1、    大鼠腦缺血再灌流后HSP70的表達和bFGF對其影響        【摘要】目的研究腦缺血再灌流后熱休克蛋白70(HSP70)表達的意義及外源性堿性成纖維細胞生長因子(bFGF)對其影響。方法應用免疫組化的方法觀察大鼠局灶性腦缺血再灌流后腦組織HSP70的表達以及在側腦室注射外源性bFGF對其影響。結果缺血2小時再灌流0小時即可見HSP70表達，至24小時達高峰。bFGF組與生理鹽水組相比于648小時各組可見HSP70表達增高(P<0.05)。結論腦缺血誘導HS

2、P70的表達，外源性bFGF能增加HSP70的表達。【關鍵詞】熱性休克蛋白70堿性成纖維細胞生長因子腦缺血再灌流 The expression of HSP70 and the effect of bFGF on it in rats following cerebral ische-mia-reperfusionFang Yuan，Tong Etang，Sun Shenggang（Department of Neurology,Xie He Affiliated Hospital of Tongji Medecal University,Wuhan 430022）【Abstract】Obje

3、ctiveTo study the significance of HSP70 expression and its effect of exogenous bFGF on HSP70 expression in rats after cerebral ischemia-reperfusion.MethodsUsing immunohistochemistry mothod.We observed brain HSP70 expression and the effect of exogenous bFGF injected in lateral ventricle on it after f

4、ocal cerebral ischemia-reperfusion in rats.ResultsHSP70 expression could be observed at 0h reperfusion after 2h ischemia,and it reached peak at 24h. And the expression of HSP70 was elevated at 648h reperfusion in bFGF group as compared with physiological saline group(P<0.05).ConclusionCerebral is

5、chemia could induce HSP70 expression. Exogenous bFGF could enhance the expression of HSP70.【Key words】HSP70bFGFCerebral ischemia-reperfusion熱性休克蛋白70(HSP70)是缺血損傷時敏感而可靠的標志,缺血、缺氧及癲癇均可誘導HSP70表達，HSP70表達增強對神經元有保護作用。堿性成纖維細胞生長因子(bFGF)是一種具有多種生物學活性的多肽生長因子,其神經活性廣泛,能保護神經元,促進神經生長。實驗表明，bFGF在抗缺血性腦損傷中也發揮著重要作用，被認為將是

6、最具有臨床應用價值的一種神經營養因子。本研究通過觀察腦缺血再灌流后HSP70的表達和bFGF對其影響，探討腦缺血后HSP70表達的意義和bFGF是否通過誘導HSP70的表達而發揮神經保護作用。1材料與方法1.1實驗動物健康雄性Wistar大鼠，體重250300 g，由同濟醫科大學實驗動物中心提供。動物分組：隨機分為正常組，假手術組，缺血再灌流組。缺血再灌流組又分為bFGF和生理鹽水組，并根據不同時間點分為缺血2小時再灌流0、1、6、12、24、48、72小時組,每組各6只大鼠。1.2方法1.2.1模型制作10水合氯醛麻醉，頸正中切口分離結扎左側頸總動脈、頸外動脈及其分支，分離頸內動脈，將涂有硅

7、酮直徑0.2 mm尼龍線從頸總動脈分叉處插入頸內動脈約18±1.0 mm。再灌流時將栓線抽出約10 mm。1.2.2實驗方法bFGF組在缺血后30分鐘，從右側側腦室注射含bFGF(Sigma公司)1.2 g1生理鹽水10 l。生理鹽水組則僅給予10 l生理鹽水。側腦室注射方法：腦立體定向儀下取前囟后0.8 mm，中線旁1.8 mm，硬膜下3.7 mm為注射點2，10 l微量注射器垂直注射。1.2.3HSP70免疫組化染色 缺血再灌流組于不同時間點，假手術組于術后24小時及正常組用10水合氯醛麻醉后仰臥固定，快速開胸暴露心臟，經升主動脈插管，先用37生理鹽水150 ml快速洗注，再灌注

8、4 4多聚甲醛(Sigma公司)0.1 molL磷酸緩沖液500 ml,灌注時間為1小時，取腦修塊后置上述灌注液及20蔗糖各24小時。將組織塊在冰凍切片機上行30 m厚的連續冠狀切片，0.2Triton X-100、0.03H2O2甲醇處理30分鐘，150牛血清白蛋白371小時。鼠抗HSP70單克隆抗體(1200 Sant Crus 公司)4孵育72小時,兔抗鼠IgG 150、兔抗ABC復合物150(武漢博士德生物工程公司)37各1小時,以上每步均經PBS充分洗滌。DAB 呈色、酒精梯度脫水、二甲苯透明、中性樹膠封片。1.2.4統計方法 采用MPIAS-500真彩色細胞像分析系統，對切片進行像

9、分析。同一組內不同時間的比較采用方差分析，兩組之間同一時間點的比較采用t檢驗。2結果正常及假手術組未見HSP70表達。生理鹽水組，缺血再灌流06小時組僅見輕度HSP70表達，主要在梗死灶周圍，陽性反應細胞呈棕黃色，再灌流12小時表達明顯增加，24小時達高峰(P<0.01)。bFGF組與生理鹽水組比較，再灌流6小時，HSP70表達增強，12小時達高峰(P<0.01)，并持續到24小時，見表1。表1缺血再灌流各組大鼠腦缺血側皮質HSP70陽性細胞數(±s)分組生理鹽水組bFGF組R0 h70.3±27.9481.3±31.36R1 h81.2±3

10、5.2687.6±33.25R6 h90.5±61.32181.9±54.62*R12 h185.6±67.52*387.3±80.12* R24 h338.1±74.61*352.4±72.26R48 h212.5±56.37*275.7±25.46*R72 h94.2±45.21*113.1±39.92*組內全部時間點之間的比較均P<0.01；組內各個時間點與前一時間點比較*P<0.05，*P<0.01，與生理鹽水組比較P<0.05，P<0.01 3討

