1、口蹄疫防治技術規范二、口蹄疫防治技術規范口蹄疫（Foot and Mouth Disease, FMD）是由口蹄疫病毒引起的以偶蹄動物為主的急性、熱性、高度傳染性疫病，世界動物衛生組織（OIE）將其列為必須報告的動物傳染病，我國規定為一類動物疫病。為預防、控制和撲滅口蹄疫，依據中華人民共和國動物防疫法、重大動物疫情應急條例、國家突發重大動物疫情應急預案等法律法規，制定本技術規范。1 適用范圍本規范規定了口蹄疫疫情確認、疫情處置、疫情監測、免疫、檢疫監督的操作程序、技術標準及保障措施。本規范適用于中華人民共和國境內一切與口蹄疫防治活動有關的單位和個人。2 診斷2.1 診斷指標2.1.1 流行病學

2、特點2.1.1.1 偶蹄動物，包括牛科動物（牛、瘤牛、水牛、牦牛）、綿羊、山羊、豬及所有野生反芻和豬科動物均易感，駝科動物（駱駝、單峰駱駝、美洲駝、美洲駱馬）易感性較低。2.1.1.2 傳染源主要為潛伏期感染及臨床發病動物。感染動物呼出物、唾液、糞便、尿液、乳、精液及肉和副產品均可帶毒。康復期動物可帶毒。2.1.1.3 易感動物可通過呼吸道、消化道、生殖道和傷口感染病毒，通常以直接或間接接觸（飛沫等）方式傳播，或通過人或犬、蠅、蜱、鳥等動物媒介，或經車輛、器具等被污染物傳播。如果環境氣候適宜，病毒可隨風遠距離傳播。2.1.2 臨床癥狀2.1.2.1 牛呆立流涎，豬臥地不起，羊跛行；2.1.2.

3、2 唇部、舌面、齒齦、鼻鏡、蹄踵、蹄叉、乳房等部位出現水泡；2.1.2.3 發病后期，水泡破潰、結痂，嚴重者蹄殼脫落，恢復期可見瘢痕、新生蹄甲；2.1.2.4 傳播速度快，發病率高；成年動物死亡率低，幼畜常突然死亡且死亡率高，仔豬常成窩死亡。2.1.3 病理變化2.1.3.1消化道可見水泡、潰瘍；2.1.3.2幼畜可見骨骼肌、心肌表面出現灰白色條紋，形色酷似虎斑。2.1.4 病原學檢測2.1.4.1 間接夾心酶聯免疫吸附試驗，檢測陽性（ELISA OIE 標準方法 附件一）；2.1.4.2 RT-PCR試驗，檢測陽性（采用國家確認的方法）；2.1.4.3 反向間接血凝試驗（RIHA），檢測陽性

4、（附件二）；2.1.4.4 病毒分離，鑒定陽性。2.1.5 血清學檢測2.1.5.1中和試驗，抗體陽性；2.1.5.2液相阻斷酶聯免疫吸附試驗，抗體陽性；2.1.5.3非結構蛋白ELISA檢測感染抗體陽性；2.1.5.4 正向間接血凝試驗（IHA），抗體陽性（附件三）。2.2 結果判定2.2.1 疑似口蹄疫病例符合該病的流行病學特點和臨床診斷或病理診斷指標之一，即可定為疑似口蹄疫病例。2.2.2 確診口蹄疫病例疑似口蹄疫病例，病原學檢測方法任何一項陽性，可判定為確診口蹄疫病例；疑似口蹄疫病例，在不能獲得病原學檢測樣本的情況下，未免疫家畜血清抗體檢測陽性或免疫家畜非結構蛋白抗體ELISA檢測陽性

