛋白，相對分子質(zhì)量約為20 k，Western blot鑒定顯示表達蛋白具有抗原性，并具有轉(zhuǎn)導(dǎo)入原代培養(yǎng)皮質(zhì)神經(jīng)元的功能，隨給予蛋白濃度的增高進入神經(jīng)元內(nèi)的融合蛋白量增高?！窘Y(jié)論】 可溶性融合蛋白TA

3、T PTD-Ngb可轉(zhuǎn)導(dǎo)入皮質(zhì)神經(jīng)元，對進一步研究Ngb的功能及蛋白轉(zhuǎn)導(dǎo)技術(shù)的應(yīng)用奠定了基礎(chǔ)。 【關(guān)鍵詞】 蛋白轉(zhuǎn)導(dǎo)域； 腦紅蛋白； 可溶性原核表達 合入擴增的Ngb 5端，構(gòu)建含有TAT PTD-Ngb融合基因的原核表達質(zhì)粒，誘導(dǎo)表達、鑒定及純化，用原代培養(yǎng)的原代皮質(zhì)神經(jīng)元對其跨膜轉(zhuǎn)導(dǎo)功能進行檢測，為下一步利用蛋白轉(zhuǎn)導(dǎo)技術(shù)研究Ngb在神經(jīng)系統(tǒng)內(nèi)的功能奠定基礎(chǔ)，提供新的方法。 1 材料與方法 1.1 材料 1.1.1 質(zhì)粒和菌株 T7 RNA聚合酶調(diào)控的表達質(zhì)粒pET28b及表達T7 RNA聚合酶的大腸桿菌BL21（DE3）plysS購自Novagen公司；pMD19-T simple載體購自

4、大連寶生物工程公司；大腸桿菌DH5由本校藥理學(xué)教研室胡駿博士贈送。 1.1.2 試劑 Trizol試劑購自Invitrogen公司；合成cDNA第一鏈的逆轉(zhuǎn)錄試劑盒購自Fermentas公司；Taq DNA聚合、T4 DNA連接酶和各種限制性內(nèi)切酶購于大連寶生物工程公司；X-gal、IPTG購于AMRESCO公司；質(zhì)粒抽提試劑盒、膠回收純化試劑及Ni-NTA蛋白親和純化瓊脂購于QIAGEN公司；抗His-Tag小鼠單克隆抗體購于TIAGEN公司，羊抗小鼠二抗購于武漢博士德生物技術(shù)有限公司；氨芐青霉素、卡那霉素、氯霉素均為SIGMA分裝；ECL試劑購自PIERCE公司；Neurobasal培養(yǎng)基

5、及B27購自Gibco公司。其余常規(guī)試劑均為進口或國產(chǎn)分析純。 1.1.3 PCR引物 根據(jù)Genbank中大鼠Ngb和TAT-PTD基因序列設(shè)計了兩條引物，即在Ngb成熟肽基因序列的5端融合了含有PTD基因序列，由上海生工生物技術(shù)有限公司合成。上游引物：5CATATGAGGAAGAAGCGGAGACAGCGACGAAGA GCTAGCATGGAGCGCCTAGAGTCAGAGCT 3（含Nde、Nhe酶切位點）；下游引物：5 GAGCTCTA CTCCCCGTCCCAGCCTCG 3（含Sac酶切位點）。擴增產(chǎn)物片段500 bp。 1.1.4 實驗動物 SD乳鼠由中山大學(xué)實驗動物中心提供。

6、.2 TAT PTD-Ngb基因的克隆 1.2.1 RT-PCR擴增TATPTD-Ngb基因 取SD乳鼠腦組織用Trizol試劑提取腦組織總RNA，按逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說明合成cDNA第一條鏈，取2 逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物進行PCR，反應(yīng)條件如下：94 預(yù)變性5 min ，94 30 s、68 40 s、72 1 min ，循環(huán)30次，72 延伸10 min。PCR 產(chǎn)物進行0.15 g/L瓊脂糖電泳分析，并對目標(biāo)條帶切膠回收。 1.2.2 PCR產(chǎn)物的克隆與測序 PCR 產(chǎn)物經(jīng)膠回收純化后與pMD19-T simple載體用T4 DNA連接酶16 連接2 h，轉(zhuǎn)化DH5感受態(tài)，涂布于含氨芐青霉素的LB 平板上

