1、 第一章 LC-MS/MS檢測QNs在牛奶和雞蛋中殘留方法的建立及應用 第二章 恩諾沙星在大鼠、豬、山羊和雞體內代謝和排泄的比較研究 1. 背景2. 技術路線3. 方法4. 結果與分析5. 結論 氟喹諾酮類氟喹諾酮類 (fluoroquinolones, FQs) 是第三代喹諾酮類喹諾酮類(quinolones, QNs) ，是繼磺胺類藥物之后在合成抗菌藥物方面最重要的突破 FQs是獸醫臨床上應用最廣泛的化學治療藥物。 病原微生物耐藥性的增加 關節炎 光敏毒性 過敏 肝腎損傷 影響國際貿易 農業部公告第236號（2003）3種檢測QNs的HPLC方法 王國文等（2002）建立了4種FQs在鰻魚

2、中殘留的HPLC方法。 劉媛等（2004）建立了4種FQs在雞蛋中殘留的HPLC方法。 董琳琳等（2005）建立了4種FQs在雞的肌肉、皮+脂肪、肝和腎中殘留的HPLC方法。 董愛國（2003）建立了9種FQs在雞蛋中殘留的HPLC方法 林保銀（2005）建立了11種QNs在牛奶和動物組織中殘留的HPLC方法 林峰等（2004）建立了4種FQs在烤鰻中殘留的LC-MS/MS方法 施冰等（2004）建立了7種FQs在鰻魚、蝦和羅非魚中殘留的LC-MS/MS方法。 歐盟（1994）檢測環丙沙星和恩諾沙星在豬肉、熏肉和牛肉中殘留的HPLC方法 Verdon et al (2005)建立了10種QNs

3、在牛奶、牛肉、豬肉、豬腎、豬肝、魚肉和皮、禽肉和蛋共8種基質中殘留的HPLC方法 Yorke & Froc (2000)建立了檢測雞組織中的9種QNs殘留的HPLC方法 Pecorelli et al (2003) 建立了檢測飼料中13種QNs的HPLC方法 Volmer et al（1997）用LC-MS/MS檢測魚肉、奶和人尿中15種QNs及其CIP的代謝物 Schneider et al 用HPLC-FLD定量和LC-MS 確證雞肝和肌肉中(2002) 和雞蛋（2003）8種FQs的殘留 歐盟聯合研究中心參考物質與測量研究所(EC-JRC-IRMM)建立了檢測豬腎臟中11種QNs

4、殘留的LC-MS/MS法 (Van Vyncht et al,2002; Toussaint B et al, 2002, 2005a, 2005b) Turnipseed et al (2003)報道了檢測水產品中4種FQs、3種氯霉素類、四環素類、磺胺類和甲氧芐胺嘧啶等殘留的LC-MS/MS方法 Yamada et al (2006)研究了111種在牛肉、122種在豬肉和123種在雞肉殘留的LC-MS/MS方法 。包括抗生素、合成抗菌劑、抗寄生蟲藥、激素類藥物及其它們的一些代謝物 本文建立了13種QNs在牛奶和雞蛋中殘留的LC-MS/MS方法，旨在為我國開展此類藥物的殘留監控作檢測方法準備

5、 檢檢測測方方法法樣品前處理測定方法數據處理提取凈化HPLC分離MS/MS方方法法驗驗證證定性方法定量方法確證分數保留時間離子豐度比值準確度精密度靈敏度校正曲線牛奶或雞蛋勻漿ACN-TCA 沉淀蛋白SPE凈化液相條件液相條件 色譜柱： ODS2 (1502.0 mm, 5 m)；保護柱: C18，2.0 mm I.D.； 流動相: A, 0.05%三氟乙酸; B, 乙腈； 梯度洗脫: 0-1 min, 20% B; 1-10 min, 70% B; 流速: 0.3 ml.min-1； 進樣量, 20 L。質譜條件質譜條件 液相色譜-質譜聯用儀（Finnigan）：LCQ Deca離子阱質譜儀，