5、，可判定為確診口蹄疫病例。2.3疫情報告任何單位和個人發現家畜上述臨床異常情況的，應及時向當地動物防疫監督機構報告。動物防疫監督機構應立即按照有關規定赴現場進行核實。2.3.1 疑似疫情的報告縣級動物防疫監督機構接到報告后，立即派出2名以上具有相關資格的防疫人員到現場進行臨床和病理診斷。確認為疑似口蹄疫疫情的，應在2小時內報告同級獸醫行政管理部門，并逐級上報至省級動物防疫監督機構。省級動物防疫監督機構在接到報告后，1小時內向省級獸醫行政管理部門和國家動物防疫監督機構報告。診斷為疑似口蹄疫病例時，采集病料（附件四），并將病料送省級動物防疫監督機構，必要時送國家口蹄疫參考實驗室。2.3.2 確診疫

6、情的報告省級動物防疫監督機構確診為口蹄疫疫情時，應立即報告省級獸醫行政管理部門和國家動物防疫監督機構；省級獸醫管理部門在1小時內報省級人民政府和國務院獸醫行政管理部門。國家參考實驗室確診為口蹄疫疫情時，應立即通知疫情發生地省級動物防疫監督機構和獸醫行政管理部門，同時報國家動物防疫監督機構和國務院獸醫行政管理部門。省級動物防疫監督機構診斷新血清型口蹄疫疫情時，將樣本送至國家口蹄疫參考實驗室。2.4 疫情確認國務院獸醫行政管理部門根據省級動物防疫監督機構或國家口蹄疫參考實驗室確診結果，確認口蹄疫疫情。3 疫情處置3.1疫點、疫區、受威脅區的劃分3.1.1疫點 為發病畜所在的地點。相對獨立的規模化養

7、殖場/戶，以病畜所在的養殖場/戶為疫點；散養畜以病畜所在的自然村為疫點；放牧畜以病畜所在的牧場及其活動場地為疫點；病畜在運輸過程中發生疫情，以運載病畜的車、船、飛機等為疫點；在市場發生疫情，以病畜所在市場為疫點；在屠宰加工過程中發生疫情，以屠宰加工廠（場）為疫點。3.1.2 疫區 由疫點邊緣向外延伸3公里內的區域。3.1.3 受威脅區 由疫區邊緣向外延伸10公里的區域。在疫區、受威脅區劃分時，應考慮所在地的飼養環境和天然屏障（河流、山脈等）。3.2 疑似疫情的處置對疫點實施隔離、監控，禁止家畜、畜產品及有關物品移動，并對其內、外環境實施嚴格的消毒措施。必要時采取封鎖、撲殺等措施。3.3 確診疫

8、情處置疫情確診后，立即啟動相應級別的應急預案。3.3.1 封鎖疫情發生所在地縣級以上獸醫行政管理部門報請同級人民政府對疫區實行封鎖，人民政府在接到報告后，應在24小時內發布封鎖令。跨行政區域發生疫情的，由共同上級獸醫行政管理部門報請同級人民政府對疫區發布封鎖令。3.3.2 對疫點采取的措施3.3.2.1 撲殺疫點內所有病畜及同群易感畜，并對病死畜、被撲殺畜及其產品進行無害化處理（附件五）；3.3.2.2對排泄物、被污染飼料、墊料、污水等進行無害化處理（附件六）；3.3.2.3對被污染或可疑污染的物品、交通工具、用具、畜舍、場地進行嚴格徹底消毒（附件七）；3.3.2.4 對發病前14天售出的家畜

9、及其產品進行追蹤，并做撲殺和無害化處理。3.3.3 對疫區采取的措施3.3.3.1在疫區周圍設置警示標志，在出入疫區的交通路口設置動物檢疫消毒站，執行監督檢查任務，對出入的車輛和有關物品進行消毒；3.3.3.2 所有易感畜進行緊急強制免疫，建立完整的免疫檔案；3.3.3.3 關閉家畜產品交易市場，禁止活畜進出疫區及產品運出疫區；3.3.3.4對交通工具、畜舍及用具、場地進行徹底消毒；3.3.3.5對易感家畜進行疫情監測，及時掌握疫情動態;3.3.3.6 必要時，可對疫區內所有易感動物進行撲殺和無害化處理。3.3.4對受威脅區采取的措施3.3.4.1 最后一次免疫超過一個月的所有易感畜，進行一次