7、，菌落經(jīng)藍白班篩選，抽提質(zhì)粒經(jīng)Nde / Nhe限制性內(nèi)切酶雙酶切鑒定，選取含目標(biāo)片段的單克隆菌落并送上海英駿生物技術(shù)有限公司測序。 1.2.3 TAT PTD-Ngb表達質(zhì)粒的構(gòu)建 用Nde / Nhe限制性內(nèi)切酶從陽性TA克隆載體上切下TAT PTD-Ngb基因序列并膠回收，與同樣酶切的含His-tag的pET28b表達載體16 連接反應(yīng)2 h，構(gòu)建表達質(zhì)粒pET-TAT PTD-Ngb，簡稱pETPN，轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5感受態(tài)，涂布于含50 g/ mL卡那霉素的LB平板上，挑選菌落、質(zhì)粒抽提并經(jīng)酶切鑒定篩選陽性單克隆，送上海英駿生物技術(shù)有限公司測序。 1.3 TAT PTD-Ngb融合蛋

8、白的表達、純化與鑒定 1.3.1 TAT PTD-Ngb融合蛋白的表達及可溶性分析 經(jīng)酶切鑒定的pETPN質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21（DE3）plysS感受態(tài)，形成穩(wěn)定的高表達細(xì)菌株，在含50 g/ ml卡那霉素的LB平板上劃單菌落，挑取單菌落接種于5 ml LB培養(yǎng)液中(含卡那霉素50 g/ mL，氯霉素37 g/mL)，37 200 r/ min 振搖過夜；次日按1 100的比例接種至10 mL上述 LB培養(yǎng)液中，37 200 r/min振搖，培養(yǎng)約23 h，A值至0.6左右，加入終濃度為0.4 mmol/L 的IPTG，37 200 r/min誘導(dǎo)表達0，1，2，4，6，8 h，離心收集細(xì)

9、菌沉淀，按10 1的比例的加入20 mmol/L Tris·Cl溶液，超聲破碎細(xì)菌，SDS-PAGE電泳分析蛋白表達情況。取誘導(dǎo)表達8 h的細(xì)菌沉淀超聲破碎產(chǎn)物4 下15 000× g 離心30 min，分別收集上清和沉淀，加入SDS-PAGE電泳上樣緩沖液，檢測上清和沉淀中TAT PTD-Ngb融合蛋白的表達。 1.3.2 TAT PTD-Ngb融合蛋白的Wester blot分析 取誘導(dǎo)表達8 h上清經(jīng)SDS-PAGE 電泳，電泳完畢把蛋白轉(zhuǎn)印硝酸纖維膜上，0.5 g/L脫脂奶粉封閉2 h，抗融合蛋白6×His-tag單克隆抗體4 過夜孵育， HRP標(biāo)記的二抗

10、室溫孵育1 h，TBST洗膜，ECL試劑曝光顯影定影分析。 1.3.3 可溶性TAT PTD-Ngb融合蛋白的純化、脫鹽與儲存 收集誘導(dǎo)表達8 h的細(xì)菌沉淀，用含10 mmol/L咪唑的溶解緩沖液重懸菌體，超聲破碎后離心收集上清，然后加入Ni-NTA樹脂，之后分別用含20 mmol/L，250 mmol/L咪唑的緩沖液純化表達的TAT PTD-Ngb融合蛋白。純化蛋白經(jīng)PD-10脫鹽柱進行脫鹽，溶于含100 mL/L甘油的Neurobasal培養(yǎng)基中，-80 保存?zhèn)溆谩?1.4 TAT PTD-Ngb對皮質(zhì)神經(jīng)元的跨膜轉(zhuǎn)導(dǎo) 1.4.1 原代皮質(zhì)神經(jīng)元的培養(yǎng) 取出生24 h以內(nèi)的SD乳鼠，無菌條

11、件下分離皮質(zhì)，經(jīng)濃度為2.5 mg/L胰酶消化（37 ,15 min）分散后，加入52 mg/mL胰酶抑制劑終止消化，細(xì)胞沉淀用含CaP2+、MgP2+的解剖液洗滌后離心去上清，加入含2 mL/L B27的Neurobasal培養(yǎng)基內(nèi)，以0.5×106/mL的密度種植在用多聚賴氨酸包被好的培養(yǎng)皿中35 mm培養(yǎng)皿（2 mL/皿）中，置于含體積分?jǐn)?shù)5%CO2、37 的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每3-4 d半量換液1次。神經(jīng)元培養(yǎng)至第7天用于實驗。 1.4.2 TAT PTD介導(dǎo)的Ngb蛋白的跨膜轉(zhuǎn)導(dǎo)及其檢測 培養(yǎng)的神經(jīng)元用Neurobasal培養(yǎng)基全量換液，培養(yǎng)基內(nèi)加入不同終濃度TAT PTD-N

