1、答 辯 人：關 春 龍專 業：生物工程干旱、鹽堿脅迫對苗期干旱、鹽堿脅迫對苗期羊草羊草GSH-Px活性的影響活性的影響 指點教師：崔指點教師：崔 喜喜 艷艷吉林農業大學生命科學學院生物工程專業資料與方法 結果分析與討論結論與致謝目錄前言羊草Leymus chinesis是多年生根莖型禾本科植物，具有無性繁衍才干強、消費力高、耐干旱、耐貧瘠、耐鹽堿等生物生態學特性。谷胱甘肽過氧化物酶(GSH一PX)即谷胱甘肽:H2O氧化復原酶,分子量76009600，是一種水溶性四聚蛋自酶，其四個亞基處在一個平面上，且均有一個硒原子。具有催化活性的硒半胱氨酸位于酶分子178個氨基酸的第35位置上，在酶分子外表凹

2、穴的活性部位，易于接觸有機氫過氧化物并使其復原為有機羥化物;GSH一PX也可使H2O2變成H2O，以消除氧化脅迫。復原型谷胱甘肽(GSH)在催化反響中作為氫供體，氧化型谷胱甘肽(GSSG)在谷胱甘肽復原酶(GSSG一R)作用下，復原成GSH。 本研討以不同鹽堿化程度及干旱程度下的羊草為實驗對象，討論羊草體內谷胱甘肽過氧化物酶對鹽堿和干旱環境的活性，進一步提示羊草抗干旱、鹽堿及順應不同生鏡的機制，力求為治理退化草地提供實際根據資料與方法實驗資料與資料培育1.羊草2.吉林農業大學生命科學學院生物化學515研討室，RXZ型智能人工氣候箱資料培育方法與管理1. 盆栽砂培2.人工氣候箱培育，出苗前每天上

3、午8:00-8:30分澆去離子水50mm透灌，苗出齊后澆Hoagland營養液，照光時間12h(早7:00-晚19:00)。白天溫度為282，夜間溫度為16212資料與方法實驗資料處置方法出苗2周后，每天下午4:00-4:30分，對不同種類分別用鹽堿水、PEG 6000處置1.2.3天。每天澆適量的水以補充蒸發耗分。不同時間處置的種類都有對照CK，單純用Hoagland全營養液透灌實驗資料取樣方法處置時間到后，選擇均勻一致的3盆測定樣品，分別剪取葉片，洗凈根后液氮速凍，-20冰箱保管備用34鹽堿水、PEG6000的配置及濃度2 23 34 46 65 51 11.實驗方法 用0. 2 mo l

4、 /L pH 6. 2的磷酸緩沖液 ( 含 1 mmo l/L EDTA-2Na，5%的水溶性PVP)作為谷胱甘肽過氧化物酶GSH一PX的提取介質，偏磷酸為酶促反響的蛋白質沉淀劑, 二硫代對二硝基苯甲酸 (DTNB ) 與 GSH顯色反響3min, 在412 nm測定酶管和非酶管的OD值, 以測定谷胱甘肽過氧化物酶的活性。測定工程與方法3 31 16 65 54 42 22. 測定時間苗期；實驗數據采用3個反復的平均值規范差，用DNS軟件進展數據分析測定工程與方法2 23 31 16 65 54 4測定工程與方法3.試劑的配制a迭氮鈉-磷酸緩沖液NaN3-PBS，PH7.0:2.5mmol/L

5、 NaN3，0.2mmol/L EDTA-2Na，0.2mol/L Na2HPO4和0.2mol/L NaH2PO4。b.偏磷酸沉淀夜：含1.67%HPO3，0.05% EDTA-2Na，28%NaCl。c.0.61mol/L 三氯乙酸TCA。d.0.32mol/L Na2HPO4。e.1.0mmol/L GSH溶液當日配制：3.07mgGSH用NaN3-PBS溶解至10ml。f.1.5mmol/L H2O2當日配制：取30% H2O2 15l，以雙蒸水定容至100ml。g.DNTB顯色液：DTNB 20mg加1%檸檬酸三鈉50ml溶解2 23 31 16 65 54 4測定工程與方法4.蛋白

6、質與GSH規范曲線的制造 汲取樣品液1.0ml于試管中，參與5ml考馬斯亮藍試劑，搖勻，放置2min后在595nm下比色測定光吸收度并經過規范曲線查得蛋白質含量。樣品中的蛋白質含量mg/g=CVT/VSWF1000式中：C查規范曲線值，g；VT提取液總體積，ml；VS樣品鮮重，g；WF測定時加樣量，ml 取上述標液1. 6ml,加0. 32 mol/ LNa2HPO4 2. 0 ml和DTNB 0. 4 m l,顯色5min,于412nm比色,同雙蒸水調零。以OD值為縱坐標, GSH濃度為橫坐標,制規范曲線2 23 31 16 65 54 4測定工程與方法5.酶液的提取 分別取經鹽堿和干旱處置

