1、即核酸即核酸DNADNA分子一級結構的測定，是現代分子生分子一級結構的測定，是現代分子生物學一項重要的技術。物學一項重要的技術。 1963 1963年，年，SangerSanger和和ThompsonThompson等人第一次完成等人第一次完成胰島素胰島素5151個氨基酸的序列測定，這在當時來說是個氨基酸的序列測定，這在當時來說是一件了不起的大事。一件了不起的大事。7070年代后期，年代后期，SangerSanger和和Maxam-GilbertMaxam-Gilbert等人又建立了核酸序列測定的等人又建立了核酸序列測定的方法，方法，SangerSanger雙脫氧末端終止法和雙脫氧末端終止法和

2、Maxam-Maxam-GilbertGilbert化學裂解法將核酸序列測定技術推進到化學裂解法將核酸序列測定技術推進到“直讀階段，使核酸序列測定變得遠比蛋白質氨直讀階段，使核酸序列測定變得遠比蛋白質氨基酸序列測定容易，這樣人們可以通過核酸序列基酸序列測定容易，這樣人們可以通過核酸序列和遺傳密碼推導出蛋白質氨基酸的序列。和遺傳密碼推導出蛋白質氨基酸的序列。1 1、末端終止法、末端終止法2 2、化學裂解法、化學裂解法3 3、DNADNA測序自動化測序自動化使用特異性引物使用特異性引物與單鏈模板與單鏈模板DNADNA退退火，在火，在DNADNA聚合酶聚合酶作用下進行延伸作用下進行延伸反應，用反應，

3、用ddNTPddNTP終終止，用止，用PAGEPAGE區分區分長度僅相差長度僅相差1 1個核個核苷酸的苷酸的ssDNAssDNA，從，從而完成測序的方而完成測序的方法。法。用化學試劑在用化學試劑在A A、G G、C C、T T處特定的裂解處特定的裂解DNADNA片段，產生一簇片段，產生一簇各種長度的短鏈，各種長度的短鏈，經過經過PAGEPAGE放射自顯放射自顯影可直讀影可直讀DNADNA順序。順序。類似末端終止法，所類似末端終止法，所不同的是用熒光染料不同的是用熒光染料標記，計算機自動讀標記，計算機自動讀出。出。優點簡便、迅速、應簡便、迅速、應用廣泛。用廣泛。不需酶促反應，可不需酶促反應，可以

4、對寡核苷酸測序。以對寡核苷酸測序。1 1、高負荷，、高負荷，1 1塊膠可塊膠可測測1616個樣品；個樣品；2 2、機、機讀不需放射自顯影；讀不需放射自顯影；3 3、安全不用同位素；、安全不用同位素；4 4、簡單迅速。、簡單迅速。不能和下一個核苷酸通過磷酸二酯鍵連接起來 測序過程測序過程: : 1.1.模板與引物雜交模板與引物雜交 2.2.引物的延長和合成阻斷引物的延長和合成阻斷 四個試管分別加入四個試管分別加入 DNA DNA聚合酶聚合酶 dNTP dNTP 標記底物標記底物 終止劑不同終止劑不同 ddA ddG ddC ddT ddA ddG ddC ddT 四個試管中所有產物是一系列長度只

5、差一四個試管中所有產物是一系列長度只差一個核苷酸的聚合鏈個核苷酸的聚合鏈 3.3.電泳電泳 4.4.放射自顯影得到直讀圖象放射自顯影得到直讀圖象5-AACTGCTG-3與引物退火5-AACTGCTG-3 5 dNTPddATPdNTPddCTPdNTPddGTPdNTPddTTP5-AACTGCTG-3 AC-55-AACTGCTG-3 C-55-AACTGCTG-3 GAC-55-AACTGCTG-3 TGACGAC-55-AACTGCTG-3 CGAC-55-AACTGCTG-3 CGAC-55-AACTGCTG-3 GACGAC-55-AACTGCTG-3 TTGACGAC-52+5 1

6、+43+67+8ddddddddddddddddAGCTAAAGGTACGGGAATTTCGCG 53添加 DNA polymerase所有4 dNTPs其中一種標記的ddNTPddTTP ddCTP ddGTP ddATP在四個不同的反應管中各只包含一種ddNTP.AGCTAAAGGTACGGGAATTTCGCG 53TTCGATTCGATTTCGATTTTCTCGATTTCTCGATTTCCTCGTCGAT reactionC reactionG reactionA reaction每一管中的復制的序列都停留在每一管中的復制的序列都停留在ddNTPs ddNTPs 處處5反應終止后，四個反

7、應管中的反應混合液分別進行聚丙烯酰胺凝膠反應終止后，四個反應管中的反應混合液分別進行聚丙烯酰胺凝膠電泳分離電泳分離. .這四個反應管中延伸的寡核苷酸僅相差一個堿基這四個反應管中延伸的寡核苷酸僅相差一個堿基. .電泳結構通過顯色指示電泳結構通過顯色指示. . T C G A3CCTTTAGCT5 化學裂解法是化學裂解法是Maxam和和Gilbert等人等人1977年創建的，年創建的，用來測定用來測定DNA序列。化學法是用化學試劑在序列。化學法是用化學試劑在A、G、C、T處特定地裂解處特定地裂解DNA片段，產生一簇各種長度的短鏈等片段，產生一簇各種長度的短鏈等差數列差數列 n=1），經過），經過P

