1、丹參在大鼠惡性梗阻性黃疸時對腫瘤細胞凋亡的作用(一)    【關鍵詞】 膽汁淤積；浸潤和轉移；增殖細胞核抗原；丹參；凋亡指數【Abstract】 AIM： To establish malignant biliary obstruction models in SD rats, and to study the effects of Danshen injection on the growth of hepatocellular carcinoma, morphological change and PCNA expression and apopto

2、sis index in carcinoma and pericarcinoma tissues. METHODS： Malignant biliary obstruction model in SD rats was made by vaccination of transplanted tumor in liver nearby the porta hepatis with Walker256 hepatocarcinoma cell line, which infiltrated proximal common bile duct to cause its narrowness and

3、obstruction. The SD rats were divided into 4 groups that were treated ip by 0.9% normal saline (NS) (n=16), by inosine+vitamin C (n=26), by Danshen (n=34) and by 5FU (n=30) respectively. The diameter of transplanted tumor, morphological change and the expression of PCNA and apoptosis index in carcin

4、oma and pericarcinoma tissues were observed. Statistical analysis was made in the experimental data. RESULTS: In Danshen group as compared with NS group and inosine+vitamin C group, the average size of hepatocarcinoma was reduced significantly, the tumor inhibitory rate and the metastasisinhibitory

5、rate were higher obviously (P0.01), PCNA expression was lower (P0.01), apoptosis index was higher (P0.01); while compared with 5FU group, the average size was significantly larger (P0.05) but the metastasisinhibitory rate was lower evidently (P0.05), apoptosis index was higher in carcinoma tissues (

6、P0.05). CONCLUSION： Danshen shows a protective effect against morphological change in SD rat models of malignant biliary obstruction, and exerts an inhibitory effect on the growth of hepatocarcinoma through suppressing the proliferation, increasing the apoptosis of the hepatocarcinoma cells.【Keyword

7、s】 cholestasis; infiltration and metastasis; proliferating cell nuclear antigen; Danshen; apoptosis index【摘要】 目的： 建立惡性梗阻性黃疸模型，通過對模型鼠腹腔內注射丹參注射液，觀察其對肝癌瘤體大小、形態學改變和肝癌、癌周組織中增殖細胞核抗原（PCNA）的表達和腫瘤細胞凋亡表現，評價其作用機制. 方法: 用Walker256肝癌株近肝門部肝實質內種植致移植性肝癌侵襲高位膽管，造成膽道癌性狹窄，以建立SD大鼠惡性梗阻性黃疸模型. 將模型鼠分成4組，并在腹腔內分別注射等量的生理鹽水(n=16

8、)、肌苷+維生素C (n=26)、丹參(n=34)和5FU(n=30). 觀察肝癌瘤體大小、形態學改變和肝癌、癌周PCNA的表達和腫瘤細胞凋亡情況. 對其結果進行統計學分析. 結果: 丹參組肝癌平均瘤體較生理鹽水組和肌苷+維生素C組明顯減小、而抑癌率及抑轉移率明顯高于生理鹽水組和肌苷+維生素C組(P0.01). 丹參組平均瘤體大小明顯大于5FU組，有顯著性差異(P0.05)；而肺抑轉移率明顯低于5FU組(P0.05). PCNA的表達明顯低于生理鹽水組和肌苷+維生素C組（P0.01）. 丹參組腫瘤細胞凋亡指數在肝癌組織和癌周組織中明顯高于生理鹽水組和肌苷+維生素C組（P0.01)，在肝癌組織內

9、高于5FU組（P0.05）. 結論： 丹參在肝癌致梗阻性黃疸時，可促進肝癌細胞凋亡、抑制肝癌細胞增殖，促進腫瘤細胞成熟分化，對腫瘤發展起抑制作用.【關鍵詞】 膽汁淤積；浸潤和轉移；增殖細胞核抗原；丹參；凋亡指數0引言采用Walker256肝癌株近肝門部肝實質內種植致移植性肝癌侵襲高位膽管，造成膽道癌性狹窄，建立SD大鼠惡性梗阻性黃疸模型1. 通過對模型鼠ip注射不同藥物，觀察肝癌瘤體大小、形態學改變、肝癌、癌周組織的腫瘤細胞凋亡指數和增殖細胞核抗原(PCNA)的表達，推斷丹參在肝癌致梗阻性黃疸時對腫瘤細胞凋亡的作用.1材料和方法1.1材料雄性SD大鼠144只，體質量（225±25）g