6、P4000液相系統 。 APCI正離子模式,氣化溫度: 450 ，毛細管溫度: 160 ，殼氣：N2 65。 色譜柱：NUCLEODUR C18柱，125 mm 2.0 mm（id），粒度3 m。保護柱：C18, 4 mm3.0 mm (i.d)。流動相：A液：0.1%（v/v）甲酸/乙睛；B液：0.1%(v/v)甲酸/水。流動相A液變化：010.00 min，13.0%80.0%；10.01 min，13.0%，維持至20.00 min。柱溫：室溫。進樣量：20 L。流速：300 L/min。離子源：ESI，正離子模式。掃描方式：MRM。霧化氣、氣簾氣、輔助加熱氣和碰撞氣：均為高純氮氣，使用

7、前應調節各氣體流量使質譜靈敏度達到檢測要求。噴霧電壓、去集簇電壓、碰撞能量等參數按調諧模式進行優化，達到最高的靈敏度，相關參數 A A C C N N 對對 回回 收收 率率 的的 影影 響響0 . 01 0 . 02 0 . 03 0 . 04 0 . 05 0 . 06 0 . 07 0 . 08 0 . 09 0 . 00 . 05 . 01 02 03 0% % A A C C N N回回 收收 率率 % %N O RC I PD A NE N RS A RD I FO X ON A LF L U檢測限(LOD）：0.2-0.8 ng/mL定量限(LOQ)：1.0-5.0 ng/mL1

8、.樣品前處理過程簡便、快速、使用有機溶劑少和適用范圍廣2.對牛奶和雞蛋中13種QNs既能定性又能定量分析（離子阱方法能定量分析部分FQs）3.方法的特異性強、回收率高、變異系數小、靈敏度高4.實際牛奶檢測發現部分商品中環丙沙星和氧氟沙星殘留超標嚴重1. 前言2. 技術路線3. 方法4. 結果與分析5. 結論 恩諾沙星(Enrofloxacin, ENR)是世界上第一個畜禽專用的FQs，是應用最為廣泛的獸藥品種之一 2002年FDA撤銷了ENR用于食品動物的許可證 1996年歐盟把環境風險評估作為獸藥注冊程序本文進行了恩諾沙星在大鼠、豬、山羊和雞體內代謝和排泄的比較研究，旨在全面了解恩諾沙星在動

9、物體內代謝和排泄的種屬差異，同時為評價其環境安全風險提供試驗依據 色譜柱：C18，250 mm4.6 mm（i.d），粒徑5 m，大連伊利特公司。 保護柱：C18, 4 mm3.0 mm（i.d），美國Phenomenex公司。 流動相：A液：乙腈；B液：檸檬酸/乙酸銨緩沖液。梯度洗脫：0 min25 min，10%40% A，梯度曲線為8；25 min30 min，40%10%，梯度曲線為6。 柱溫：35。進樣量：20 L。流速：1.5 mL/min。 熒光檢測器：激發波長Ex=278 nm，發射波長Em =465 nm。 色譜柱：NUCLEODUR C18柱，125 mm 2.0 mm（i

10、d），粒度3 m，德國MACHEREY-NAGEL公司。 保護柱：C18, 4 mm3.0 mm（i.d），美國Phenomenex公司。 流動相：A液：0.1%（v/v）甲酸-乙睛；B液：0.1%(v/v)甲酸-水。AB = 28，檢測時間為2 min。 柱溫：室溫。 進樣量：20 L。流速：300 L/min。 離子源：ESI，正離子模式；溫度 500.0 Resolution Q1: UNIT MCAYes CEP 26.2843.37 CUR 30 IS 5500 TEM 500 GS1 20 GS2 20 DP 30 FP400 EP 11 4種動物對恩諾沙星代謝和排泄存在較大的種屬差異 排泄速度由快到慢的順序：雞大鼠豬羊 代謝恩諾沙星的能力由大到小：羊大鼠豬雞 恩諾沙星在大鼠和豬體內除代謝成環丙沙星外，還有N-脫亞乙基、N-氧化和結合等多種代謝方式，環丙沙星還可進一步代謝 在國內首次建立了檢測牛奶和雞蛋中1