10、緊急強化免疫；3.3.4.2 加強疫情監測，掌握疫情動態。3.3.5 疫源分析與追蹤調查按照口蹄疫流行病學調查規范，對疫情進行追蹤溯源、擴散風險分析（附件八）。3.3.6解除封鎖3.3.6.1封鎖解除的條件口蹄疫疫情解除的條件：疫點內最后1頭病畜死亡或撲殺后連續觀察至少14天，沒有新發病例；疫區、受威脅區緊急免疫接種完成；疫點經終末消毒；疫情監測陰性。新血清型口蹄疫疫情解除的條件：疫點內最后1頭病畜死亡或撲殺后連續觀察至少14天沒有新發病例；疫區、受威脅區緊急免疫接種完成；疫點經終末消毒；對疫區和受威脅區的易感動物進行疫情監測，結果為陰性。3.3.6.2解除封鎖的程序：動物防疫監督機構按照上述

11、條件審驗合格后，由獸醫行政管理部門向原發布封鎖令的人民政府申請解除封鎖，由該人民政府發布解除封鎖令。必要時由上級動物防疫監督機構組織驗收。4 疫情監測4.1 監測主體：縣級以上動物防疫監督機構。4.2 監測方法：臨床觀察、實驗室檢測及流行病學調查。4.3 監測對象：以牛、羊、豬為主，必要時對其他動物監測。4.4 監測的范圍4.4.1 養殖場戶、散養畜，交易市場、屠宰廠（場）、異地調入的活畜及產品。4.4.2對種畜場、邊境、隔離場、近期發生疫情及疫情頻發等高風險區域的家畜進行重點監測。監測方案按照當年獸醫行政管理部門工作安排執行。4.5疫區和受威脅區解除封鎖后的監測 臨床監測持續一年，反芻動物病

12、原學檢測連續2次，每次間隔1個月，必要時對重點區域加大監測的強度。4.6在監測過程中，對分離到的毒株進行生物學和分子生物學特性分析與評價，密切注意病毒的變異動態，及時向國務院獸醫行政管理部門報告。4.7 各級動物防疫監督機構對監測結果及相關信息進行風險分析，做好預警預報。4.8監測結果處理監測結果逐級匯總上報至國家動物防疫監督機構，按照有關規定進行處理。5 免疫5.1 國家對口蹄疫實行強制免疫，各級政府負責組織實施，當地動物防疫監督機構進行監督指導。免疫密度必須達到100%。5.2 預防免疫，按農業部制定的免疫方案規定的程序進行。5.3 突發疫情時的緊急免疫按本規范有關條款進行。5.4 所用疫

13、苗必須采用農業部批準使用的產品，并由動物防疫監督機構統一組織、逐級供應。5.5 所有養殖場/戶必須按科學合理的免疫程序做好免疫接種，建立完整免疫檔案（包括免疫登記表、免疫證、免疫標識等）。5.6 各級動物防疫監督機構定期對免疫畜群進行免疫水平監測，根據群體抗體水平及時加強免疫。6 檢疫監督6.1 產地檢疫豬、牛、羊等偶蹄動物在離開飼養地之前，養殖場/戶必須向當地動物防疫監督機構報檢，接到報檢后，動物防疫監督機構必須及時到場、到戶實施檢疫。檢查合格后，收回動物免疫證，出具檢疫合格證明；對運載工具進行消毒，出具消毒證明，對檢疫不合格的按照有關規定處理。6.2 屠宰檢疫動物防疫監督機構的檢疫人員對豬

