1、氮和磷對淺水水庫中的浮游植物的共同限制作用：以磷的限制作用作為范例作者：斯蒂芬妮·繆勒·M·米特洛維奇2013年9月16日接收，2014年10月7日修訂，2014年10月12日被修訂，2014年11月四日在線出版，2014年瑞士斯普林格國際出版社。摘要 磷的限制作用被認(rèn)為是淡水系統(tǒng)中的一個(gè)規(guī)則，也是控制浮游植物增長的基礎(chǔ)。格雷爾姆斯頓水壩是一個(gè)中營養(yǎng)的淺水水庫，我們猜想在格雷厄姆斯頓水壩中的浮游植物增長在不同季節(jié)和不同實(shí)驗(yàn)性時(shí)標(biāo)的限制營養(yǎng)元素都為磷。在不同的季節(jié)現(xiàn)場指導(dǎo)七個(gè)附加氮和磷的完全因子微觀實(shí)驗(yàn)。此次長時(shí)間跨度實(shí)驗(yàn)的影響將會在兩個(gè)18天的中型實(shí)驗(yàn)中進(jìn)行測試。

2、氮和磷元素的共同添加比控制處理其中一個(gè)單一因子的實(shí)驗(yàn)更能誘發(fā)單個(gè)藻類的浮游植物生物量和生物體積的增長。在水中添加磷的微觀試驗(yàn)中會出現(xiàn)一些重要的反應(yīng)。在中型試驗(yàn)中，一些物種首先是對氮和磷的聯(lián)合添加做出反應(yīng)，然后才是對磷的單獨(dú)添加做出反應(yīng)。我們的結(jié)果顯示，磷不是在所有的季節(jié)里都是限制性營養(yǎng)元素，但浮游植物生長最受限制的營養(yǎng)元素是氮和磷。一個(gè)更長實(shí)驗(yàn)性的時(shí)間跨度也沒有改變生物量水平的結(jié)果，這表明加入氮和磷都是控制浮游植物生長的方法。關(guān)鍵詞 營養(yǎng)共限制作用 藻類爆發(fā) 藍(lán)藻細(xì)菌 水庫管理介紹 浮游植物大量增殖，特別是由有毒的藍(lán)藻細(xì)菌主導(dǎo)的增殖，由于產(chǎn)生強(qiáng)有力的毒素會對飲用水的供應(yīng)造成嚴(yán)重后果。因此，飲用

3、水管理的目標(biāo)之一就是控制造成浮游植物增長的原因向水中排放大量富營養(yǎng)元素氮和磷。在這兩種主要的營養(yǎng)元素中，磷一直是淡水系統(tǒng)營養(yǎng)管理的焦點(diǎn)，減少湖泊和水庫中磷的排放在許多案例中成功的藻類和藍(lán)藻的生物量。但是，氮的單獨(dú)作用同樣可以限制浮游植物的生產(chǎn)效率，而且越來越多的證據(jù)表明有時(shí)會出現(xiàn)兩中營養(yǎng)元素對浮游植物的共限制作用。因此在某些湖泊，控制氮元素的含量也和控制磷元素一樣重要。而且營養(yǎng)元素的限制作用也會出現(xiàn)季節(jié)性的變化，同時(shí)不同的湖泊也會出現(xiàn)不同的情況。盡管磷的限制作用會出現(xiàn)在一年中的大部分時(shí)間，但有時(shí)會在春季出現(xiàn)磷和硅酸鹽的共限制作用，在秋季會出現(xiàn)氮和磷的共限制作用。研究者發(fā)現(xiàn)，在磷為主要限制因素的

4、湖泊中，有些月份，氮和磷都不成為限制因素，而剩下的月份氮成了唯一的限制性因素。相反由氮作為主要限制因素的湖泊在初夏的一小段時(shí)間內(nèi)磷會成為主要限制因素，隨后在轉(zhuǎn)向氮成為主要限制因素前會有一段氮和磷共同限制的時(shí)間。因?yàn)樵谠孱惿L階段限制性營養(yǎng)因素的改變對藻類爆發(fā)的形成至關(guān)重要，所以在這些改變發(fā)生前或發(fā)生時(shí)控制某一特定的營養(yǎng)元素可能非常重要，而更為重要的是要在這一年剩下的時(shí)間內(nèi)控制其他營養(yǎng)元素。無論浮游植物的增長是有氮或者磷控制的，對其評估通常都是用原地富營養(yǎng)化實(shí)驗(yàn)。基于李比希最小因子定律，能引起浮游植物生物量最大限度增長的營養(yǎng)物質(zhì)被認(rèn)為是其增長的限制性因子。生物量的增長通常由葉綠素a來確定，少數(shù)情