7、過的新穎羊草幼苗葉片及根莖，0.5g參與0.2mol/Ld的磷酸緩沖液含1mmol/L EDTA-2Na，5%的水溶性PV P, pH 6. 2) 5 m l, 冰浴中研磨成勻漿, 4000 r /min離心10min,取上清液于12000 r /min離心5min, 取上清液供酶活力測定用2 23 31 15 54 46 66.酶活力測定測定工程與方法 取上述酶液各0. 4 ml,分別注于酶管和非酶管中,并將非酶管加熱使酶失活,分別參與1. 0 mmol/ L GSH 0. 4 ml和經37預熱的1. 5 mmol /L H2O2 0. 2 ml, 立刻于37下反響3min, 再在2支試管中

8、參與1. 67%的偏磷酸沉淀液4. 0 ml, 2000 r/m in離心10 min,保管上清液。另取2支試管分別參與上述清液2. 0 m l;再取1支試管加雙蒸水0. 4 m l和1. 67%的偏磷酸沉淀液1. 6 ml作為空白管,并在這3支試管中各參與0. 32 mol/ L Na2HPO4 2. 5ml和DTNB 0. 5 ml, 反響5 min, 在412nm處比色讀取OD值。按下式進展計算: GSH-Px活力U= 非酶管OD412-酶管OD412A6.25/5min1ml樣液中蛋白質mgA=規范GSHm/規范GSHOD412，即規范曲線的斜率;酶活力單位U，IU=GSH1mol/m

9、g蛋白質min 結 果 與 分 析干旱脅迫對苗期羊草GSH-Px活性的影響1鹽堿脅迫對苗期羊草GSH-Px活性的影響2干旱脅迫對苗期羊草葉片GSH-Px活性的影響 干旱脅迫對苗期羊草葉片GSH-Px活性的影響規律為：處置三天的GSH-Px活性處置兩天的GSH-Px活性處置一天的GSH-Px活性。在同等天數處置的的條件下GSH-Px活性隨著PEG濃度的上升而上升。在同等干旱濃度條件下GSH-Px活性隨著處置天數的添加而上升干旱脅迫對苗期羊草根GSH-Px活性的影響 干旱脅迫對苗期羊草根的GSH-Px活性的影響規律為：處置三天的GSH-Px活性處置兩天的GSH-Px活性處置一天的GSH-Px活性。

10、處置同等天數的條件下GSH-Px活性隨著PEG濃度的上升而上升。在同等干旱濃度條件下GSH-Px活性隨著處置天數的添加而上升 同時在同一干旱濃度和處置天數的條件根底上羊草葉片中的GSH-Px的活性要高于根的GSH-Px活性鹽堿脅迫對苗期羊草葉片GSH-Px活性的影響 對苗期羊草葉片GSH-Px活性的影響規律為：處置兩天的GSH-Px活性處置三天的GSH-Px活性處置一天的GSH-Px活性。處置同等天數的條件下GSH-Px活性隨著鹽堿濃度的上升而上升，到達相應鹽堿濃度的峰值后隨著鹽堿濃度的上升而下降。在同一鹽堿濃度條件下，羊草葉片GSH-Px活性隨著天數的上升而上升，到達相應天數的峰值后隨著天數

11、的上升而下降鹽堿脅迫對苗期羊草根GSH-Px活性的影響 鹽堿脅迫對苗期羊草根的GSH-Px活性的影響規律為：處置兩天的GSH-Px活性處置一天的GSH-Px活性處置三天的GSH-Px活性。處置同等濃度的條件下GSH-Px活性隨著鹽堿濃度的上升而上升，到達相應鹽堿濃度的峰值后隨著鹽堿濃度的上升而下降。在同一鹽堿濃度條件下，羊草根的GSH-Px活性隨著天數的上升而上升，到達相應天數的峰值后隨著天數的上升而下降。 同時在同一鹽堿濃度和處置天數的條件根底上羊草葉片中的GSH-Px的活性要高于根的GSH-Px活性結結 論論 經過對羊草谷胱甘肽氧化物酶在鹽堿和干旱環境下的活性的研討，可得知，羊草的抗干旱才

12、干要優于其抗鹽堿才干。因此可經過人工培育或挑選等方法選出抗鹽堿才干高的植株進展培育，并充分利用羊草成苗具有的強大無性繁衍才干和抗鹽堿優勢，大面積快速建植人工羊草種群，可快速重建鹽堿地羊草植被，羊草根莖穿透侵占才干很強，且能構成強大的根網，盤結固持土壤作用很大，對表層土壤起到明顯的保水作用，同時改善了土壤的地溫條件，有效地控制了水土流失，可改善生態環境，明顯是很好的水土堅持植物。且羊草產量高，增產潛力大，各類家畜一年四季均喜食。同時本文也為日后羊草等禾本科植物的研討提供了一定的參考。 本文是在崔喜艷教師的指點下完成的。崔教師嚴謹的治學態度和寬廣的科研視野令我受害匪淺，同時也為我營造了一種良好的學術氣氛，置身其間，耳濡目染，潛移默化。崔教師在百忙之中多次給予指點并提出珍貴的意見，本文才得以成型