11、論在正常情況下HSP70 mRNA在細胞中水平較低，HSP70的合成也很少。本實驗中正常組及假手術組未見HSP70表達，而在缺血再灌流各組中均可見HSP70表達，提示腦缺血可誘導神經細胞HSP70表達。在生理鹽水組，缺血再灌注早期僅見HSP70輕度增高，24小時達高峰后開始下降，與劉軍等3的報道一致。Takemoto等4的研究則發現缺血5分鐘再灌流24小時未見明顯HSP70表達，在缺血15分鐘再灌流至96小時才見HSP70表達達高峰。由此可見，HSP70的表達可能與缺血的嚴重程度及對缺血性損傷的耐受性有關。本實驗顯示HSP70表達主要在梗死灶周圍神經元，即缺血半暗帶區，梗死灶中央未見明顯HSP

12、70表達。Kinouchi等5的研究表明HSP70 mRNA主要在缺血灶周圍神經元產生，梗死灶中心的HSP70 mRNA的表達量則很少，推測HSP70可能與半影區神經元損傷的可逆性有關。嚴重缺血時，梗死灶中央區則有大量的HSP70 mRNA表達，沒有HSP70蛋白的合成，被認為是神經元產生嚴重缺血的標志并與細胞損傷有關。有人曾用HSP70單克隆抗體定位來確定缺血后HSP70表達的作用，發現在短暫缺血后死亡的海馬CA1區錐體細胞中HSP70蓄積甚少，存活的齒狀回顆粒細胞中有明顯的HSP70積累6，表明HSP70的蓄積具有神經保護作用，證明缺血后HSP70表達對神經元有保護作用，是細胞存活的原因之

13、一。近年的研究發現凋亡細胞的HSP70表達水平較非凋亡細胞水平低，從而推測HSP70可能抑制細胞凋亡,對缺血神經細胞產生保護作用7。本實驗bFGF組與生理鹽水組比可見HSP70的表達高峰時間前移且持續時間延長，提示缺血后外源性bFGF能誘導HSP70表達。有研究表明短暫缺血2分鐘內可使缺血以后再缺血時HSP70 mRNA表達高峰時間前移，HSP70 mRNA及其蛋白細胞數增多，神經元未受損，推測HSP70合成增多，對缺血神經元有保護作用8。bFGF是一種具有多種生物學活性的神經營養因子，在離體實驗中已證實外源性bFGF能增加神經元的存活，在體實驗也證實外源性bFGF具有保護腦免受損傷并能阻止缺

14、血后神經元死亡、減小梗死體積的作用3。細胞內鈣離子超載是缺血性腦損傷的關鍵因素，bFGF則能通過影響鈣離子結合蛋白而阻止細胞內鈣離子超載，維持細胞內鈣離子環境穩定而發揮抗缺血性損傷的作用9。同時bFGF具有抗NMDA、NO及興奮性氨基酸的神經毒性作用10。腦缺血后，HSP70對細胞的保護作用與鈣離子、自由基及興奮性氨基酸有關。實驗發現熱休克反應能阻止鈣離子內流，保護細胞免受鈣離子依賴的興奮性毒性作用，而熱休克反應能誘導HSP70表達11。我們推測bFGF可能通過抑制鈣離子內流，誘導HSP70的表達，也提示缺血后bFGF 一方面發揮自身的神經保護作用，另一方面也可能通過誘導HSP70的合成而發揮

15、作用，但bFGF是否有直接促HSP70表達的作用還待進一步研究。相信通過進一步的實驗研究, 將為臨床應用bFGF治療急性卒中提供新的方法。作者單位：方瑗（430022同濟醫科大學附屬協和醫院神經科）童萼塘（430022同濟醫科大學附屬協和醫院神經科）孫圣剛（430022同濟醫科大學附屬協和醫院神經科）王玉（430022同濟醫科大學附屬協和醫院神經科）王耀明（430022同濟醫科大學附屬協和醫院神經科）參考文獻1，Naodi K,David J,Michael A,et al.Pretremeat with intraventricular basic fibroblast growth fac

16、tor decreases infarct size following focal cerebral ischemia in rats.Ann Neurol,1994,35:4512，包新民,舒斯云.大鼠腦立體定位譜.北京：人民衛生出版社，1991.313，劉軍,匡培根,張鳳英,等.巴曲酶的神經保護作用缺血再灌注后不同時程熱休克蛋白70及病理組織學變化的相關性研究.中風與神經疾病雜志,1996,13:1374，Takemoto O, Tomimoto H, Yanagihara T.Induction of C-fos and C-jun gene products and heat sho

17、ck protein after brief and prolonged cerebral ischemia in gerbils. Stroke,1995,26:16395，Kinouchi H, Sharp FR, Koistinaho J, et al. Induction of heat shock HSP70 mRNA and HSP70 KDa protein in neurons in the penumbra following focal cerebral ischemia in the rat. Brain Res,1993,619:3346，Vass K, Welch N

18、J, Nowak TS Jr,et al. Localization of HSP 70-KDa stress protein induction in gerbil brain after ischemia. Acta Neuropathol Berl,1998,77:1287，He L, Fox MH.Variation of heat shock protein 70 through the cell cycle in HL-60 cells and its relationship to apoptosis. Exp Cell Res,1997,232:648，Aoki M, Abc K, Kawagoe J,et al. Temporal profile of the induction of heat shock protein 70 and heat shock cognate protein 70 mRNA after transient ischemia in gerbil brain. Brain Res,1993,601:1859，Mark P, Binchen