1、 丁喬棋 2015年8月9號 單克隆抗體的制備 Monocolonal antibody 什么是單克隆抗體？n 1、單克隆抗體（monoclonal antibodies, mAb）： 由單個B淋巴細胞經過無性繁殖（克隆），形成基因型相同的細胞群，這一細胞群所產生的化學性質單一、特異性強的抗體 稱為單克隆抗體。 n 與多抗相比，單抗純度高，專一性強、重復性好、且能持續地無限量供應。單克隆抗體制備原理 -單克隆抗體雜交瘤技術基本流程 單克隆抗體的制備步驟 一：免疫原的制備 ：n 1：完全抗原：病毒、細菌、真菌等微生物和蛋白質等分子量大于5000Da生物物質n 2：半抗原：多糖、藥物、激素、肽類等

2、分子量小于5000 Da 物質n 3：半抗原需與BSA、OVA等載體交聯后成完全抗原才能刺激動物產生可應用的高效價的抗體 單克隆抗體的制備步驟 n 免疫動物的選取：6-8周齡的雌性，純系的Bal B/C。n 免疫原：細胞性抗原：（12）107/只，不加佐劑，23周重復一次 可溶性抗原：首次，完全福氏佐劑+100微克抗原，36周 100200微克抗原，融合前3天，加強免疫。n 免疫程序： 免疫劑量、免疫途徑、免疫次數、 間隔時間、佐劑的選擇。二.動物免疫單克隆抗體的制備步驟 抗原接種 單克隆抗體的制備步驟 三：細胞融合細胞融合的基本原理是免疫原刺激小鼠產生特異性的B淋巴細胞和骨髓瘤細胞,在PEG

3、融合劑或是電刺激或是激光刺激來促使細胞融合形成雜交瘤細胞。蹄選得到的雜交瘤細胞繼承了 B淋巴細胞產生特異性抗體以及骨髓瘤細胞無限傳代的特性,并以此進行大規模的細胞培養,生產出大量的特異性良好的單克隆抗體,為快速診斷試劑的研制奠定了堅實的基礎。 所需試劑：培養液：RPM1640培養液，DMEM培養液，HAT培養液，HT培養液n 細胞融合劑：PEG:分子量4000 的PEG是最常用的細胞融合劑 作用機理：誘導細胞膜上脂類物質結構重排，使細胞膜易打開而 有助于細胞融合 作用特點：隨機發生的，不同廠商、批號、分子量的PEG，其純度 與毒性有所不同 單克隆抗體的制備步驟 三.細胞融合 步驟 1：選擇對數

4、生長期的細胞進行傳代培養。 2：胞形態：渾圓、透亮、均一、排列整齊 3：避免細胞返祖：定期用8-AG處理細胞培養骨髓瘤細胞 2：固定小鼠，切開皮膚，夾起腹膜。 3：往小鼠腹腔注射適量不完全培養液:，吹打幾次。 4：抽出腹腔培養液，加入一定量的不完全培養液，加入血清，使血清濃度為20%。 5：分裝至96孔板，co2培養箱培養。飼養細胞的制備 1：取已免疫小鼠，眼球采血，分離血清作對照血清。 2：拉頸處死，泡于75%酒精中。 3：開腹取脾 4：在不完全DM液中碾磨脾臟至粘稠 5：收集脾細胞，離心。脾細胞的制備 1：飼養細胞為小鼠的腹腔巨噬細胞。 單克隆抗體的制備步驟 n 1： 將脾細胞和骨髓瘤細胞

5、5:1混合，加DM液，混勻n 2： 離心，棄上清，磨成糊狀n 3：將離心管置于37溫水，搖動；邊滴加PEG1450n 4：加入DM液n 5：離心，棄上清n 6：HAT 重懸后加入96孔板，放入CO2培養箱n 7：五天后，15%血清的HAT補液n 8：八天后，徹底換15%血清DM液三.細胞融合n ELISA方法篩選陽性孔單克隆抗體的制備步驟四.雜交瘤細胞及陽性孔的篩選陽性孔陽性孔 四.雜交瘤細胞及陽性孔的篩選間接ELISA方法篩選陽性孔n 單克隆抗體的制備步驟n 六：亞克隆n 是為了獲得穩定的陽性菌株n 對檢測有陽性且敏感性好的細胞要盡早進行克隆化,否則抗體分泌的細胞會被抗體非分泌的細胞所抑制,