14、、牛、羊等偶蹄動物進行驗證查物，證物相符檢疫合格后方可入廠（場）屠宰。宰后檢疫合格，出具檢疫合格證明。對檢疫不合格的按照有關規定處理。6.3 種畜、非屠宰畜異地調運檢疫國內跨省調運包括種畜、乳用畜、非屠宰畜時，應當先到調入地省級動物防疫監督機構辦理檢疫審批手續，經調出地按規定檢疫合格，方可調運。起運前兩周，進行一次口蹄疫強化免疫，到達后須隔離飼養14天以上，由動物防疫監督機構檢疫檢驗合格后方可進場飼養。6.4 監督管理6.4.1動物防疫監督機構應加強流通環節的監督檢查，嚴防疫情擴散。豬、牛、羊等偶蹄動物及產品憑檢疫合格證（章）和動物標識運輸、銷售。6.4.2生產、經營動物及動物產品的場所，必須

15、符合動物防疫條件，取得動物防疫合格證，當地動物防疫監督機構應加強日常監督檢查。6.4.3 各地根據防控家畜口蹄疫的需要建立動物防疫監督檢查站，對家畜及產品進行監督檢查，對運輸工具進行消毒。發現疫情，按照動物防疫監督檢查站口蹄疫疫情認定和處置辦法相關規定處置。6.4.4 由新血清型引發疫情時，加大監管力度，嚴禁疫區所在縣及疫區周圍50公里范圍內的家畜及產品流動。在與新發疫情省份接壤的路口設置動物防疫監督檢查站、卡實行24小時值班檢查；對來自疫區運輸工具進行徹底消毒，對非法運輸的家畜及產品進行無害化處理。6.4.5任何單位和個人不得隨意處置及轉運、屠宰、加工、經營、食用口蹄疫病（死）畜及產品；未經

16、動物防疫監督機構允許，不得隨意采樣；不得在未經國家確認的實驗室剖檢分離、鑒定、保存病毒。7 保障措施7.1各級政府應加強機構、隊伍建設，確保各項防治技術落實到位。7.2各級財政和發改部門應加強基礎設施建設，確保免疫、監測、診斷、撲殺、無害化處理、消毒等防治技術工作經費落實。7.3各級獸醫行政部門動物防疫監督機構應按本技術規范，加強應急物資儲備，及時培訓和演練應急隊伍。7.4發生口蹄疫疫情時，在封鎖、采樣、診斷、流行病學調查、無害化處理等過程中，要采取有效措施做好個人防護和消毒工作，防止人為擴散。附件一：間接夾心酶聯免疫吸附試驗（I-ELISA）1 試驗程序和原理1.1利用包被于固相（I，96孔

17、平底ELISA專用微量板）的FMDV型特異性抗體（AB，包被抗體，又稱為捕獲抗體），捕獲待檢樣品中相應型的FMDV抗原（Ag）。再加入與捕獲抗體同一血清型，但用另一種動物制備的抗血清（Ab，檢測抗體）。如果有相應型的病毒抗原存在，則形成“夾心”式結合，并被隨后加入的酶結合物/顯色系統（*E/S）檢出。1.2由于FMDV的多型性，和可能并發臨床上難以區分的水泡性疾病，在檢測病料時必然包括幾個血清型（如O、A、亞洲-1型）；及臨床癥狀相同的某些疾病，如豬水泡病（SVD）。2 材料2.1 樣品的采集和處理 見附件四2.2 主要試劑2.2.1 抗體2.2.1.1包被抗體：兔抗FMDV-“O”、“A”、

18、“亞洲-I”型146S血清；及兔抗SVDV-160S血清。2.2.1.2檢測抗體：豚鼠抗FMDV-“O”、“A”、“亞洲-I”型146S血清；及豚鼠抗SVDV-160S血清。2.2.2 酶結合物 兔抗豚鼠Ig抗體(Ig)-辣根過氧化物酶(HRP)結合物。2.2.3 對照抗原 滅活的FMDV-“O”“A”“亞洲-I”各型及SVDV細胞病毒液。2.2.4 底物溶液（底物/顯色劑） 3過氧化氫/3.3mmol/L鄰苯二胺(OPD)。2.2.5 終止液 1.25mol/L 硫酸。2.2.6 緩沖液2.2.6.1包被緩沖液 0.05mol/L Na2CO3-NaHCO3，pH9.6。2.2.6.2稀釋液

