1、膜片鉗前期調(diào)研綜述膜片鉗技術(shù)是一種以記錄通過離子通道的離子電流來反映細胞膜上單一的(或多個)離子通道分子活動的技術(shù)。作為先進的細胞電生理技術(shù)，膜片鉗一直被奉為研究離子通道的“金標準”。應用膜片鉗技術(shù)可以證實細胞膜上離子通道的存在并能對其電生理特性、分子結(jié)構(gòu)、藥物作用機制等進行深入的研究。1膜片鉗技術(shù)原理膜片鉗技術(shù)(patch-clamp technique)是在電壓鉗技術(shù)的基礎(chǔ)上發(fā)展起來的，采用記錄流過離子通道的離子電流，來反映細胞膜上單一的(或多個的)離子通道分子活動的技術(shù)。該技術(shù)將一尖端經(jīng)加熱拋光的玻璃微電極管吸附在只有幾平方微米的細胞膜上，通過在玻璃電極尖端邊緣與細胞膜之間形成高阻封接，

2、使與微電極尖開口處相連的細胞膜的小區(qū)域(膜片)與其周圍的細胞膜在電學上完全分隔。將膜片內(nèi)開放所產(chǎn)生的電流流進玻璃吸管，用一個膜片鉗放大器測量此電流強度，就得到單一離子通道電流。原理（見圖1）2.膜片鉗技術(shù)發(fā)展歷史膜片鉗技術(shù)是在電壓鉗（voltageclamp）技術(shù)的基礎(chǔ)上發(fā)展起來的，電壓鉗技術(shù)由Cole和Marment設(shè)計，后經(jīng)Hodgkin和Huxley改進并成功地應用于神經(jīng)纖維動作電位的研究。1976年德國馬普生物物理化學研究所Neher和Sakmann首次在青蛙肌細胞上用雙電極鉗制膜電位的同時，記錄到ACh激活的單通道離子電流，從而產(chǎn)生了膜片鉗技術(shù)。1981年Hamill和Neher等人

3、對最早的膜片鉗方法和電子線路做了較大的改進和完善，使其電流測量的靈敏度達到1pA，時間和空間分辨率分別達到10s和1m，并已逐步發(fā)展出幾種適合不同需要的記錄模式。根據(jù)膜片與電極之間的關(guān)系，將這些記錄模式分為四種:細胞吸附式、膜內(nèi)面向外模式、膜外面向外模式、全細胞模式四種。3.膜片鉗技術(shù)優(yōu)缺點膜片鉗技術(shù)對細胞膜通道電流的記錄具有很高的分辨率，信息含量大；能夠改變細胞膜電位，進行單細胞記錄，同時可以控制改變細胞的內(nèi)外溶液成分，靈活性好；應用范圍廣，可以分析檢測所有的離子通道類型；能記錄到pA級電流變化和單通道開關(guān)狀態(tài)，因此具有很高的高靈敏性；相對于熒光標記和放射性標記等手段具有更高權(quán)威性和精確性。

4、但是受限于膜片鉗技術(shù)自身的缺點，仍然存在一些不可避免的問題，如每次只能對單個細胞進行操作，通量低，難以對細胞網(wǎng)絡(luò)以及細胞間的通信進行研究，不能對胞內(nèi)液進行方便換取。在測量過程中，由于通道表達的缺乏會造成數(shù)據(jù)點丟失而引起數(shù)據(jù)不一致，需進行大量的實驗。對操作者的要求也非常高，需要熟練的技術(shù)人員進行小心翼翼、耗時耗力地在顯微鏡下手動控制顯微操作儀，完成吸附、加液、換藥、測量等一系列工作。4.膜片鉗技術(shù)主要用途膜片鉗技術(shù)廣泛用于研究細胞離子通道，已經(jīng)成為研究細胞水平生理功能的常用技術(shù)。歸納其主要用途包括：1)分辨單通道電流，直接觀察通道開啟和關(guān)閉的全過程。通過測得的單通道特征參數(shù)可鑒別通道類型，同時可

5、驗證和研究通道的開關(guān)動力學模型。2)單通道記錄可以解釋某些藥物的作用機制，以研究特定藥物對電壓和遞質(zhì)依賴通道的影響。3)膜片鉗的空間分辨率高，在中樞神經(jīng)系統(tǒng)中可分離細胞體與軸突和樹突的電流；在周圍神經(jīng)系統(tǒng)中可深入了解受體的分布區(qū)域，繪制細胞表面的特定離子通道的分布圖。4)“內(nèi)面向外”和“外面向外”膜片記錄允許任意改變膜片內(nèi)外溶液成分，分別研究單一組分對通道特征的影響，避免了其他成分的干擾。而全膜片記錄可用來研究常規(guī)電壓鉗無法研究的小型細胞，在控制細胞內(nèi)一定離子濃度的同時監(jiān)測整個細胞的電活動。這種方法已被用于采用重組DNA技術(shù)表達的通道研究。5.膜片鉗技術(shù)的發(fā)展及應用從1976年德國生理學家Ne