6、因為抗體非分泌細胞的生長速度比抗體分泌的細胞生長速度快,二者競爭的會使產單抗的細胞丟失單克隆抗體的制備步驟n 篩選陽性細胞孔n HAT重懸陽性孔內的細胞n 取10ul做倍比稀釋n 目標孔：80-100個細胞n 將目標孔細胞全部移至適量的HAT溶液中，鋪板n 每次亞克隆十天后，用ELISA法做抗體檢測，確定陽性孔n 按上述方法進行第二，第三次亞克隆n 第三次亞克隆結束后，將確定為陽性孔的細胞進行擴大培養六：亞克隆單克隆抗體的制備步驟n 1：在建立雜交瘤細胞的過程中，有時一次融合產生很多“陽性”孔，來不及對所有的雜交瘤細胞作進一步的工作，需要把其中一部分細 胞凍存起來；另一方面，為了防止實驗室可能

7、發生的意外事故。n 2:配制方案：DMEM:血清：DMSO=7：2：1 “慢凍”：分步冷凍，30-70液氮 保存數年至數十年. “快融”：取出立即浸入3740水浴中，使其迅速融化、復 蘇.七：雜交瘤細胞的凍存與復蘇細胞冷凍的意義防止污染 、 避免染色體丟失、防止非分泌細胞的過度生長、防止細胞密度過高而死亡單克隆抗體的制備步驟八：動物體內誘生法：使用的動物當然首選BALB/c小鼠 ,將雜交瘤細胞接種于小鼠腹腔內，在小鼠腹腔內生長雜交瘤，并產生腹水，因而可得到大量的腹水單抗且抗體濃度很高。體外培養法： a、懸浮培養法b、微載體培養法Microcarrier c、中空纖維細胞培養系統 d、微囊化細胞

8、培養系統 收集細胞培養瓶中的雜交瘤細胞以備注入小鼠腹腔誘生腹水時,一定要用無血清培養液多離心幾次,將細胞培養液含有的牛血清洗凈,防止牛血清進入了小鼠腹腔使小鼠死亡。小鼠的選擇上一定要選擇活力好、腹腔大的小鼠。當小鼠腹腔開始發脹后,每天密切關注小鼠狀態,取出腹水,立即離心,去除上層的腹腔脂肪,下層有時會出現細胞,除去。離心后馬上進行純化。單克隆抗體的制備步驟n 飽和硫酸銨一DEAE離子交換柱法n 離子交換是指液相中的離子與固定相上可解離基團的可逆交換反應。利用這個反應先將要分離的混合物在一定pH的溶液中解離,而后流經固定相,使之與固定相上的可解離基團進行離子交換,吸附于固定相上,凡不能進行交換吸

9、附的成分,則流出層析柱外。當pH一7.4時,IgG所帶電荷為零,最先流出柱子。過柱前先用飽和硫酸銨法初步提純。蛋白質在不同濃度的鹽溶液中相對溶解度不同,血清丫球蛋白在一定濃度鹽溶液中易于沉淀,而白蛋白則不易沉淀,據此可將二者分離n 辛酸一飽和硫酸銨法n _在酸性條件不(pH4.5),非lgG的蛋白成份(包括白蛋白,部分免疫球蛋白),能被辛酸等短鏈脂肪酸沉淀,上清中剩余的蛋白主要為IgG,再用硫酸錢沉淀上清,即可獲得純度較高的IgG。九：單克隆抗體的純化單克隆抗體的鑒定n單克隆抗體純度的鑒定:用SDS一PAGE電泳鑒定純度n單克隆抗體敏感性(IC50)值的測定:間接競爭ELISA實驗中,一般是通

10、過IC50值來判斷抗體對CAP的敏感性,故用7個不同偶聯比的HAP一OVA進行ELISA實驗,測定不同偶聯比的包被抗原對應的IC50值。n單克隆抗體特異性的測定(交叉反應)n做間接競爭ELIsA,計算各自的ICS。值,計算交叉反應率。如果含有與待測物相似結構或部分相同結構的物質存在交叉反應,將測定結果升高,導致假陽性,一般以交叉反應率表示,交叉反應率越小,說明抗體特異性越好。7.單克隆抗體的亞類鑒定和腹水效價測定 n 將單抗腹水與Sigma公司的標準抗BALB/C 小鼠IgA, IgG1,IgG2a, IgG2b、IgG3,IgM抗體，作雙向瓊脂擴散試驗。n ELISA方法n 用常規間接ELISA方法檢測單抗腹水效價，腹水效價在105107之間的可用于實際應用。 文獻學習n氯霉素單克隆抗體的制備以及膠體金快速診斷方法的初步建立n n 膠體金免疫檢測的基本原理n 膠體金(colloidal gold)是在還原劑如氯金酸、梓檬酸三鈉、白磷、抗壞血酸、枸櫞酸鈉、鞋酸等作用下29,首先聚合成為具有一定大小的金核顆粒,在顆粒外側形成內正外負的兩層帶負電荷的疏水膠體溶液,再借助靜電作用和蛋白結構中的正電荷結合形成一種