19、A 0.01mol/L PBS - 0.05(v/v)Tween-20，pH7.27.4。2.2.6.3稀釋液B 5脫脂奶粉（w/v）- 稀釋液A 。2.2.6.4洗滌緩沖液 0.002mol/L PBS - 0.01(v/v)Tween-20。2.3 主要器材設備2.3.1 固相 96孔平底聚苯乙烯ELISA專用板。2.3.2 移液器、尖頭及貯液槽 微量可調移液器一套，可調范圍0.55000L(56支)；多（4、8、12）孔道微量可調移液器（25250L）；微量可調連續加樣移液器（10100L）；與各移液器匹配的各種尖頭，及配套使用的貯液槽。2.3.3 振蕩器 與96孔微量板配套的旋轉振蕩器

20、。2.3.4 酶標儀,492nm波長濾光片。2.3.5 洗板機或洗滌瓶,吸水紙巾。2.3.6 37恒溫溫室或溫箱。3 操作方法3.1 預備試驗 為了確保檢測結果準確可靠，必須最優化組合該ELISA，即試驗所涉及的各種試劑，包括包被抗體、檢測抗體、酶結合物、陽性對照抗原都要預先測定，計算出它們的最適稀釋度，既保證試驗結果在設定的最佳數據范圍內，又不浪費試劑。使用診斷試劑盒時，可按說明書指定用量和用法。如試驗結果不理想，重新滴定各種試劑后再檢測。3.2 包被固相3.2.1 FMDV各血清型及SVDV兔抗血清分別以包被緩沖液稀釋至工作濃度，然后按圖3-1<>所示布局加入微量板各行。每孔5

21、0L。加蓋后37振蕩2h。或室溫（2025）振蕩30min，然后置濕盒中4過夜（可以保存1周左右）。3.2.2 一般情況下,牛病料鑒定“O”和“A”兩個型，某些地區的病料要加上“亞洲-I”型；豬病料要加上SVDV。 圖3-1：定型ELISA微量板包被血清布局<> 、對照和被檢樣品布局<><> <>1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12A FMDV“O”C+ C+C+ C+C- C-S1 1S3 3S5 5B “A”C+ C+C+ C+C- C-S1 1S3 3S5 5C “Asia-I”C+ C+C+ C+C- C-S1 1S3 3

22、S5 5D SVDVC+ C+C+ C+C- C-S1 1S3 3S5 5E FMDV“O”C+ C+C+ C+C- C-S2 2S4 4S6 6F “A”C+ C+C+ C+C- C-S2 2S4 4S6 6G “Asia-I”C+ C+C+ C+C- C-S2 2S4 4S6 6H SVDVC+ C+C+ C+C- C-S2 2S4 4S6 6試驗開始，依據當天檢測樣品的數量包被，或取出包被好的板子；如用可拆卸微量板，則根據需要取出幾條。在試驗臺上放置20min，再洗滌5次，扣干。3.3 加對照抗原和待檢樣品3.3.1 布局空白和各陽性對照、待檢樣品在 ELISA 板上的分布位置如圖3-1

23、<>所示。3.3.2 加樣3.3.2.1第5和第6列為空白對照（C-），每孔加50L稀釋液A。3.3.2.2先將各型陽性對照抗原分別以稀釋液A適當稀釋，然后加入與包被抗體同型的各行孔中，C+為強陽性，C+為陽性，可以用同一對照抗原的不同稀釋度。每一對照2孔，每孔50L。3.3.2.3按待檢樣品的序號（S1、S2 .）逐個加入，每份樣品每個血清型加2孔，每孔50L。 37 振蕩1h，洗滌5次，扣干。3.4 加檢測抗體 各血清型豚鼠抗血清以稀釋液A稀釋至工作濃度，然后加入與包被抗體同型各行孔中，每孔50L。37振蕩1h。洗滌5次，扣干。3.5 加酶結合物 酶結合物以稀釋液B稀釋至工作濃