5、況由細(xì)胞總數(shù)來確定。原地富營養(yǎng)化實(shí)驗(yàn)從空間到時(shí)間都有很大變化，涉及對整個(gè)富營養(yǎng)化的湖從事數(shù)年的研究到很小體積的幾天的微觀實(shí)驗(yàn)。過去從微觀實(shí)驗(yàn)推斷整個(gè)生態(tài)系統(tǒng)的過程受到質(zhì)疑。辛德勒和卡彭特提出像微觀實(shí)驗(yàn)?zāi)菢釉跁r(shí)間和空間上降低尺度會得出生態(tài)學(xué)角度的不切實(shí)際的結(jié)果。他們的理由包括排除了群落的特殊性和忽視了進(jìn)化的緩慢過程。但是，研究表明在富營養(yǎng)化的研究中，藻類對體積和比表面積的反應(yīng)并不會有強(qiáng)烈的變化，即使是像幾升水到一個(gè)小池塘的中型實(shí)驗(yàn)也是如此。因此，小型實(shí)驗(yàn)所檢測的浮游植物對營養(yǎng)物質(zhì)的直接反應(yīng)可以合理的代表大規(guī)模實(shí)驗(yàn)所出現(xiàn)的情況。考慮到環(huán)境影響，成本和復(fù)制能力，微型實(shí)驗(yàn)是調(diào)查飲用水儲存點(diǎn)限制性營養(yǎng)因

6、子的最優(yōu)選擇。時(shí)間尺度在富營養(yǎng)化實(shí)驗(yàn)的結(jié)果中占有重要地位。在11天的瓶中實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)生物總量首先受到氮元素含量的限制，接著不會受到營養(yǎng)元素的限制，最后會受到磷元素的限制。斯皮瓦克等人同樣在他們七天的試驗(yàn)中提出藻類對營養(yǎng)富集的反應(yīng)隨時(shí)間的變化呈現(xiàn)明顯的不同，物種水平上的生長反應(yīng)比總體的生長或生物量的增長更容易受到時(shí)間的影響。每一個(gè)浮游植物種群在一定的生長條件下，例如溫度，光照和有效營養(yǎng)成分，都有其最優(yōu)的生長速率。不同物種的最優(yōu)生長速率的巨大差異導(dǎo)致不同物種在相同條件下生長速率的不同。這對考慮物種水平上的生長反應(yīng)是否能用來預(yù)測有害物種的生長是很重要的。特別是在相似的溫度模式下，藍(lán)藻門的生長速率比綠藻門

7、的生長速率緩慢，這就表明藍(lán)藻門對營養(yǎng)富集的反應(yīng)可能不會被快速檢測到。格雷厄姆斯頓水壩是澳大利亞東南部的一個(gè)中營養(yǎng)淺水飲用水水庫，我們檢測了格雷厄姆斯頓水壩中氮和磷對浮游植物的限制作用。這個(gè)水庫有一個(gè)小的天然的森林集水，當(dāng)需要的時(shí)候會從附近的河流用泵抽水來保持水位。這一過程會將營養(yǎng)物質(zhì)帶出湖泊中，因?yàn)楹又袪I養(yǎng)物質(zhì)的濃度比湖中更高。湖中存在著潛在的有毒的藍(lán)藻細(xì)菌，但它不是湖中浮游植物的優(yōu)勢種。但是，可以確定的是水中營養(yǎng)物質(zhì)的增加會導(dǎo)致藍(lán)藻細(xì)菌的爆發(fā)。我們的目標(biāo)是在群落和種群的基礎(chǔ)上找到限制浮游植物生長的營養(yǎng)元素，從而確定限制性營養(yǎng)因子是否隨季節(jié)變化而不同，同時(shí)在群落和種群水平上檢驗(yàn)的不同實(shí)驗(yàn)階段是

8、否影響浮游植物對營養(yǎng)富集的反應(yīng)。方法研究地點(diǎn)格雷厄姆斯頓大壩是位于澳大利亞新南威爾士東海海岸紐卡斯?fàn)柋泵?0公里處的一個(gè)淺水水庫。其28平方公里的湖面提供了一個(gè)很大的風(fēng)浪區(qū)，使湖水得到很好的混勻，同時(shí)湖水較淺處平均深度為7米。在夏季時(shí)，湖水的短期溫度分層可以持續(xù)21天。由73平方公里的集水區(qū)有時(shí)可能無法滿足飲用水的要求。作為補(bǔ)充，可從湖泊北部的威廉姆斯河抽取水來保持湖面水位。因?yàn)楹铀械臓I養(yǎng)物質(zhì)濃度高于湖水，所以這一過程會導(dǎo)致湖水營養(yǎng)物質(zhì)含量的上升。根據(jù)國際經(jīng)濟(jì)與發(fā)展組織的規(guī)定，這個(gè)湖目前被列為中營養(yǎng)湖。在這次研究中所選的三種不同的位置都各有獨(dú)特的 環(huán)境特點(diǎn)。3點(diǎn)接近布雷克羅運(yùn)河，是最淺的，也

