1、小鼠Foxp3抗血清的制備及應用 11-01-31 14:13:00 編輯：studa20 作者：焦海春, 肖建華*, 何濤君, 胡杰, 崔彥芬【摘要】 目的: 制備高效價的特異性小鼠Foxp3抗血清, 并初步應用于正常小鼠組織的Foxp3表達的鑒定。方法: 構建重組質粒pGEX6p2/Foxp3, 并轉化至E.coli BL21(DE3)中進行大量誘導表達, 用純化的重組融合蛋白免疫新西蘭兔, 制備抗血清。以制備的抗血清為一抗, Western blot檢測小鼠組織的Foxp3蛋白的表達。結果: SDSPAGE及Western blot鑒定, 誘導表達及純化的重組融合蛋白能被抗GST單克隆抗

2、體（mAb）識別, 在Mr 45000附近有特異條帶, 與預期融合蛋白大小一致, 獲得的抗血清效價在112800以上, 該抗血清能特異性識別NIH3T3細胞中表達的Foxp3蛋白。Western blot鑒定結果顯示在脾臟、 胸腺、 淋巴結中Foxp3蛋白有較高表達, 胃也有少量的表達, 而骨骼肌、 脂肪組織未見表達。結論: 制備了高效價的特異性小鼠Foxp3抗血清, 并可用于正常小鼠組織的Foxp3蛋白的表達鑒定, 為進一步研究Foxp3奠定了實驗基礎。 【關鍵詞】 Foxp3 CD4+CD25+Treg細胞 抗血清制備Abstract AIM: To prepare the high ti

3、ter and specific antiserum against mouse Foxp3 and then use them to identify Foxp3 expression in normal mouse tissues. METHODS: The Foxp3 fragment was amplified by polymerase chain reactions(PCR) and cloned into the prokaryotic expression vector pGEX6p2. The recombinant plasmid pGEX6p2/Foxp3 was tra

4、nsformed into E.coli BL21(DE3) to be expressed. The expressed fusion protein GSTFoxp3 was analyzed by SDSPAGE and Western blot. The polyclonal clantiserum was obtained by immunizing New Zealand rabbits with the purified fusion protein as antigen. The Foxp3 expression in normal mouse tissues was dete

5、cted by Western blot with the antiserum. RESULTS: The expressed products were analyzed by SDSPAGE and Western blot. The results showed that the molecular weight of the expressed protein was about 45 000. The titer of the antiserum was above 112 800. We observed that the antiserum could recognize Fox

6、p3 protein expressed in NIH3T3 cells by immunoblotting. Western blot results showed that the Foxp3 protein was expressed highly in spleen, thymus and lymph nodes, less expressed in stomach, but not expressed in skeletal muscle and adipose tissue. CONCLUSION: High titer antiserum against mouse Foxp3

7、is produced and can be used to identify the Foxp3 expression in normal mouse tissues.KeywordsFoxp3; CD4+CD25+Treg cell; antiserum preparation1995年, Sakaguchi等1發現CD4+CD25+調節性T淋巴細胞（regulatory T cell, Treg）后, 該細胞的研究成了近年來免疫學領域的研究熱點之一。人們發現, Treg在自身免疫病、 抗感染免疫、 腫瘤免疫、 移植物耐受等方面都具有重要意義。Foxp3基因屬于轉錄因子forkhead/w

8、ingedhelix家族, 該基因家族由大量分布極廣的轉錄因子組成, 該家族成員具有共同的保守序列“叉狀頭/翅膀狀螺旋”DNA結合域。在Scurfy小鼠和人類IPEX綜合征（immune dysregulation, polyendocrinopathy, enteropathy, Xlinked syndrome）中發現Foxp3基因的突變, Scurfy小鼠和IPEX中均出現Treg的數量及功能異常2。2003 年,研究證明轉錄因子Foxp3不僅在Treg上特異性表達, 而且對Treg的發育和功能是必需的3, 4。OGarra等5稱其為21世紀分子, 可以知道其在免疫調節中起到不可忽視的作

9、用。目前對轉錄因子Foxp3的研究還處于初級階段, 對其在體內的作用, 尤其是分子效應機制方面了解還甚少。因此, 我們制備了高效價的特異性小鼠抗Foxp3血清, 并對正常小鼠組織進行了檢測, 對制備的抗血清進行了初步應用。1 材料和方法1.1 材料 pGEX6p2表達載體、 E.coli BL21、 E.coli XL1blue、 NIH3T3 細胞、 GST純化蛋白為本研究所保存。pMIGR1/Foxp3重組質粒和pMIGR1質粒由Sakaguchi S教授(Kyoto University, Japan)贈送。純種雄性新西蘭兔、 清潔級昆明小鼠為南華大學動物部飼養。限制性內切酶EcoR I

10、和Xhol I、 T4 DNA連接酶、 Taq酶、 DNA標準購自Fermentas公司; P7708V蛋白質標準為紐英倫公司產品; GST瓊脂糖凝膠FF純化柱購自北京天來公司; 弗氏佐劑購自Sigma公司; ECL增強化學發光試劑盒購自PIERCE公司; 引物由上海生工技術服務公司合成。1.2 方法1.2.1 抗原表位的選擇 從GenBank(/entrez)中獲取小鼠Foxp3基因(NM: 054039)的堿基序列及氨基酸序列, 用ExPasy網上軟件作抗原表位分析(網址: www.ExP), Blast軟件分析選取與Fox