24、度，每孔50L。 37振蕩40min。洗滌5次，扣干。3.6 加底物溶液試驗開始時，按當天需要量從冰箱暗盒中取出OPD，放在溫箱中融化并使之升溫至37。臨加樣前，按每6mL OPD加3雙氧水30L（一塊微量板用量），混勻后每孔加50L。37振蕩15min。3.7 加終止液 顯色反應15分鐘，準時加終止液1.25mol/L H2SO4。50L/孔。3.8 觀察和判讀結果終止反應后,先用肉眼觀察全部反應孔。如空白對照和陽性對照孔的顯色基本正常,再用酶標儀(492nm)判讀OD值。4 結果判定4.1 數據計算 為了便于說明，假設表3-1所列數據為檢測結果（OD值）。 利用表3-1所列數據,計算平均O

25、D值和平均修正OD值（表3-2）4.1.1各行2孔空白對照（C-）平均OD值；4.1.2各行（各血清型）抗原對照（C+、C+）平均OD值；4.1.3各待檢樣品各血清型（2孔）平均OD值；4.1.4計算出各平均修正OD值（每個(2)或(3)值同一行的(1)值。表3-1. 定型ELISA結果(OD值)C+ C+ C- S1 S2 S3A FMDV“O”1.84 1.740.56 0.460.06 0.041.62 1.540.68 0.720.10 0.08B “A”1.25 1.450.40 0.420.07 0.050.09 0.071.22 1.320.09 0.09C“Asia-I”1.3

26、2 1.120.52 0.500.04 0.080.05 0.090.12 0.060.07 0.09D SVDV1.08 1.100.22 0.240.08 0.080.09 0.100.08 0.120.28 0.34C+ C+ C- S4 S5 S6 E FMDV“O”0.94 0.840.24 0.220.06 0.061.22 1.120.09 0.100.13 0.17F “A”1.10 1.020.11 0.130.06 0.040.10 0.100.28 0.260.20 0.28G“Asia-I”0.39 0.410.29 0.210.09 0.090.10 0.090.10

27、 0.100.35 0.33H SVDV0.88 0.780.15 0.110.05 0.050.11 0.070.09 0.090.10 0.12表3-2.平均OD值/平均修正OD值 C+ C+ C- S1 S2 S3A FMDV“O”1.79/1.750.51/0.460.051.58/1.530.70/0.650.09/0.04B “A”1.35/1.290.41/0.350.060.08/0.021.27/1.210.09/0.03C “Asia-I”1.22/1.160.51/0.450.060.07/0.030.09/0.030.08/0.02D SVDV1.09/1.010.23

28、/0.150.080.10/0.020.10/0.020.31/0.23 C+ C+ C- S4 S5 S6E FMDV“O”0.89/0.830.23/0.170.061.17/1.110.10/0.040.15/0.09F “A”1.06/1.010.12/0.070.050.10/0.050.27/0.220.24/0.19G “Asia-I”0.40/0.310.25/0.160.090.10/0.010.10/0.010.34/0.25H SVDV0.83/0.780.13/0.080.050.09/0.050.09/0.040.11/0.064.2 結果判定4.2.1 試驗不成立

29、如果空白對照(C-)平均OD值0.10，則試驗不成立，本試驗結果無效。4.2.2 試驗基本成立 如果空白對照(C-)平均OD值0.10，則試驗基本成立。4.2.3 試驗絕對成立 如果空白對照(C-)平均OD值0.10，C+ 平均修正OD值0.10，C+ 平均修正OD值1.00, 試驗絕對成立。如表2中A、B、C、D行所列數據。4.2.3.1如果某一待檢樣品某一型的平均修正OD值0.10，則該血清型為陰性。如S1的“A”、“Asia-1”型和“SVDV”。4.2.3.2如果某一待檢樣品某一型的平均修正OD值0.10，而且比其他型的平均修正OD值大2倍或2倍以上，則該樣品為該最高平均修正OD值所在