6、her和Sakmann首先建立膜片鉗技術(shù)以來，該技術(shù)獲得了快速的發(fā)展，已成為現(xiàn)代細胞電生理學研究中的常規(guī)方法，并逐步完善和發(fā)展出許多新的技術(shù)。1）膜片鉗技術(shù)與熒光技術(shù)的結(jié)合熒光探針Fura-2、Fluo-3、Fluo-4等常用于檢測細胞內(nèi)的鈣離子濃度，能與鈣離子結(jié)合，產(chǎn)生較強的熒光，通過膜片微電極將其引入細胞，可以利用膜片鉗記錄細胞內(nèi)的鈣離子濃度，鈣離子的釋放及內(nèi)流等情況，研究細胞膜鈣離子通道的開放、關(guān)閉的動力學特征及生理學效應。2）穿孔膜片鉗技術(shù)1988年Horn等對傳統(tǒng)全細胞記錄進行了改進，建立了穿孔膜片鉗技術(shù)(perforated patch clamp technique)：即利用某些

7、抗生素具有在生物膜上形成通透性孔道的性質(zhì)，將這類抗生素充灌在電極液中，在高阻封接形成之后自發(fā)形成全細胞記錄模式。穿孔膜片鉗技術(shù)通過應用一些特定的抗生素在膜片上形成選擇性的孔道，不僅保持了電極內(nèi)與胞內(nèi)液之間電學的連續(xù)性，而且使細胞內(nèi)環(huán)境相對穩(wěn)定，有利于研究胞內(nèi)信號轉(zhuǎn)導機制和有rundown現(xiàn)象通道電流的記錄，相對于傳統(tǒng)的全細胞膜片鉗技術(shù)實驗成功率較高。然而穿孔模式對離子選擇性的分子基礎(chǔ)目前尚不清楚，利用穿孔膜片鉗技術(shù)記錄全細胞電流的過程中可能出現(xiàn)再封口，單通道模式的形成以及自發(fā)性轉(zhuǎn)變?yōu)閭鹘y(tǒng)的全細胞模式等現(xiàn)象仍需進一步觀察和探討。3）在體膜片鉗技術(shù)在體膜片鉗技術(shù)主要用于研究感覺系統(tǒng)對外界環(huán)境刺激的

8、反應特性和機理。早期膜片鉗記錄用的大多是急性分離的細胞，到了20世紀90年代，Pei等報道了在整體動物上進行膜片鉗記錄，從此開創(chuàng)了在體膜片鉗技術(shù)的研究。在體膜片鉗的研究初期，以Blanton和Margrie為代表的“盲法”記錄不能使電極與細胞膜準確地封接，帶有一定的隨機性，從而影響了該技術(shù)的準確性。Margrie對此方法做了改進，采用TPTP (two-photontargeted patching)技術(shù)。該技術(shù)主要引入雙光子顯微技術(shù)，并結(jié)合熒光標記技術(shù)，使細胞內(nèi)微電極的穿透可以準確的定位，能探測到胞體、樹突甚至個別的棘突，大大提高了實驗的準確率和成功率。4）全自動膜片鉗技術(shù)全自動膜片鉗技術(shù)是

9、離子通道檢測的新技術(shù)，它具有直接性、高信息量及高精確性的特點。與常規(guī)的膜片鉗技術(shù)相比，全自動膜片鉗技術(shù)能夠進行大量篩選，具有高通量性，并且高阻封接穩(wěn)定，實驗記錄的精確性高，實現(xiàn)了操作過程的自動化。Sophion Biosc-ience公司研發(fā)了基于硅芯片系統(tǒng)的全自動膜片鉗產(chǎn)品QPatch 96，能夠持續(xù)運行直到實驗完成，提高了離子通道藥物篩選的效率。目前，該技術(shù)應用于以離子通道為靶標的藥物的篩選，藥效的測試以及安全性研究等方面。5）膜片鉗技術(shù)與分子生物學技術(shù)的結(jié)合分子生物學是從分子水平上研究生物的形態(tài)結(jié)構(gòu)及其功能的科學,膜片鉗技術(shù)利用微電極來研究細胞膜上離子通道的通透性和電位的變化,二者之間的