9、是保護(hù)最好的地點(diǎn)（深度4-6米，依賴湖水的容量）。2點(diǎn)接近湖的中心，風(fēng)力最大且最深的地方（9-10米）。1點(diǎn)接近飲用水取水地，深度為7到9米。每個(gè)地點(diǎn)都用浮標(biāo)長期標(biāo)記。圖表 1三個(gè)實(shí)驗(yàn)位置的的地點(diǎn)，在格雷厄姆斯頓湖內(nèi)用實(shí)心點(diǎn)標(biāo)注。坐標(biāo)點(diǎn)分別是南緯324560 東經(jīng)1514744（1點(diǎn)） 南緯324423 東經(jīng)1514831（2點(diǎn)） 南緯324241 東經(jīng)151491（3點(diǎn)）。插圖中的實(shí)心點(diǎn)表示湖泊在澳大利亞的大概位置。格雷厄姆斯頓大壩中經(jīng)過濾后氮氧化物和溶解性磷化物的濃度范圍分別是8-50和5-30。和湖中的水相比，威廉姆斯河中氮和磷 的濃度高于湖水，而湖中的水是由威廉姆斯河經(jīng)布雷克羅運(yùn)河進(jìn)入

10、湖中的。河中氮氧化物和溶解性磷化物的濃度范圍分別是66-450和31-120。湖中的浮游植物中生物量占主導(dǎo)地位的是綠藻類和硅藻類，個(gè)體數(shù)量占主導(dǎo)地位的是無毒的藍(lán)藻類。湖中存在潛在的有毒的藍(lán)藻門中的囊藻屬，項(xiàng)圈藻屬，絲囊藻屬。囊藻屬的細(xì)胞密度通常在1000 個(gè)/ml左右，而項(xiàng)圈藻的細(xì)胞密度很少能達(dá)到1000個(gè)/ml。從1992年以來，在兩種不同的情況下，囊藻屬的細(xì)胞密度可以一直增長超過30000 個(gè)/ml，項(xiàng)圈藻的細(xì)胞密度可以超過20000個(gè)/ml，然而絲囊藻直到2000年以后才被偶爾的記錄。微觀富營養(yǎng)化實(shí)驗(yàn)為了確定浮游植物生長的限制性營養(yǎng)因素和其隨季節(jié)潛在的變化，原地富營養(yǎng)化微觀實(shí)驗(yàn)在三個(gè)位置

11、分別于2009年4月，2009年8月，2010年2月，2010年5月，2010年10月，2011年5月，2011年8月進(jìn)行試驗(yàn)。每一個(gè)微觀實(shí)驗(yàn)持續(xù)4天（從第一天的中午12點(diǎn)到第五天的中午十二點(diǎn)）。 圖表 2 由圖為葉綠素a在不同季節(jié)的富營養(yǎng)化微觀試驗(yàn)中的濃度，實(shí)驗(yàn)時(shí)間為2009年4月到2011年8月，氮的實(shí)驗(yàn)(N)，磷的實(shí)驗(yàn)(P)，氮磷實(shí)驗(yàn)(NP)，對照組實(shí)驗(yàn)(C)，初始濃度（I）是先于營養(yǎng)實(shí)驗(yàn)的第一天測量的。誤差線是平均值的標(biāo)準(zhǔn)誤差，n=3三個(gè)不同營養(yǎng)成分的處理和一組空白試驗(yàn)都在三個(gè)不同位置分別作了相同的測試：以KNO3的形式加入500的氮，以KH2PO4的形式加入200的磷，同時(shí)加入上述相

12、同濃度濃度的兩種物質(zhì)作為一次單獨(dú)處理（氮磷處理），選擇此營養(yǎng)濃度是為了讓初始營養(yǎng)濃度過剩但卻未超過澳大利亞淡水系統(tǒng)的預(yù)期范圍。這次試驗(yàn)在每個(gè)點(diǎn)設(shè)置了2各貨架，每個(gè)架臺有六個(gè)1.25升的聚乙烯瓶放置在水面，以確保充足的光照。貨架放置在透光層，在塞克盤深度的一半位置，受到的輻射大約為水表面的25%。在每一點(diǎn)，大約25升水濾過63微米的浮游生物網(wǎng)進(jìn)入塑料瓶箱中。箱子中裝滿了塑料瓶，只在上層留了一些空間。加入氮磷培養(yǎng)液從而達(dá)到預(yù)期濃度，然后塑料瓶裝滿了上部，并通過旋轉(zhuǎn)而混勻。過濾湖水是為了排除湖水中的浮游動物，因此可以排除浮游動物對浮游植物動力學(xué)改變的影響。大于63微米的部分被檢測過了，過濾后將藍(lán)藻和