11、p家族(Foxp1、 Foxp3、 Foxp2、 Foxp4)中的其他成員相比較特異的一段氨基酸序列, 綜合以上指標, 選擇抗原性較強的抗原表位區Foxp3區段(178336aa)的編碼基因片段(5321008bp)為目的基因。1.2.2 目的基因的PCR擴增 根據基因庫提供的Foxp3編碼基因序列, 設計特異性擴增引物。上游引物P1: 5CCGAATTCGGAAAGACCCAGCCAACCTT3, 引入EcoR I酶切位點; 下游引物P2: 5GGCCTCGAGCATATTGTGGTACTTGAAG3, 引入Xhol I酶切位點。以pMIGR1/Foxp3重組質粒為模板, PCR擴增目的基因

12、, 94 5 min預變性后, 進入94 30 s, 61 45 s, 72 45 s的循環, 共計30次, 末次循環后72延伸7 min終止反應。產物經10 g/L瓊脂糖電泳鑒定, 通過DNA純化系統回收。1.2.3 PCR產物的亞克隆 純化回收的PCR產物經限制性內切酶EcoR I和Xhol I雙酶切消化, 再次純化回收后, 亞克隆到經同樣的雙酶酶切消化然后純化回收的原核表達載體pGEX6p2上。經PCR篩選, EcoR I酶和Xhol I酶雙酶切鑒定后核苷酸序列測序鑒定。1.2.4 重組融合蛋白的表達、 純化及鑒定 取500 mL IPTG（終濃度為0.1 mmol/L） 20誘導6 h

13、的菌液離心收集菌體, 加入細胞裂解液, 反復凍融后超聲破菌, 離心收集上清, 用GST瓊脂糖凝膠FF純化柱純化。采用紫外吸收法測定純化蛋白濃度, 并進行SDSPAGE分析。以鼠抗人GST mAb為一抗, Western blot鑒定重組融合蛋白。 Western blot鑒定參照分子克隆實驗指南（第3版）實驗技術進行。1.2.5 兔抗小鼠Foxp3多克隆血清的制備 選質量4.0 kg的雄性新西蘭兔, 于背部皮下多點注射純化的重組融合蛋白500 g, 共4次, 同時設GST、 PBS對照組為陰性對照。第1次加等量完全弗氏佐劑, 后3次加入等量不完全弗氏佐劑, 每次間隔10 d。第4次免疫10 d

14、后耳緣靜脈采血, 離心分離血清, 檢測血清特異性抗體, 并測定血清抗體滴度（免疫前的血清作為陰性對照）, 若抗體效價達到要求, 心臟采集兔全血, 離心分離血清, 并加入純化的GST蛋白以封閉血清中的GST抗體, 分裝成小份保存于-20待用。1.2.6 兔抗小鼠Foxp3血清的特性鑒定 (1)效價測定: 采用ELISA法, 用純化的GSTFoxp3重組融合蛋白包被酶標板, 4包被過夜, 兔血清稀釋度從1100到151200, 羊抗兔IgGHRP(110000稀釋)為二抗, 四甲基聯苯胺(TMB)顯色, 酶標儀檢測A450值, 以免疫前兔血清作陰性對照, 結果以待測標本A450值/陰性對照A450

15、值2.1為陽性, 以出現陽性反應的最高稀釋度作為血清的效價。(2)特異性鑒定: 利用電穿孔法分別轉染pMIGR1/Foxp3及pMIGR1入NIH3T3細胞, 提取轉染細胞的總蛋白, SDSPAGE分析, 蛋白質轉移至硝酸纖維素膜上。Western blot鑒定, 一抗為兔免疫血清（11000稀釋）, 二抗為HRP標記的羊抗兔IgG（14000稀釋）, 發光法檢測NIH3T3轉染細胞表達的Foxp3蛋白。1.2.7 正常小鼠組織的Foxp3蛋白的表達鑒定 提取昆明小鼠脾臟、 胸腺、 腹股溝淋巴結、 胃、 骨骼肌、 脂肪組織的總蛋白, 以處理的小鼠Foxp3抗血清為一抗進行Western blo

16、t鑒定。2 結果2.1 重組質粒pGEX6p2/Foxp3的鑒定 構建的重組質粒經EcoR I和Xhol I雙酶切及PCR鑒定, 結果經10 g/L瓊脂糖凝膠電泳分析可見, 酶切后出現了質粒大片段和477 bp左右的小片段, 以重組質粒為模板的PCR擴增亦得到了477 bp左右的片段, 與目的片段大小相符（圖1）。序列測定結果與GenBank上序列(NM054039)完全一致。圖1 重組質粒pGEX6p2/Foxp3的酶切及PCR鑒定（略）Fig 1 Identification of recombinant plasmid pGEX6p2/Foxp3 with restrictive enzyme digestion