10、結(jié)合,可以將神經(jīng)細胞離子通道的結(jié)構(gòu)特性和物理特性展現(xiàn)出來。同時,可在同一細胞中分離提取特異性表達的mRNA。用膜片鉗進行全細胞記錄的同時,收集細胞胞漿,然后將mRNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA,并進行PCR擴增,將PCR產(chǎn)物通過凝膠電泳和DNA序列進行分析。再用特異性引物來區(qū)別離子通道亞單位,揭示神經(jīng)細胞結(jié)構(gòu)和功能的關(guān)系,從基因水平研究神經(jīng)傳導通路,提高對神經(jīng)系統(tǒng)本質(zhì)的認識。6)膜片鉗最新研究進展傳統(tǒng)膜片鉗技術(shù)須先借助光學顯微鏡來實現(xiàn)玻璃微電極針尖在細胞膜表面的定位，之后再進行離子通道的記錄，由于受制于光學衍射極限，光學顯微鏡的最高分辨率僅為200 nm，因此探針定位不能實現(xiàn)對細胞膜表面200 nm以下

11、尺度的特定研究區(qū)域的準確選取。為了解決傳統(tǒng)膜片鉗技術(shù)空間分辨率不足的限制，國內(nèi)有學者將掃描離子電導顯微鏡技術(shù)(scanning ion conductance microscopy, SICM)與商用膜片鉗技術(shù)相結(jié)合，構(gòu)建了基于 SICM 負反饋掃描控制技術(shù)的高分辨率膜片鉗技術(shù)。研究人員運用 SICM 負反饋技術(shù)控制納米尺度玻璃微探針進行活體細胞表面的非接觸掃描，獲得細胞膜表面微結(jié)構(gòu)的高分辨率成像，而后運用 SICM 負反饋控制技術(shù)操控該微探針在細胞膜表面非接觸地移動并將其精確定位于掃描成像中感興趣的膜表面納米尺度微結(jié)構(gòu)上方，最后利用該微探針作為膜片鉗記錄電極實現(xiàn)對此微結(jié)構(gòu)的高分辨率電生理信號

12、記錄。實驗中，學者使用基于SICM 負反饋控制的高分辨率膜片鉗技術(shù)，成功實現(xiàn)了現(xiàn)代膜片鉗實驗中微探針的準確定位及特定納米尺度微結(jié)構(gòu)上的高分辨率膜片鉗記錄，為活體生物樣品表面離子通道的空間分布及其功能研究提供了一種有效的工具。補充：目前國內(nèi)院校中，華中科技大學生命科學與技術(shù)學院在膜片鉗放大器研究方面取得較好的成績。學校研究團隊已在武漢洪山科技園區(qū)成立華中科大儀博生命科學儀器有限公司，生產(chǎn)一系列型號的膜片鉗放大器軟硬件系統(tǒng)。公司產(chǎn)品在進行的各種類型的電壓門控和配體門控離子通道的全細胞和單通道記錄實驗中，能與美國的 Axon和德國的 EPC 產(chǎn)品的記錄相媲美。美國AXON部分主要產(chǎn)品介紹：1）Mul

13、tiClamp 700B電阻反饋式膜片鉗和高速電流鉗放大器MD(Axon)的MultiClamp 700B 是計算機控制的微電極放大器，適用于各種細胞內(nèi)或者細胞外的記錄包括： *高速電流鉗（銳利電極或場電位） *膜片鉗（全細胞、巨膜片或者切割膜片） *伏安法/電流測定法 *離子選擇電極測量 *雙分子人造膜記錄主要特征* 內(nèi)部的自動模式開關(guān)通過使用細胞膜電位作為觸發(fā)器可以立即的轉(zhuǎn)換記錄模式。預設(shè)電流鉗模式中的電壓閾值，當細胞膜中的電位達到該電壓標準時，MultiClamp 700B可以自動的切換到電壓鉗。*振蕩抑制在全細胞記錄時，突然改變細胞膜或者電極參數(shù)可能造成意外振蕩。MultiClamp

14、700B會探測電流或者電壓振蕩并自動抑制或自動減少補償設(shè)置來保護細胞。*減緩電流注入輕微的電壓漂移，通常是由于電極性質(zhì)的改變造成的，可能會污染到其它正常的電流鉗記錄。為了持續(xù)的維持細胞膜電位，MultiClamp 700B將按照用戶設(shè)定的時間間隔，自動的注入補償電流。軟件控制代替通常的前面板按鈕和開關(guān)，MultiClamp 700B是由 MultiClamp 700B 指令器, 進行控制的，它是一個在主機（電腦和蘋果機Macintosh，參看如下要求）上運行的程序，通過USB電纜與放大器進行通訊。這種控制界面可以自動進行電橋平衡、吸液管偏移、吸液管和全細胞的電容補償，除了"聰明的&q