13、其他較大的藻類排除在外。浮游植物，葉綠素a和營養(yǎng)物質(zhì)濃度的樣品采集在第一天和第五天。第一天的樣品是從過濾后的箱子中取出并分為三分。浮游植物樣品中要加入魯格試劑，加入營養(yǎng)物質(zhì)后的濃度需要第一天在替代瓶中測量。需要準(zhǔn)備三個(gè)相同的替代瓶,氮磷處理的水樣也用相同的方法。營養(yǎng)物質(zhì)樣品用0.45微米的濾膜過濾。溶解氧，pH，和溫度在第一天和第五天分別在三個(gè)位置的瓶中測量。中型富營養(yǎng)化實(shí)驗(yàn)原地中型實(shí)驗(yàn)是用來檢測在富營養(yǎng)化的條件下延長浮游植物的培養(yǎng)時(shí)間對其生長所產(chǎn)生的影響。實(shí)驗(yàn)從2013年1月17日到2013年2月4日，從2013年3月21日到2013年4月8日。格雷厄姆斯頓位置三的中型實(shí)驗(yàn)與之前的微觀實(shí)驗(yàn)顯

14、示的結(jié)果一樣，浮游植物在這一點(diǎn)的生長速度要高于其他兩點(diǎn)，同樣這一點(diǎn)的藍(lán)藻含量通常也要高一些。然而位置三是這三個(gè)位置中保護(hù)的最好的一點(diǎn)。同時(shí)，位置三的微觀實(shí)驗(yàn)的操作過程就是上面所描述的。營養(yǎng)物質(zhì)的處理與微觀實(shí)驗(yàn)相同。中型實(shí)驗(yàn)是將熱封的聚乙烯薄膜放入長2米，寬1.5米的袋子中。一個(gè)上端開口，用堅(jiān)硬塑料管固定的圓柱體（直徑1米，長1.5米）附在袋子的頂部和底部。這個(gè)中型實(shí)驗(yàn)袋附著于三個(gè)漂浮的框架（2×2×2米），沒一次的營養(yǎng)物質(zhì)的實(shí)驗(yàn)對應(yīng)一個(gè)框架。中型實(shí)驗(yàn)大約充滿1000升未過濾的湖水。綜合第1天，第5天，第9天，第13天，第19天收集的浮游植物，葉綠素a，營養(yǎng)物質(zhì)濃度的樣品。營

15、養(yǎng)物質(zhì)的樣品在第1天添加營養(yǎng)物之前和之后取。溶解氧，pH和溫度在中型實(shí)驗(yàn)取樣時(shí)測定。葉綠素a的分析葉綠素a樣品在原地用玻璃纖維過濾片進(jìn)行真空過濾或取樣當(dāng)天帶回實(shí)驗(yàn)室操作。葉綠素a的分析是根據(jù)Gregor&Marsalek的方法，但省略了酸化的步驟。玻璃纖維過濾片用煮沸的90的乙醇萃取5分鐘。利用離心法除去多余的過濾片。立即用Varian Cary 50 Bio UV 紫外分光光度計(jì)測量上清液。浮游植物計(jì)數(shù)利用Sedgwick Rafter血球計(jì)數(shù)板通過顯微鏡放大200倍觀察浮游植物的數(shù)量。根據(jù)需要在計(jì)數(shù)前對樣品濃縮3.3,5或10倍。參考Prescott,Steble,Krauter和

16、Entwistle等人的鑒別文獻(xiàn)將藍(lán)藻和藻類鑒定到屬的水平。利用Burch和Olenina等人的最合適的轉(zhuǎn)換因子得出數(shù)量最大的藻類屬的生物量。營養(yǎng)物質(zhì)分析營養(yǎng)物質(zhì)的濃度利用QuikChem 8500 Lachat 營養(yǎng)分析儀進(jìn)行光度分析。利用抗壞血酸作為還原劑，再加入鉬酸鹽顯藍(lán)色來測量溶解性活性磷的含量。用硝酸鹽的含量來代替硝酸鹽和氮氧化物的含量（在確定氮氧化物的含量可以忽略后），在鎘柱還原后利用對氨基苯環(huán)酰胺法測量。數(shù)據(jù)分析從季節(jié)性微觀實(shí)驗(yàn)中得到的葉綠素a濃度利用SPSS Statistics 19.0對其進(jìn)行二因子方差分析，其顯著性水平。Wilks Lambda利用了Tukey的成對比較法

17、解釋了其統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)，同時(shí)其統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)完成了實(shí)驗(yàn)和位置之間的相互交流。利用二因子方差分析和Tukey成對比較法對每個(gè)實(shí)驗(yàn)浮游植物種屬和葉綠素a的數(shù)據(jù)進(jìn)行分析。利用Levene統(tǒng)計(jì)法對方差同質(zhì)性進(jìn)行檢測。當(dāng)然季節(jié)性微觀實(shí)驗(yàn)得到的葉綠素a的數(shù)據(jù)需要轉(zhuǎn)化為對數(shù)形式來滿足方差分析。第5天得到的中型實(shí)驗(yàn)和微觀實(shí)驗(yàn)的葉綠素a的數(shù)據(jù)用二因子方差分析。結(jié)論 微觀富營養(yǎng)化實(shí)驗(yàn) 圖表 3 圖所示為2013年1月和3月的中型試驗(yàn)中得到的葉綠素a的濃度，單位。N表示只加氮，P表示只加磷，NP表示既加氮也加磷，C表示對照實(shí)驗(yàn)。誤差線是平均值的標(biāo)準(zhǔn)誤差，n=3富營養(yǎng)化后葉綠素a的變化 在這七個(gè)試驗(yàn)中至少有一個(gè)處理后 瓶中葉綠素

