1、青少年特發性脊柱側凸可溶性瘦素受體水平異常的機制研究及脊柱畸形相關臨床研究第一章青少年特發性脊柱側凸可溶性瘦素受體水平異常的機制研究背景青 少年特發性脊柱側凸 (adolescent idiopathic scoliosis,AIS) 是最常見的三維 脊柱畸形,最常累及 10-16歲的青春期女孩 ,若未及時發現和干預 ,脊柱側凸可不 斷加重以致影響呼吸、循環功能 ,甚至可導致患者死亡。然而目前關于 AIS 的病 因和發病機制仍不明確。既往研究發現 AIS患者具有異常的生長特征。AIS患者 與正常同齡青少年相比具有較高的校正身高和生長高峰速度、 較低的體重和體質 量指數 (bodymassind

2、ex,BMI) 以及較較低的骨密度 , 而這種異常生長特征被認為 可能與 AIS 的發生發展相關。諸多學者都提出假說試圖解釋 AIS 患者的這種異常生長特征 , 其中瘦素代謝 異常假說獲得了廣泛關注。 瘦素是一種調節青春期女孩生長發育的一種重要的激 素,主要由脂肪組織分泌 , 可穿透血腦屏障與下丘腦的瘦素受體結合 , 通過負反饋 調節機制調控骨和脂肪組織的生長代謝。AIS患者的這些異常生長特征高度提示 可能存在瘦素代謝調節系統的異常。可溶性瘦素受體 (soluble leptin receptor,sOB-R) 是調控瘦素生物利用度和跨血腦屏障運輸的關鍵因素之一 , 它 是由跨細胞膜瘦素受體(

3、主要為OB-Ra和OB-Rb)的膜外部分經去整合素金屬蛋白 酶 (A Disintegrin and Metalloproteinase,ADAM)水解后溶于外周血后形成。sOB-R可通過結合游離瘦素調節外周痩素的生物利用度，并可促進瘦素跨血 腦屏障運輸,從而增強中樞瘦素的活性。既往研究顯示,AIS患者外周血sOB-R水 平高于正常對照 , 且游離瘦素指數 (血清瘦素 / 可溶性瘦素受體水平 ,FLI, 反應瘦 素生物利用度)則低于正常對照,高度提示AIS患者存在因sOB-R水平異常導致的 瘦素生物利用度異常，并且這種瘦素生物利用度異常可能是 AIS患者異常生長特 征和脊柱側凸發生發展的重要原

4、因。然而,目前對于AIS患者外周血sOB-R水平 異常的機制仍缺乏研究。由于ADAM是調節sOB-R生成的關鍵酶，因此本研究將進 一步探究ADAM是否在AIS外周血sOB-R水平異常中發揮作用。第一節可溶性瘦素受體生成機制的研究目的：通過構建OB-Ra和OB-Rb過表 達穩轉細胞株探究與生成sOB-R相關的ADAM勺亞型。方法：首先構建人瘦素受體 (OB-Ra和OB-Rb過表達慢病毒載體,然后將慢病毒載體轉入表達各種 ADAME型 的293T細胞中,從而建立OB-Ra和OB-Rb過表達穩轉細胞株。然后將過表達穩轉 細胞株分組,分別加入ADAM1抑制劑GI254023X(GI)、ADAM1(和A

5、DAM17抑制 劑GW280264X(GW)g過檢測并比較各組間細胞培養液上清中 sOB-R的濃度，確 認與sOB-R生成相關的ADAME型。結果:1.OB-Ra和OB-Rb過表達細胞株熒光表 達率在80-90%以上,均能高水平合成相應瘦素受體亞型 mRNAg轉細胞株構建成 功;2.OB-Ra過表達細胞GI組和GV組培養24小時后培養基中sOB-R含量較對照 組分別下降 45.0%和 51.4%,培養48小時后較對照組分別下降 52.1%和61.0%。3.OB-Rb過表達細胞GI組和GW&培養24小時后培養基中sOB-R含量較對 照組分別下降 38.5%和36.8%,培養48小時后較對