15、uot;特征，例如防止振動以及基于閾值的模式改變。放大器的設(shè)置，例如增益、濾波器頻率、全細胞電容、記錄模式以及輸入/輸出縮放因素等都會通過計算機的操作系統(tǒng)的"信息"模式傳送到數(shù)據(jù)采集軟件中去。2）Axopatch 200B單探頭超低噪聲膜片鉗放大器Axopatch200B放大器是美國MD(Axon)公司設(shè)計的專門用于細胞膜電位信號放大的鉗制放大器。此放大器帶寬1kHz時的開路噪聲低到空前的15毫微微安陪以下，5kHz時的開路噪聲低到60毫微微安陪以下，10kHz時的開路噪聲最大130毫微微安陪。帶寬最大可達100kHz。電容補償100PF（=1）或1000pF（=0.1）。

16、 將膜電位鉗制為一個設(shè)定的電壓值，記錄膜離子通道電流信號。保持膜離子通道電流為零，記錄靜息電位；設(shè)置恒定的膜離子通道電流，記錄動作電位。3）Digidata1440A數(shù)模轉(zhuǎn)換器Digidata 1440A是MD公司推出的高分辨率、低噪聲數(shù)模/模數(shù)轉(zhuǎn)換器。它的功能是將膜片鉗放大器所采集的電信號轉(zhuǎn)換成數(shù)碼信號，從而被計算機采樣軟件識別并記錄；同時，它還將計算機軟件輸出的刺激信號轉(zhuǎn)換成模擬信號輸出給膜片鉗放大器并最終施加給細胞。主要特點* Digidata1440A系列轉(zhuǎn)換器為16位A/D和D/A轉(zhuǎn)換器，分辨率高。* Digidata1440A系列轉(zhuǎn)換器為即插即用設(shè)備，通過USB接口與計算機溝通，可

17、被Window直接確認，使安裝與設(shè)置更為簡單。* Digidata 1440A單一導聯(lián)的最高采樣頻率為250KHz，具有16個模擬信號輸入導聯(lián)、4個模擬信號輸出導聯(lián)、8個數(shù)碼信號輸出導聯(lián)。* 輸入范圍：-10.000 V 至+10.000 V。最大傳輸速度為4M采樣點/秒，內(nèi)部噪聲和導聯(lián)間的串擾平均小于±1 mV（p-p at 10 kHz）。* 用于pClamp 10、AxoScope 10的采樣，可通過USB界面直接與筆記本電腦連接。主要應用范圍細胞內(nèi)記錄、場電位記錄、膜片鉗各種模式的記錄、其他電生理信號的記錄。4）pClamp 10記錄和分析軟件主要特點1. 可通過Membra

18、ne Test功能監(jiān)測并指導整個膜片鉗技術(shù)操作過程，并給出瞬時封接以及膜反應參數(shù)。2. 集采樣、分析功能于一體。采樣程序為Clampex，可采集細胞內(nèi)外電位、自發(fā)放電活動、誘發(fā)電位、膜電位、動作電位、各種通道電流（全細胞、單通道）等。分析程序為Clampfit，可對采集的各種信號進行數(shù)據(jù)處理、分析、作圖、統(tǒng)計檢驗等。3. pClamp 10的分析程序Clampfit不需Dongle（密碼鎖），可裝在任何計算機上使用。 4. 支持MDC公司新一代轉(zhuǎn)換器Digidata 1440A和新一代雙電極電壓鉗放大器Axoclamp 900A。主要應用范圍可記錄幾乎所有的電生理信號，主要的有：（1）動作電位

19、；（2）肌電圖（EMG）；（3）眼動電圖（EOG）；（4）興奮性突觸后電流（EPSCs）；（5）興奮性突觸后電位（EPSPs）；（6）抑制性突觸后電流（IPSCs）；（7）抑制性突觸后電位（IPSPs）；（8）微小興奮性電位（Minis）；（9）長時程增強（LTP）；（10）長時程抑制（LTD）；（11）熒光染色比率；（12）峰電位串；（13）突觸網(wǎng)絡(luò)信號。可對單細胞以及組織片進行如下模式的記錄：（1）電壓鉗；（2）電流鉗；（3）全細胞記錄；（4）單通道記錄。德國EPC系列產(chǎn)品簡介德國HEKA公司生產(chǎn)的EPC（Extracellular patch clamp）系列放大器的早期型號為EPC 5，這是世界上最早的膜片鉗放大器。此后陸續(xù)升級為EPC 7、EPC 8、EPC 9和EPC 10，EPC 9和EPC 10為全電腦控制的膜片鉗放大器。目前EPC放大器的最高版本為EPC 10膜片鉗放大器。EPC 10 USB膜片鉗放大器主要有如下應用：單通道記錄：可記錄亞pA級的單離子通道電流。l低噪聲全細胞膜片鉗記錄、電壓鉗/電流鉗/低頻電壓鉗（LFVC）記錄：可記錄全細胞膜各種離子通道電流、細胞動作電位