18、濃度要高于初始值。圖二顯示大多數(shù)情況下，三個(gè)地點(diǎn)的實(shí)驗(yàn)結(jié)果 為氮和磷共同作用時(shí)浮游植物生長明顯高于其他處理方式。在富營養(yǎng)化處理和水樣位置之間有重要關(guān)系，根據(jù)Tukey的相對比較原理，氮磷處理和其他處理方式相比誘發(fā)了重要的反應(yīng)，剩下的一些處理沒有引起重要的生長變化，他們是2010年2月和3月的3個(gè)位置，2009年4月的2和3點(diǎn)，2010年10月的1和2點(diǎn)，2011年5月的1和2點(diǎn)，2009年8月的1點(diǎn)。 由于三個(gè)位置的情況相似，所以只將位置三的結(jié)果列出來。表格中出現(xiàn)的處理方式的名稱表示該處理方式使得該物種增長。星號表示和對照組相比其增長量要高出很多。上標(biāo)a表示兩者在統(tǒng)計(jì)學(xué)上沒有不同。上標(biāo)t表示在

19、處理方式和地點(diǎn)上沒有相互作用。沒有出現(xiàn)表示該處理方式和對照組相比沒有使物種增加。在2009年8月2和3點(diǎn)，磷和氮磷處理后的水樣葉綠素a的濃度明顯高于其他方式的處理樣品。2010年10月的位置3的樣品經(jīng)氮處理后同樣有較大的反應(yīng)，即使其反應(yīng)比氮磷處理后的要低。在時(shí)間，富營養(yǎng)化處理和位置之間有重要的相互作用。主要是由于不同地點(diǎn)，不同實(shí)驗(yàn)經(jīng)氮磷處理后有數(shù)量級的變化，這些反應(yīng)主要對2009年8月經(jīng)磷處理后的水樣。同樣，2011年8月和5月位置3的不太明顯的反應(yīng)類型也說明了上述的相互作用。通常，在氮磷處理后位置3有最高的葉綠素a的濃度，然后是位置1和位置2。在溫暖的季節(jié)，經(jīng)但磷處理后的實(shí)驗(yàn)會有數(shù)量級的變化

20、，特別是2010年2月和10月。對富營養(yǎng)化處理后增長緩慢的時(shí)期是在2009年和2011年的8月，也就是冬天進(jìn)行的實(shí)驗(yàn)。時(shí)間和地點(diǎn)，時(shí)間和相互作用項(xiàng)都同樣重要，根據(jù)Tukey的成對比較原理，營養(yǎng)處理可以分為以下幾種：氮磷處理，磷處理和氮處理，空白對照組。屬對富營養(yǎng)化實(shí)驗(yàn)的反應(yīng)在每個(gè)實(shí)驗(yàn)中大約有35個(gè)數(shù)量比較大的屬被計(jì)數(shù)，其中有23個(gè)對富營養(yǎng)化實(shí)驗(yàn)有明顯反應(yīng)。三個(gè)位置的反應(yīng)情況相似，但位置3的反應(yīng)更為明顯。位置3的結(jié)果在表2中已經(jīng)總結(jié)了。有218個(gè)案例顯示氮，磷或氮磷處理會引起生物總量的變化，這些案例中生物總量的增加明顯高于對照組增加的量。對氮磷處理后的水樣記錄的最頻繁，在63個(gè)案例中，其增長量明

21、顯高于對照組和其他處理方式處理后的水樣。在25個(gè)案例中氮磷處理和磷處后的水樣浮游植物的增長量明顯高于對照組和氮處理的水樣。與對照組和磷處理的相比氮和氮磷處理的水樣會有明顯的增長反應(yīng)。綠藻綱和硅藻綱主要對氮磷和磷處理有明顯反應(yīng)，但隱藻屬，魚鱗藻屬，囊裸藻屬，隱桿藻屬，隱球藻屬同樣對氮磷和磷處理有明顯反應(yīng)。因此只有藍(lán)藻細(xì)菌對營養(yǎng)物質(zhì)的添加有明顯反應(yīng)。前者在2009年4月，8月，2010年12月的試驗(yàn)中對氮磷和磷的處理有明顯反應(yīng)，后者在2009年12月的試驗(yàn)中對氮磷處理有明顯反應(yīng)。中型富營養(yǎng)化實(shí)驗(yàn)葉綠素a對富營養(yǎng)化實(shí)驗(yàn)的反應(yīng)和季節(jié)性微觀實(shí)驗(yàn)相似，在2013年兩個(gè)中型實(shí)驗(yàn)和同時(shí)進(jìn)行的微觀實(shí)驗(yàn)中反應(yīng)最大

