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文檔簡介

1、IPTG 誘導表達誘導表達原核基因的表達調控原核基因的表達調控 原核生物絕大多數基因按功能相關性成簇地原核生物絕大多數基因按功能相關性成簇地串聯、密集于染色體上，共同組成一個轉錄單位串聯、密集于染色體上，共同組成一個轉錄單位操縱子，如乳糖操縱子，如乳糖lac操縱子、阿拉伯糖操縱子、阿拉伯糖ara操縱子及色氨酸操縱子。操縱子機制在原操縱子及色氨酸操縱子。操縱子機制在原核基因調控中具有較普遍的意義。核基因調控中具有較普遍的意義。 乳糖操縱子元調節機制乳糖操縱子元調節機制 乳糖操縱子乳糖操縱子調控區調控區操縱序列操縱序列O啟動序列啟動序列P調節基因調節基因I結構基因結構基因Z 半乳糖苷酶半乳糖苷酶Y

2、 透酶透酶A 乙酰基轉移酶乙酰基轉移酶 I PCAP Z Y X Z Y X I PCAP Z Y X I PCAP乳糖（-）乳糖（+）要要 點點 阻遏蛋白的負性調節 真正的誘導劑是半乳糖 異丙基硫代半乳糖苷IPTG）pGEX-4T載體圖譜載體圖譜IPTG誘導表達實驗步驟誘導表達實驗步驟第一天第一天在超凈臺中將含有在超凈臺中將含有PGEX-4T-2空載體的甘油菌空載體的甘油菌5ul接接種在種在5ml的的LB培養液中，搖床過夜。培養液中，搖床過夜。第二天第二天將含有將含有PGEX-4T-2空載體的過夜菌按照空載體的過夜菌按照1:200比例接比例接種至種至100mlLB中，中， 37振蕩培養振蕩培

3、養2.5小時。小時。留取留取1.5ml菌液作為未誘導培養的對照。菌液作為未誘導培養的對照。在超凈臺中加入終濃度為在超凈臺中加入終濃度為0.4-1mM的的IPTG于于30誘誘導表達導表達3.5小時。小時。蛋白樣品制備蛋白樣品制備 取取1.5ml1.5ml誘導后菌液及誘導后菌液及預先準備的未誘導培養的菌預先準備的未誘導培養的菌液離心，將沉淀部分加入相液離心，將沉淀部分加入相同體積的蒸餾水與上樣同體積的蒸餾水與上樣bufferbuffer，將蛋白樣品于沸水，將蛋白樣品于沸水中加熱中加熱1010分鐘，離心取上清分鐘，離心取上清進行進行SDS-PAGESDS-PAGE，檢測融合蛋，檢測融合蛋白的表達情況。白的表達情況。 RNA轉錄起始轉錄起始-35區區-10區區TTGACATTAACTTTTACATATGATTTTACATATGTTTTGATATATAATCTGACGTACTGTN17N16N17N1

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