12、gb蛋白（0，0.1，0.5，1.0，2.0 mmol/L）37 培養(yǎng)箱內(nèi)孵育2 h，吸去培養(yǎng)基，PBS洗滌，收集、裂解細(xì)胞，細(xì)胞裂解液進行Western-blotting分析，用抗融合蛋白上的6×His-tag單克隆抗體檢測進入細(xì)胞內(nèi)的融合蛋白，并以純化的TAT PTD-Ngb融合蛋白做為陽性對照。 2 結(jié) 果 2.1 TAT PTD-Ngb融合基因的RT-PCR擴增 從SD大鼠腦組織中提取腦組織總RNA，逆轉(zhuǎn)錄后PCR 擴增，15 g/L的瓊脂糖凝膠電泳分析PCR產(chǎn)物，得到與預(yù)期大小一致的DNA 片段（500 bp），經(jīng)TA克隆并測序完全正確（圖1）。 2.2 重組pETPN質(zhì)粒

13、的酶切鑒定 重組pETPN質(zhì)粒經(jīng)Nde / Nhe雙酶切后電泳，顯示切出與目的基因大小一致的DNA片段（圖2）。插入片段經(jīng)測序證明插入位置正確，無突變，表明克隆載體含有TAT PTD-Ngb基因序列,測序結(jié)果見圖3。 2.3 TAT PTD-Ngb融合蛋白的原核表達 與對照菌相比，pETPN BL21(DE3)plysS重組菌IPTG誘導(dǎo)后，SDS-PAGE電泳分析有目標(biāo)分子量新的的蛋白產(chǎn)生，表觀分子量20 ku左右，隨誘導(dǎo)時間延長目的蛋白表達量增高（圖4a，箭頭所示為目的蛋白條帶），可溶性分析顯示，上清中有目的蛋白，蛋白為可溶性（圖4b）。 2.4 TAT PTD-Ngb融合蛋白Wester

14、n blot鑒定 為進一步對融合蛋白進行驗證，將細(xì)菌誘導(dǎo)表達前與誘導(dǎo)表達8 h的產(chǎn)物上清用抗融合蛋白的6×His-tag單克隆抗體進行Western-blotting分析，結(jié)果顯示融合蛋白在 約20 ku顯示單一條帶，與預(yù)計的目的蛋白分子量相符（圖5），表明表達的目的蛋白具有抗原活性，而含pET28b質(zhì)粒的對照菌在誘導(dǎo)表達前與誘導(dǎo)表達8 h均無此條帶。 2.5 可溶性TAT PTD-Ngb融合蛋白的純化 取誘導(dǎo)表達8 h含大量TAT PTD-Ngb融合蛋白的表達產(chǎn)物，利用TAT PTD-Ngb融合蛋白上的6×His標(biāo)簽，用Ni-NTA進行親和純化，純化產(chǎn)物分析結(jié)果見圖6。凝

15、膠經(jīng)灰度掃描分析顯示，純度在95%以上。 2.6 TAT PTD介導(dǎo)的Ngb對原代培養(yǎng)皮質(zhì)神經(jīng)原的跨膜轉(zhuǎn)導(dǎo) 將TAT PTD-Ngb融合蛋白分別以不同終濃度加入原代培養(yǎng)皮質(zhì)神經(jīng)元培養(yǎng)基內(nèi)，孵育2 h后，提取細(xì)胞內(nèi)蛋白，以抗6×His-tag單克隆抗體檢測細(xì)胞內(nèi)融合蛋白含量，結(jié)果顯示，細(xì)胞內(nèi)檢測到TAT PTD-Ngb融合蛋白，與對照的融合蛋白條帶相同，并且隨著給予融合蛋白濃度的增高，檢測到細(xì)胞內(nèi)融合蛋白量增高（圖7）。 討 論 本實驗以pET28b為載體，成功構(gòu)建了融合蛋白TAT PTD-Ngb的原核表達質(zhì)粒，誘導(dǎo)其表達，并利用pET28b上的6×His-tag純化出高純度

16、的可溶性TAT PTD-Ngb融合蛋白。純化后的蛋白經(jīng)Western-blot檢測，與特異性抗體具有良好的特異性反應(yīng)及抗原活性。我們將一定濃度的經(jīng)純化的TAT PTD-Ngb融合蛋白與原代培養(yǎng)的皮質(zhì)神經(jīng)元共同孵育后，Western-blot分析可檢測到細(xì)胞內(nèi)存在融合蛋白，且融合蛋白的含量隨加入培養(yǎng)基內(nèi)融合蛋白終濃度的增高而升高。這表明通過 TAT PTD的介導(dǎo)，Ngb可穿過細(xì)胞膜進入細(xì)胞內(nèi)，TAT PTD-Ngb融合蛋白具有跨膜轉(zhuǎn)導(dǎo)活性，進入量具有蛋白濃度依賴性。 腦紅蛋白(neuroglobin，Ngb)是Burmester4等于2000年首次報道的在一種人和小鼠的腦內(nèi)存在的，在神經(jīng)系統(tǒng)中大