22、的富營養(yǎng)化處理是氮磷的處理。在兩個(gè)中型實(shí)驗(yàn)中，氮磷處理后的生物總量持續(xù)增長了8天，第8天之后開始下降。 圖表 4 2013年1月和3月的中型實(shí)驗(yàn)和微觀實(shí)驗(yàn)中葉綠素a的濃度，單位。N表示氮處理，P表示磷處理，PN表示是氮磷處理，C是對照實(shí)驗(yàn)，對照試驗(yàn)數(shù)值第五天測量，i是初始濃度，它是第一天測量。誤差線是平均值的標(biāo)準(zhǔn)誤差，n=3.在2013年1月的試驗(yàn)中，第5天葉綠素a的濃度（14）幾乎是第1天濃度（5.2）的3倍，而第9天的濃度（48）超過第5 天濃度的3倍。在5月的試驗(yàn)中，第5天的濃度（33）超過第1天（9.4）的3倍，第9天的濃度（62）幾乎是第5天的兩倍。浮游植物對氮處理的反應(yīng)很小。在1月

23、的試驗(yàn)中，第18天葉綠素a濃度達(dá)到最大值（12）。然而在兩個(gè)實(shí)驗(yàn)中的磷處理也沒有明顯的反應(yīng)。在1月的對照組試驗(yàn)中生物總量未超過初始值的兩倍。在3月的實(shí)驗(yàn)中，對照組的生物總量從第1天開始就下降。兩個(gè)實(shí)驗(yàn)第1天對對照組和實(shí)驗(yàn)組葉綠素a濃度的測量在統(tǒng)計(jì)學(xué)上沒有差別。在1月的試驗(yàn)中，微觀實(shí)驗(yàn)和中型實(shí)驗(yàn)在第5天測量葉綠素a濃度時(shí)沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)上的差別。在3月的試驗(yàn)中，微觀實(shí)驗(yàn)濃度要高一些，但在反應(yīng)類型上沒有差別，也就是說，氮磷處理有更明顯的反應(yīng)。種屬對富營養(yǎng)化的反應(yīng)在兩個(gè)中型實(shí)驗(yàn)中，對單獨(dú)一個(gè)屬造成最明顯的反應(yīng)的處理方式是氮磷處理。這種處理方式引起了1月份25個(gè)數(shù)量最豐富的浮游植物屬中的13個(gè)屬的快速增長，

24、3月份20個(gè)屬的快速增長。1月的3個(gè)屬和3月的11個(gè)屬只有在氮磷處理下才有明顯反應(yīng)而對其他處理方式?jīng)]有明顯反應(yīng)。圖5列舉了4個(gè)屬的反應(yīng)形式，其他屬的反應(yīng)形式可以在補(bǔ)充材料上查閱。在1月的試驗(yàn)中，有10個(gè)屬即對氮磷處理有反應(yīng)也會對單獨(dú)的氮處理有反應(yīng)，而在3月這一情況變?yōu)?個(gè)屬。相同的，在1月的試驗(yàn)中，有2個(gè)屬即對氮磷處理產(chǎn)生反應(yīng)也對磷處理產(chǎn)生反應(yīng)，在三月則有3個(gè)屬。在圖6中展示了4個(gè)屬，其他的屬可以在補(bǔ)充材料中找到。圖表 5 在2013年1月和3月的中型實(shí)驗(yàn)中浮游植物（轉(zhuǎn)板藻屬，隱球藻屬，藍(lán)隱藻屬，四棘藻）對磷處理，氮處理，氮磷處理后生物量隨時(shí)間的變化，單位用mm3/L表示。P表示磷處理，N表示

25、氮處理，PN表示氮磷處理，C表示對照實(shí)驗(yàn)。誤差條表示平均值的標(biāo)準(zhǔn)誤差，n=3.圖表 6 在2013年1月（隱藻屬，小環(huán)藻）和3月（絲囊藻屬，項(xiàng)圈藻屬）的中型實(shí)驗(yàn)中浮游植物 對磷處理（底部）和氮磷處理或氮處理（頂部）和氮磷處理后生物量隨時(shí)間的變化，單位用mm3/L表示。P表示磷處理，N表示氮處理，PN表示氮磷處理，C表示對照實(shí)驗(yàn)。誤差條表示平均值的標(biāo)準(zhǔn)誤差，n=3. 在二因子方差分析中，大小因子有微觀和中型，處理方式因子有氮處理，磷處理，氮磷處理，和對照組。圖表 7在2013年1月的中型實(shí)驗(yàn)中浮游植物對氮處理后生物量隨時(shí)間的變化，單位用mm3/L表示。P表示磷處理，N表示氮處理，PN表示氮磷處理