30、的血清型。如S1為“O”型；S3為“Asia-I”型。4.2.3.3雖然某一待檢樣品某一型的平均修正OD值0.10，但不大于其他型的平均修正OD值的2倍，則該樣品只能判定為可疑。該樣品應接種乳鼠或細胞，并盲傳數代增毒后再作檢測。如S2“A”型。4.2.4 試驗部分成立 如果空白對照(C-)平均OD值0.10，C+ 平均修正OD值0.10，C+ 平均修正OD值1.00, 試驗部分成立。如表2中E、F、G、H行所列數據。4.2.4.1如果某一待檢樣品某一型的平均修正OD值0.10，而且比其他型的平均修正OD值大2倍或2倍以上，則該樣品為該最高平均修正OD值所在的血清型。 例如S4判定為“O”型。4

31、.2.4.2如果某一待檢樣品某一型的平均修正OD值介于0.101.00之間,而且比其他型的平均修正OD值大2倍或2倍以上，該樣品可以判定為該最高OD值所在血清型。例如S5判定為“A”型。4.2.4.3如果某一待檢樣品某一型的平均修正OD值介于0.101.00之間,但不比其他型的平均修正OD值大2倍，該樣品應增毒后重檢。如S6“亞洲-I”型。注意：重復試驗時，首先考慮調整對照抗原的工作濃度。如調整后再次試驗結果仍不合格，應更換對照抗原或其他試劑。附件二反向間接血凝試驗（RIHA）1 材料準備1.1 96孔微型聚乙烯血凝滴定板（110度），微量振蕩器或微型混合器，0.025 mL、0.05mL稀釋

32、用滴管、乳膠吸頭或25L、50L移液加樣器。1.2 pH7.6、0.05mol/L磷酸緩沖液（pH7.6、0.05mol/L PB），pH7.6、50%丙三醇磷酸緩沖液（GPB），pH7.2、0.11mol/L磷酸緩沖液（pH7.2、0.11mol/L PB），配制方法見中華人民共和國國家標準（GB/T 19200-2003）豬水泡病診斷技術附錄A（規范性附錄）。1.3 稀釋液I、稀釋液II，配制方法見中華人民共和國國家標準（GB/T 19200-2003）豬水泡病診斷技術附錄B（規范性附錄）。1.4 標準抗原、陽性血清，由指定單位提供，按說明書使用和保存。1.5敏化紅細胞診斷液：由指定單位提

33、供，效價滴定見中華人民共和國國家標準（GB/T 19200-2003）豬水泡病診斷技術附錄C（規范性附錄）。1.6 被檢材料處理方法見中華人民共和國國家標準（GB/T 19200-2003）豬水泡病診斷技術附錄E（規范性附錄）。2 操作方法2.1 使用標準抗原進行口蹄疫A、O、C、Asia-I型及與豬水泡病鑒別診斷。2.1.1被檢樣品的稀釋：把8只試管排列于試管架上，自第1管開始由左至右用稀釋液I作二倍連續稀釋（即1:6、1:12、1:241:768）,每管容積0.5 mL。2.1.2按下述滴加被檢樣品和對照：2.1.2.1在血凝滴定板上的第一至五排，每排的第8孔滴加第8管稀釋被檢樣品0.05

34、 mL，每排的第7孔滴加第7管稀釋被檢樣品0.05 mL，以此類推至第1孔。2.1.2.2每排的第9 孔滴加稀釋液I 0.05 mL,作為稀釋液對照。2.1.2.3每排的第10孔按順序分別滴加口蹄疫A、O、C、Asia-I型和豬水泡病標準抗原（1：30稀釋）各0.05 mL，作為陽性對照。2.1.3 滴加敏化紅細胞診斷液：先將敏化紅細胞診斷液搖勻，于滴定板第一至五排的第110孔分別滴加口蹄疫A、O、C、Asia-I型和豬水泡病敏化紅細胞診斷液，每孔0.025 mL，置微量振蕩器上振蕩1分鐘2分鐘,2035放置1.5小時2小時后判定結果。2.2使用標準陽性血清進行口蹄疫O型及與豬水泡病鑒別診斷。