17、量特異性表達的攜氧球蛋白，Ngb在對氧大量需求的神經(jīng)系統(tǒng)中廣泛表達。大量研究顯示，缺氧能夠誘導(dǎo)Ngb表達，與其他的攜氧球蛋白相似，Ngb能夠可逆性地與氧結(jié)合，并與氧有極高的親和力，在急性缺血缺氧的情況下可迅速地釋氧，從而提高神經(jīng)細(xì)胞的存活率和功能的發(fā)揮，降低其表達則會增加組織和細(xì)胞的缺氧損傷程度5。研究推測，Ngb可能作為一個神經(jīng)保護因子而起作用，可作為內(nèi)源神經(jīng)保護因子成為治療缺血缺氧性腦損傷的研究目標(biāo)。但是目前仍不明確Ngb在生理及病理狀態(tài)下的神經(jīng)保護機制。因此，Ngb能否以及如何用于腦血管疾病十分值得探討。 研究證明，HIV-1 TAT-PTD具有獨特的跨膜運轉(zhuǎn)方式，可以引導(dǎo)多種多肽和蛋白

18、質(zhì)進入目標(biāo)細(xì)胞，轉(zhuǎn)導(dǎo)速度快、效率高，而且它所引導(dǎo)的蛋白質(zhì)可以具有很大的分子量，能將相對分子質(zhì)量超過1 000 k的蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)運到大部分哺乳動物細(xì)胞內(nèi)，而且大的粒子轉(zhuǎn)運入細(xì)胞不影響細(xì)胞活力和蛋白活性與功能6。重要的是，TAT PTD介導(dǎo)的蛋白質(zhì)甚至可以直接通過血腦屏障直接進入腦組織和神經(jīng)元，因此該技術(shù)將對于治療神經(jīng)系統(tǒng)疾病有重要意義，已有學(xué)者將如BCL-XL、GDNF、FNK、XIAP等具有腦保護作用的因子利用PTD的轉(zhuǎn)導(dǎo)功能將其引入腦缺血模型，取得了良好的保護效果7-10 ，并且與將蛋白引入細(xì)胞的傳統(tǒng)方法如蛋白微注射、穿孔蛋白及脂質(zhì)體法等相比，TAT PTD 介導(dǎo)的蛋白轉(zhuǎn)導(dǎo)有著顯著的優(yōu)越性。蛋白

19、轉(zhuǎn)導(dǎo)不依賴于受體和轉(zhuǎn)運蛋白，也不需要能量，具有濃度和時間依賴性，這一過程可能和蛋白轉(zhuǎn)導(dǎo)域中存在堿性氨基酸(精氨酸和賴氨酸)有關(guān)，這些帶有強正電荷的氨基酸, 通過直接與帶負(fù)電荷的細(xì)胞膜脂類相互作用而介導(dǎo)穿膜過程11，最近的研究認(rèn)為細(xì)胞膜脂質(zhì)筏介導(dǎo)的巨胞飲參與了蛋白轉(zhuǎn)導(dǎo)機制 12。目前的研究發(fā)現(xiàn)，TAT序列中具有轉(zhuǎn)導(dǎo)作用的最小序列是富含堿性氨基酸，具有較多正電荷的多肽片段：從49至57這9個氨基酸殘基RKKRRQRRR，它與以前許多研究者曾經(jīng)使用的11個氨基酸的序列PTD序列具有相似的蛋白轉(zhuǎn)導(dǎo)效率11，我們的研究中，TAT PTD即采用了這一最小的9個氨基酸序列，進一步減小了蛋白轉(zhuǎn)導(dǎo)域?qū)ζ渌龑?dǎo)蛋

20、白的影響及HIV TAT-PTD可能具有的目前尚不清楚的副作用。 本實驗可溶性TAT PTD-Ngb融合蛋白的表達、純化及其跨膜轉(zhuǎn)導(dǎo)入皮質(zhì)神經(jīng)元，為進一步應(yīng)用蛋白轉(zhuǎn)導(dǎo)技術(shù)進行Ngb的神經(jīng)保護機制研究奠定了基礎(chǔ)，為Ngb應(yīng)用于腦血管疾病及其他神經(jīng)系統(tǒng)疾病創(chuàng)造了可能，為蛋白轉(zhuǎn)導(dǎo)技術(shù)作為一種新穎的分子治療措施應(yīng)用于臨床提供了依據(jù)?！緟⒖嘉墨I】 COUTURE M, BURMESTERT, HANKELNT, et al. The heme environmen to mouse neuroglobin. Evidence for the presence of two conformations o

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