26、，C表示對照實(shí)驗(yàn)。誤差條表示平均值的標(biāo)準(zhǔn)誤差，n=3.單一的加入氮也會引起某些屬的生長反應(yīng)，盡管與其他處理方式?jīng)]有太明顯的區(qū)別。在實(shí)驗(yàn)的不同階段，有些屬會對不同的處理方式產(chǎn)生反應(yīng)。在兩個(gè)實(shí)驗(yàn)的前8天藍(lán)藻門，絲囊藻屬和項(xiàng)圈藻屬對氮磷處理有反應(yīng)。在1月的實(shí)驗(yàn)中，磷的處理誘發(fā)絲囊藻屬生物總量增加24倍，使項(xiàng)圈藻的生物量在第13天到第19天中增長了28倍。項(xiàng)圈藻也會在五月的試驗(yàn)中對磷的處理做出反應(yīng)，但其對氮磷處理的反應(yīng)程度要高于單獨(dú)的磷處理。討論在富營養(yǎng)化實(shí)驗(yàn)中，氮磷的共同處理所引起的反應(yīng)更加頻繁而單獨(dú)的營養(yǎng)處理卻沒有引起太劇烈的反應(yīng)。這些現(xiàn)象在生物總量和單獨(dú)的種屬水平上都有反映。同時(shí)加入兩種營養(yǎng)物質(zhì)

27、比單獨(dú)加入一種物質(zhì)更能引起生長反應(yīng)，這種加入營養(yǎng)因子的反應(yīng)類型通常指的是兩種營養(yǎng)物質(zhì)的共限制作用。進(jìn)一步討論兩種類型的共限制作用：同時(shí)和單獨(dú)。對兩種物質(zhì)聯(lián)合作用有反應(yīng)但對其中的一種卻沒有反應(yīng)可以將其歸類為同時(shí)共限制作用。在單獨(dú)共限制作用中，加入兩種物質(zhì)中的某一種物質(zhì)都會引起相同的增長反應(yīng)。當(dāng)同時(shí)加入兩種物質(zhì)時(shí)，因?yàn)閮煞N物質(zhì)的單獨(dú)作用而使反應(yīng)程度得到增強(qiáng)。大部分微觀實(shí)驗(yàn)的結(jié)果都是屬于共同限制作用：在2010年2月和5月的三個(gè)位置，2009年4月的位置2和位置3，2010年10月位置1和位置2,2011年5月位置1和位置2,2009年8月位置1，這些時(shí)間點(diǎn)和位置的實(shí)驗(yàn)中群落都有生長反應(yīng)。這些試驗(yàn)中

28、大部分屬對營養(yǎng)物質(zhì)添加后的反應(yīng)都可以歸為同時(shí)共限制作用。無論是氮磷處理還是氮或磷的單獨(dú)處理都會引起重要的反應(yīng)，則可以稱之為“連續(xù)限制作用”。在2009年8月的位置2和位置3,2009年4月的位置一和2009年10的中型實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)了群落水平上的這種類型的反應(yīng)。在2009年8月許多屬的反應(yīng)可以代表群落的反應(yīng)，比如許多屬受到磷然后是氮的連續(xù)性限制。在2010年10月和2009年4月的實(shí)驗(yàn)中一些種屬的反應(yīng)可被分為連續(xù)性限制，但大部分屬還是被認(rèn)為是同時(shí)共限制作用。這就表明，特別是2009年8月，某種營養(yǎng)元素對浮游植物種群和個(gè)體的更為重要。相似的，1月進(jìn)行的中型實(shí)驗(yàn)可能要?dú)w類為連續(xù)限制作用，因?yàn)楹蛯φ战M相

29、比經(jīng)氮處理后葉綠素a的濃度有所增加。相反的，在3月的中型實(shí)驗(yàn)中的生物量的反應(yīng)可以認(rèn)為是同時(shí)共限制作用。在兩個(gè)實(shí)驗(yàn)中的大多數(shù)屬都體現(xiàn)了群落反應(yīng)。在利用葉綠素a或其他綜合手段檢測生長反應(yīng)的短期學(xué)術(shù)研究中，浮游植物生長的共限制作用經(jīng)常被提到。在季節(jié)性富營養(yǎng)化實(shí)驗(yàn)和兩個(gè)中型實(shí)驗(yàn)這兩種不同的富營養(yǎng)化試驗(yàn)中，我們不僅發(fā)現(xiàn)浮游植物生長在群落水平上氮和磷的共限制作用，在種屬水平上也是如此。根據(jù)李希比最小因子定律，在特定的時(shí)間只會有一種限制性營養(yǎng)元素，兩種元素的共限制作用是不存在的。Danger等人提出李比希最小因子定律適用于個(gè)體的作物而不適用于自然界多種多樣的群落，這些群落可以使自己適應(yīng)可以獲得的稀有資源。最