10、，另備雄性SD幼鼠10只，體質量（100±25）g，以供癌株傳代用，均為華中科技大學同濟醫學院動物實驗中心提供（大鼠和幼鼠均為近交系繁殖和封閉群體飼養）. Walker256肝癌細胞株用人乳腺癌肉瘤誘導傳代培育而成的鼠肝癌株，由中國科學院上海細胞生物所提供，已穩定傳代50次以上. 復方丹參注射液（上海第九制藥廠,批號00124509）. 將Walker256瘤株從液氮中復蘇，在傳代鼠腹腔內進行癌株擴增后,注入傳代SD幼鼠下肢內側皮下. 5 d后，在無菌條件下摘出實體瘤，取邊緣生長活躍的魚肉樣癌組織,切成1 mm×1 mm×1 mm瘤塊，置于冰生理鹽水中漂洗后備接種

11、用. 將SD大鼠用20 g/L戊巴比妥（1.3 mL/kg） ip麻醉后，常規消毒，行腹正中切口進腹，充分顯露肝門，置手術放大鏡視野下，在肝右葉與肝中葉的交界部距肝門5 mm處，用眼科鑷逆膽管走行方向潛行造隧深約3 mm，植入備用的瘤塊后，用棉簽壓迫止血. 依次關腹，結束手術. 常規飼養7 d，即可完成惡性梗阻性黃疸模型鼠的復制1.1.2方法將模型鼠隨機分成4組：A組（生理鹽水治療組）16只，ip生理鹽水，劑量為10 mL/kg×7 d. B組（肌苷+維生素C治療組）26只，ip肌苷+維生素C各5 mL/kg×7 d. C組（丹參治療組）34只，ip丹參10 mL/kg&#

12、215;7 d. D組（5FU組）30只，ip 300 mg/kg×7 d. ip藥物7 d后，用乙醚開放吸入麻醉后，行正中十字切口入腹，沿胸骨正中打開胸腔，迅速剪開心包行左心室插管，先快后慢灌注生理鹽水100 mL和40 g/L多聚甲醛（0.1 mol/L） PB固定液300 mL，剪開右心耳放血. 待全身灌注固定完全后，切取肝臟及腫瘤、肺臟標本. 將組織塊放入40 g/L多聚甲醛溶液中，選材、脫水及石蠟包埋. 記錄腫瘤體積、肝內轉移灶數目及肺轉移情況，并計算：腫瘤體積=長徑×短徑2÷2, 抑癌率=（對照組平均瘤體實驗組平均瘤體）÷對照組平均瘤體

13、15;100%，抑轉移率=（對照組平均轉移率實驗組平均轉移率）÷對照組平均轉移率×100%. 將選取肝瘤組織、瘤周組織行HE染色，進行組織病理學檢查. 同時選取肝癌、癌周組織中PCNA表達的免疫組化檢查（PCNA陽性計數：10個高倍視野下計數100個細胞所含PCNA陽性細胞數）. TUNEL法檢測組織細胞凋亡，將石臘組織標本在石臘切片機上切成4 m厚的連續切片，貼附于經脫片劑(APES)處理的潔凈載玻片上，置烤箱烤3 h，使切片緊密貼附. 其步驟為組織片常規脫蠟至水；微波處理：0.01 mol/L枸櫞酸鹽緩沖液，pH 6.0，至微波中加熱9298之間，持續10 min，微波