8、AGE和放射自顯影后，可以直接讀和放射自顯影后，可以直接讀出出DNA的順序。的順序。 1 1、用放射性核素標記待測、用放射性核素標記待測DNADNA一側末端一側末端2 2、將標記、將標記DNADNA分為分為G G、A+GA+G、C+TC+T、C 4C 4個反應體系個反應體系3 3、用不同的化學試劑處理不同反應體系，隨機斷、用不同的化學試劑處理不同反應體系，隨機斷裂裂DNADNA片段某種堿基中的任何一個，產生一組一片段某種堿基中的任何一個，產生一組一端為放射線標記的末端，另一端為不同大小的端為放射線標記的末端，另一端為不同大小的DNADNA片段的混合物片段的混合物4 4、電泳分離，放射自顯影得到

9、互相錯落的梯形圖、電泳分離，放射自顯影得到互相錯落的梯形圖譜，即可讀出譜，即可讀出DNADNA序列序列反應體反應體系系堿基修飾試堿基修飾試劑劑堿基修飾反堿基修飾反應應主鏈斷裂試主鏈斷裂試劑劑斷裂點斷裂點G G硫酸二甲酯硫酸二甲酯鳥嘌呤甲基鳥嘌呤甲基化化六氫吡啶六氫吡啶G GG+AG+A甲酸甲酸脫嘌呤作用脫嘌呤作用六氫吡啶六氫吡啶G G和和A AC+TC+T肼肼嘧啶開環嘧啶開環六氫吡啶六氫吡啶C C和和T TC C肼（加鹽）肼（加鹽）胞嘧啶開環胞嘧啶開環六氫吡啶六氫吡啶C C化學法讀序化學法讀序 每組測序圖譜為每組測序圖譜為4條垂直的階梯帶，該片從膠底部一條垂直的階梯帶，該片從膠底部一個個向頂部

10、讀，個個向頂部讀，G+A和和C+T兩列中含有所有相差一個堿基兩列中含有所有相差一個堿基的的DNA片段。如果片段。如果G+A中出現中出現1條帶就看條帶就看G列中是否有同列中是否有同樣大小的帶，若有即為樣大小的帶，若有即為G堿基，無則為堿基，無則為A堿基；同理，堿基；同理，C+T中則檢查中則檢查C列中有無同樣大小條帶，有即為列中有無同樣大小條帶，有即為C，無則，無則為為T。 從單塊凝膠上能得到可靠序列數量約為從單塊凝膠上能得到可靠序列數量約為200-300bp以內以內優點： 1、所測序列直接來源于所測 DNA ，避免了 DNA 復制中錯誤 dNTP 的摻入。 2、可直接對合成的寡核苷酸測序，可分析

11、甲基化修飾等，以及研究 DNA 的二級結構及蛋白質與 DNA 的相互作用等。 缺陷： 操作復雜，讀序困難。特點特點原理同末端終止法原理同末端終止法標記物為熒光染料標記物為熒光染料激光掃描自動測序激光掃描自動測序結果清晰、準確、分辨率高結果清晰、準確、分辨率高測序速度快測序速度快 200bp/h200bp/h1 1、標記物不同：手工測序采用放射性核素標記，而自動、標記物不同：手工測序采用放射性核素標記，而自動測序采用測序采用4 4種熒光染料分別標記種熒光染料分別標記ddNTPddNTP或標記引物或標記引物2 2、加樣方式不同：手工測序，一個樣品的、加樣方式不同：手工測序，一個樣品的4 4個測序反

12、應個測序反應物分別在不同泳道進行，而自動測序可在一個泳道內物分別在不同泳道進行，而自動測序可在一個泳道內電泳，提高電泳分析的效率電泳，提高電泳分析的效率3 3、檢測手段不同：手工測序采用放射自顯影，從、檢測手段不同：手工測序采用放射自顯影，從4 4種寡種寡聚核苷酸的梯子形圖譜中讀出聚核苷酸的梯子形圖譜中讀出DNADNA序列，而自動測序序列，而自動測序則采用激光掃描器同步掃描，計算機進行閱讀和編輯則采用激光掃描器同步掃描，計算機進行閱讀和編輯 DNA DNA序列測定的自動化序列測定的自動化 1. DNA1. DNA測序步驟與自動化測序步驟與自動化 1 1模板制備模板制備 可自動化可自動化 2 2

13、定序反應定序反應 可自動化可自動化 3 3凝膠電泳凝膠電泳 自動化有一定困難：自動化有一定困難：制膠，點樣，電泳，凝膠干燥，放射自制膠，點樣，電泳，凝膠干燥，放射自顯影。顯影。 4 4核苷酸序列閱讀與計算機輸入核苷酸序列閱讀與計算機輸入 可自動化可自動化 2.2.自動測序儀自動測序儀 ConneyConney等人于等人于19871987年設計年設計了不同熒光染料標記引物，然后做鏈終了不同熒光染料標記引物，然后做鏈終止測序，用激光掃描閱讀序列。止測序，用激光掃描閱讀序列。 紅色引物紅色引物+T+T反應系統引物反應系統引物+DNA+dNTP+ddTTP+DNA+dNTP+ddTTP） 黃色引物黃色

14、引物+G+G反應系統引物反應系統引物+DNA+dNTP+ddGTP+DNA+dNTP+ddGTP） 綠色引物綠色引物+A+A反應系統引物反應系統引物+DNA+dNTP+ddATP+DNA+dNTP+ddATP） 蘭色引物蘭色引物+C+C反應系統引物反應系統引物+DNA+dNTP+ddCTP+DNA+dNTP+ddCTP）目前市場上已經有各種型號的目前市場上已經有各種型號的DNADNA自動測序儀可供選購。自動測序儀可供選購。 “分子生物學研究方法思考題：分子生物學研究方法思考題：1 1、常用的核酸的凝膠電泳是哪兩種？它們分、常用的核酸的凝膠電泳是哪兩種？它們分辨辨DNADNA片段的范圍有何不同？片段的范圍有何不同？2 2、電泳操作的基本程序有哪些？、電泳操作的基本程序有哪些？3 3、核酸