6、照組分別下降 46.2%和51.1%。 結論:OB-Ra和OB-Rt過表達穩轉細胞均能高表達相應瘦素受體亞型，穩轉細胞株 構建成功。跨膜瘦素受體水解生成可溶性瘦素受體依賴于 ADAMt白酶,其中ADAM 1 0發揮主要作用 ,ADAM 17發揮次要作用。第二節青少年特發性脊柱側凸去整合 素金屬蛋白酶水平與異常可溶性瘦素受體水平的關系目的：評估AIS患者體內ADAM10口 ADAM1的表達情況,從上游探究AIS sOB-R水平升高的原因,從而進一 步闡明瘦素生物利用度異常與脊柱側凸病因學之間的關系。方法:收集30例AIS患者和30例同齡正常青少年的外周血，提取白細胞中 RNA通過 Real-ti

7、me PCR 方法檢測 OB-Ra、OB-Rb ADAM10和 ADAM17 mRN的 合成水平 , 并通過酶聯免疫吸附測定法 (Enzyme Linked ImmunoSorbent Assay,ELISA)檢測AIS患者和對照組血清中瘦素、sOB-R ADAM10口 ADAM17勺 含量,比較AIS患者和同齡正常青少年之間是否存在差異。結果:AIS患者血清瘦素水平顯著低于正常對照組 (7.3 ± 4.8 ng/ml vs.8.7± 4.2ng/ml,P=0.044),sOB-R 水平顯著高于正常對照組 (26.8 ±6.9 ng/mlvs.22.5 士 6.1

8、 ng/ml,P = 0.012)。AIS患者ADAM10 mRNA成水平和血清含量均顯著高于對照組(P<0.05),而ADAM1的mRN合成水平和血清含量與對照組無顯著差 異。結論:AIS患者的外周血sOB-R含量和ADAM1表達水平均顯著高于正常青少 年,而跨膜瘦素受體表達水平與正常青少年無顯著差異,AIS患者高sOB-R水平可能是由ADAM1表達升高引起。第二章脊柱畸形相關臨床研究第一節 Lenke 1 型青少年特發性脊柱側凸后路 矯形術后頸椎矢狀面最終形態的預測因素 :一項長期隨訪研究目的 :1. 評估Lenke 1型AIS患者行后路矯形手術術前、術后即刻和末次隨訪時的頸

9、椎矢狀面 形態,分析 Lenke1 型患者術前、術后的頸椎矢狀面代償模式。 2.尋找可以預測 AIS最終(末次隨訪)頸椎矢狀面形態的術前或術后即刻的影像學參數。方法：回顧性分析 44 例于本院脊柱外科行后路矯形手術、術后隨訪至少 5 年的 Lenke1 型AIS患者。收集所有患者的術前、術后即刻和末次隨訪的影像學和臨床資料。在站立位全脊柱正側位X線片上測量以下影像學參數：胸主彎Cobb角(Main thoracic curve,MTC)、上胸彎 Cobb 角(Proximal thoracic curve,PTC)、頸椎 前凸角 (Cervical lordosis,CL) 、頸椎矢狀垂直偏距

10、 (Cervical sagittal vertical axis,CSVA) 、 T1 傾斜角 (T1 slope,T1S) 、上胸椎后凸角 (Upper thoracic kyphosis,UTK) 、主胸椎后凸角 (Main thoracic kyphosis,MTK) 、全胸 椎后凸角 (Globalthoracickyphosis,GTK) 、腰椎前凸角 (Lumbarlordosis,LL) 、 骶骨傾斜角 (Sacrum slope,SS) 、骨盆入射角 (Pelvicincidence,PI) 、骨盆傾斜 角(Pelvictilt,PT) 。通過Pearson相關性分析、逐步多

11、元線性回歸分析和受試 者工作特征曲線 (Receiver operator characteristic,ROC) 尋找可以預測最終 (末次隨訪)頸椎矢狀面形態的術前和術后即刻的影像學參數。結果:44例Lenke 1型AIS患者CL由術前的-6.6 ° ± 8.8。改善為術后即刻的-3.8 ° ± 8.7 ° ,并在 末次隨訪時改善為0.5 ° ± 7.3 °。CSVA術后減小，但差異未達統計學意義。35例(79.5%)患者術前頸椎矢狀面形態表現為后凸或曲度變直 ,其中 9例 (25.7%)患者在末次隨訪時獲得了前