14、功率為800 W；封閉內源性DNA酶：DEPC (diethylpyrocarbonate)水洗，室溫放置30 min；加用熒光素(FITC)標記的核昔酸和脫氧核昔酸末端轉移酶混合液，37, 60 min，在熒光顯微鏡下觀察；以滴加TBS緩沖液取代TUNEL反應液的組織切片作為陰性對照；陽性對照用DNA酶I(美國Sigma公司產品). TUNEL陽性信號為黃綠色或黃色熒光，位于胞核，呈小圓形、環行或顆粒狀.有些陽性細胞出現于肝竇中，大約8 m左右的小圓形顆粒. 對TUNEL染色陽性的細胞再結合凋亡細胞的形態學特征(如：染色質濃縮，細胞皺縮與周圍分離，出現有膜包裹的核碎片，即凋亡小體等)進行判定

15、. 每例選擇5個高倍視野，計數1000個癌細胞，計算出凋亡細胞的百分率，即凋亡指數(apoptosis index).統計學處理： 計量數據以x±s表示，多組間比較采用非參數統計分析方法秩和檢驗（KruskalWallis H檢驗）；兩兩比較采用Wilcoxon秩和檢驗，P0.05為差異有統計學意義.2結果2.1肝癌生長轉移A組肝癌細胞生長良好，異型性高，瘤體大于1 cm3時可見瘤體中心部干酪樣壞死；癌周組織中血管豐富，管徑大小不一，分布密集. B組肝癌細胞生長良好，異型性高，瘤體體積大于1 cm3時可見瘤體中心部干酪樣壞死；癌周組織中血管豐富，管徑大小不一，分布密集. C組肝癌細胞

16、生長不良，異型性低，成熟分化比率高，肝癌組織中癌細胞呈片狀病變區，周邊部以細胞凋亡為主，而中心部以細胞壞死為主. 瘤體體積小于1 cm3時就可見瘤體中心部干酪樣壞死；癌周組織中血管稀少，管徑大小均勻，散在分布. D組肝癌細胞生長不良，但異型性高. 瘤體體積大于1 cm3時才可見瘤體中心部干酪樣壞死；癌周組織中血管稀少，管徑大小不一，分布集中. C組的抑瘤率明顯高于B組(P0.01)；而與D組的抑瘤率相比，雖數值上較低，但無統計學意義. C組抑制肝內轉移率和抑制肺部轉移率明顯高于B組(P0.01）；與D組相比，在抑制肝內轉移率方面數值相近；而在抑制肺部轉移率方面，數值上高于D組，但差異無統計學意

17、義（表1）.22肝癌、癌周組織中PCNA的表達和凋亡指數C組在肝癌、癌周組織中陽性細胞數明顯低于A組和B組（P0.01)；與D組陽性細胞數相比，作用效果相近. C組在肝癌、癌周組織中陽性細胞數明顯高于A組和B組（P0.01)；C組在肝癌組織腫瘤細胞凋亡指數高于D組（P0.05，表2).表1各組模型鼠腹腔內藥物注射對肝癌生長轉移的影響表2各組模型鼠肝癌、癌周組織中PCNA的表達和凋亡指數3討論浸潤和轉移是肝癌發展的基本特征2. 膽管浸潤造成膽管狹窄梗阻，臨床表現為AKP增高及梗阻性黃疸. 丹參為唇形科鼠尾草屬植物（Salvia miltiorhiza Bge.），其根入藥. 近半個世紀國內外學者

18、對丹參進行大量研究,先后從中分離得到15種成分，其主要有效化學成分為脂溶性的丹參酮和水溶性的丹參素. 丹參素具有抗血小板聚集、改善微循環、調節血液流變學、增強機體免疫、逆轉慢性肝病纖維化作用、抗脂質過氧化作用及對心肌細胞缺血再灌注損傷的保護作用3，并在臨床得到廣泛應用. 隨著抗癌中藥研究的日益深入，丹參酮的抗腫瘤的基礎和臨床研究得以重視4. 本結果顯示丹參用于肝癌致梗阻性黃疸實驗模型中，C組肝癌平均瘤體較A組和B組減小,而抑癌率和抑轉移率明顯高于A組和B組，C組平均瘤體大小在數值雖然大于D組，但無顯著性差異，提示丹參抑制肝癌生長方面與5FU抗癌藥作用效果相近. 在抑轉移率方面，丹參有明顯抑制肝癌的肝內外轉移，尤其在抑制肝癌的肺部