30、終，這將使共限制作用適用于群落水平。當(dāng)不考慮個(gè)體的反應(yīng)，只用綜合的方式檢測共限制作用時(shí)，很明顯就像一些研究顯示的一樣，共限制作用是被不同的單個(gè)營養(yǎng)元素限制后許多個(gè)體所產(chǎn)生的綜合效果。這表明整個(gè)群落會被氮元素和磷元素共同限制，而單個(gè)個(gè)體或種屬可能會被其中任何一種元素限制。盡管浮游植物群落中的共限制作用很常見，但很難見到某一種屬生長的共限制作用。Hyenstrand等人表示藍(lán)藻，膠刺藻屬，刺胞小克受到微量金屬元素和大量元素（氮和磷）的共限制作用。許多微量金屬元素對藻類的共限制作用的機(jī)制已經(jīng)被提出，比如：兩種微量金屬元素在具有相同生物功能的生化替代作用，或是缺少某一元素而限制了其他元素的獲取的生化依

31、賴共限制作用。但是這些機(jī)制不能解釋在種屬水平上生化作用上相互排斥的營養(yǎng)元素如氮和磷。在我們的試驗(yàn)中，兩種不同的富營養(yǎng)化實(shí)驗(yàn)都出現(xiàn)不同種的許多屬的同時(shí)共限制作用。Harpole等人發(fā)現(xiàn)但環(huán)中營養(yǎng)物質(zhì)很低時(shí)，同時(shí)和單獨(dú)的共限制作用會經(jīng)常出現(xiàn)。這點(diǎn)同樣適用于格雷厄姆斯頓大壩的情況，因?yàn)榇颂幩腥芙庑曰钚粤缀偷趸锏臐舛韧ǔ：艿停ǖ?-50,磷5-30）。單獨(dú)添加某種營養(yǎng)物質(zhì)引起的反應(yīng)太小而難以用數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)，所以同時(shí)共限制作用可能會以連續(xù)限制作用表現(xiàn)出來。同時(shí)共限制作用和李希比最小因子定律并不矛盾，前提是很小的增長反應(yīng)而低的統(tǒng)計(jì)能力是這一反應(yīng)的原因并且連續(xù)限制作用是限制作用的一種類型。連續(xù)限制作用可被

32、解釋為一種營養(yǎng)元素的限制作用，也就是，當(dāng)加入一種元素時(shí)，這種元素會引起一些反應(yīng)，在我們的試驗(yàn)中就是指氮和磷。這將會減輕該元素的限制作用但卻會引起第二種元素的限制作用。當(dāng)?shù)诙N元素加入后，比如氮磷處理，進(jìn)一步的生長將會出現(xiàn)。在我們的實(shí)驗(yàn)中不同的容器尺寸，包含或不包含浮游動物，中型實(shí)驗(yàn)或微觀實(shí)驗(yàn)這些可能也獨(dú)自的影響浮游植物對營養(yǎng)物質(zhì)添加的反應(yīng)。但是容器尺寸只有在2013年3月的試驗(yàn)中產(chǎn)生了影響。在所有實(shí)驗(yàn)的第5天的水樣中，微觀實(shí)驗(yàn)中葉綠素a的濃度都要高于中型實(shí)驗(yàn)。不同的光照水平可能都會影響中型和微觀實(shí)驗(yàn)中藻類生物總量。在實(shí)驗(yàn)過程中，微觀實(shí)驗(yàn)的瓶子都懸浮在相同的高度（水表面輻射的25%），而中型實(shí)驗(yàn)

33、則覆蓋了水柱前1.5米（包括了微觀實(shí)驗(yàn)中瓶子所在地的深度）。微觀實(shí)驗(yàn)中顯然要排除浮游動物對藻類生長的影響。同樣，在中型實(shí)驗(yàn)中的浮游動物可能會對藻類的某些種屬的生長造成影響。不能將浮游動物的密度定量化使我們很難梳理浮游動物和容器的體積所造成的明確影響。通常，中型實(shí)驗(yàn)提供了一個(gè)比微觀實(shí)驗(yàn)更自然的環(huán)境。但浮游植物對營養(yǎng)限制的反應(yīng)類型在兩種試驗(yàn)中的前4天是相同的，這就證明了季節(jié)性觀實(shí)驗(yàn)結(jié)果的合理性。所以，微觀實(shí)驗(yàn)的結(jié)果是格雷厄姆斯頓大壩藻類生物總量限制性因素的很好指示器。因?yàn)槿藗儗α讓Ω∮沃参锷L的限制作用的普遍認(rèn)可和大壩內(nèi)特殊的種屬使得近年來人們對大壩中的共限制作用的忽視。盡管這表示磷在水體中重要性大于氮，但其造成的生長反應(yīng)也非常低，暗示了營養(yǎng)元素和光照或溫度的共同限制作用。營養(yǎng)的限制作用在其他研究中也出現(xiàn)，和當(dāng)前的結(jié)果相比，它們通常出現(xiàn)在藻類生長的季節(jié)。這就可能由于采樣頻率過低而導(dǎo)致無法了解限制性營養(yǎng)