12、凸的頸椎矢狀面形態 ;9 例(20.5%)患者術前 頸椎矢狀面形態表現為前凸 , 且在末次隨訪時均維持前凸狀態。 Pearson 相關性 分析表明術前CL僅與T1S和UTK相關,而術后CL與T1S UTK和 GTK勻相關。多 元線性回歸分析得到最終 CL的預測方程：最終CL=-2.80+ 0.51 X術前CL+ 0.53 X術后即刻TIS °ROC曲線顯示術前CL > -4.5。和術后即刻T1S > 11.3。是最 終頸椎矢狀面形態為前凸型的預測因素。結論： 隨著后路脊柱畸形矯形術后整體和胸椎局部的矢狀面形態的重 建,Lenke 1型AIS患者的CL顯著增大,頸椎矢狀面形

13、態顯著改善。由于手術的 干預 , 術前和術后的頸椎矢狀面代償模式存在差異。對于 Lenke1 型 AIS 患者, 術 前CL和術后即刻T1S可作為預測最終頸椎矢狀面形態的預測因素。第二節硬膜 外脂肪增多癥一一一個易忽視的脊柱后凸畸形繼發性椎管內異常目的 ： 驗證如下 猜想:SEL是各種脊柱后凸畸形常見的繼發性椎管內異常。方法: 回顧性分析 16 例先天性脊柱后凸 (Congenitalkyphosis,CK) 患者、40 例休門氏病 (Scheuermann kyphosis,SK) 患者、 13 例結核性脊柱后凸 (Tuberculotic kyphosis,TK) 患者,以及 69例年齡和

14、性別匹配的正常對照的臨床 和影像資料。記錄患者的體質量指數 (body mass index,BMI), 在全脊柱側位 X 線片上測量后凸Cobb角。在全脊柱矢狀面MRI上測量以下參數：頂椎區硬膜外脂 肪矢狀徑(EFA)、硬膜囊矢狀徑(DSA),以及非后凸區硬膜外脂肪矢狀徑(EFN)、硬 膜囊矢狀徑(DSN)。分別計算頂椎區和非后凸區的硬膜外脂肪比(EFR):EF/(EF + DS)。結果:CK組、SK組和TK組患者的EFA和和EFRA顯著高于正常對照組 (P<0.05) 。 7 例 CK 患者(43.8%) ,8 例 SK 患者(20.0%) , 和 11 例 TK 患者 (8

15、4.6%)達到SEL的診斷標準,而正常對照組僅分別有1例(6.3%)、1例(2.5%)和 0 例(0%)達到 SEL 診斷標準(P = 0.019,0.014,<0.001)。Spearman相關性分析顯示,在三組患者中，脊柱后凸Cobb角與硬膜外脂肪量均存在顯著相關性。 結論:SEL是各種脊柱后凸畸形常見的繼發性椎管內異常。由于過多的硬膜外脂肪可壓迫脊髓產生神經損害 , 因此脊柱外科醫生應重視 該現象。第三節Chiari畸形I型后顱窩減壓術后頸椎管再塑形目的：評估Chiari 畸形I型(Chiari malformation type I ,CMI)伴脊髓空洞患者后顱窩減壓術

16、(posterior fossa decompression,PFD) 后頸椎管直徑和錐度是否改變 , 并分析其 與空洞緩解是否相關。方法：回顧性分析39例于本院脊柱外科行PFD手術、隨訪 至少一年的CMI伴脊髓空患者的影像學資料。將患者分為PFD術后脊髓空洞改善 組(syrinx-improved,SI 組)和脊髓空洞未改善組(syrinx-unimproved,SU 組),SI組共有30例患者,SU組共有9例患者。在T2加權相MRI正中矢狀位掃描層面上測量 C2-7節段頸椎管前后徑，以椎 體節段為橫坐標椎管前后徑為縱坐標繪制散點圖 , 利用 Excel 軟件繪制二元回歸 方程趨勢線，該趨勢線的斜率記為頸椎管錐度(mm/節段)。比較術前和術后以及 SI組和SU組間頸椎管前后徑和椎管錐度是否存在差異。結果 ：在SI組中,PFD 術后各節段頸椎管前后徑均減小，其中C2、C3 C4 C6和C7減小程度達到統計 學意義(P = 0.001,0.011,0.028,0.047 和0.045),而在SU組中,各節段術前、術后頸椎管前后徑均無顯著變化。 SI 組 C