35、2.2.1每份被檢樣品作四排、每孔先各加入25L稀釋液II。2.2.2每排第1孔各加被檢樣品25L，然后分別由左至右作二倍連續稀釋至第7孔（豎板）或第11孔（橫板）。每排最后孔留作稀釋液對照。2.2.3滴加標準陽性血清：在第一、三排每孔加入25L稀釋液II；第二排每孔加入25L稀釋至1:20的口蹄疫O型標準陽性血清；第四排每孔加入25L稀釋至1:100的豬水泡病標準陽性血清；置微型混合器上振蕩1分鐘2分鐘，加蓋置37作用30分鐘。2.2.4滴加敏化紅細胞診斷液：在第一和第二排每孔加入口蹄疫O型敏化紅細胞診斷液25L；第三和第四排每孔加入豬水泡病敏化紅細胞診斷液25L；置微型混合器上振蕩1分鐘2

36、分鐘，加蓋2035放置2小時后判定結果。3 結果判定3.1按以下標準判定紅細胞凝集程度：“+”100%完全凝集，紅細胞均勻的分布于孔底周圍；“+”75%凝集，紅細胞均勻的分布于孔底周圍，但孔底中心有紅細胞形成的針尖大的小點；“+”50%凝集，孔底周圍有不均勻的紅細胞分布，孔底有一紅細胞沉下的小點；“+”25%凝集，孔底周圍有不均勻的紅細胞分布，但大部分紅細胞已沉積于孔底；“”不凝集，紅細胞完全沉積于孔底成一圓點。3.2操作方法2.1的結果判定：稀釋液I對照孔不凝集、標準抗原陽性孔凝集試驗方成立。3.2.1若只第一排孔凝集，其余四排孔不凝集，則被檢樣品為口蹄疫A型；若只第二排孔凝集，其余四排孔不

37、凝集，則被檢樣品為口蹄疫O型；以此類推。若只第五排孔凝集，其余四排孔不凝集，則被檢樣品為豬水泡病3.2.2致紅細胞50%凝集的被檢樣品最高稀釋度為其凝集效價。3.2.3如出現2排以上孔的凝集，以某排孔的凝集效價高于其余排孔的凝集效價2個對數（以2為底）濃度以上者即可判為陽性，其余判為陰性。3.3操作方法2.2的結果判定：稀釋液II對照孔不凝集試驗方可成立。3.3.3.1若第一排出現2孔以上的凝集（+以上），且第二排相對應孔出現2個孔以上的凝集抑制，第三、四排不出現凝集判為口蹄疫O型陽性。若第三排出現2孔以上的凝集（+以上），且第四排相對應孔出現2個孔以上的凝集抑制，第一、二排不出現凝集則判為豬

38、水泡病陽性。3.3.3.2致紅細胞50%凝集的被檢樣品最高稀釋度為其凝集效價。附件三正向間接血凝試驗（IHA）1 原理 用已知血凝抗原檢測未知血清抗體的試驗，稱為正向間接血凝試驗（IHA）。 抗原與其對應的抗體相遇，在一定條件下會形成抗原復合物，但這種復合物的分子團很小，肉眼看不見。若將抗原吸附（致敏）在經過特殊處理的紅細胞表面，只需少量抗原就能大大提高抗原和抗體的反應靈敏性。這種經過口蹄疫純化抗原致敏的紅細胞與口蹄疫抗體相遇，紅細胞便出現清晰可見的凝集現象。2 適用范圍 主要用于檢測O型口蹄疫免疫動物血清抗體效價。3 試驗器材和試劑3.1 96孔110°V型醫用血凝板，與血凝板大小

39、相同的玻板3.2 微量移液器（50L 25L）取液塑咀3.3 微量振蕩器3.4 O型口蹄疫血凝抗原3.5 O型口蹄疫陰性對照血清3.6 O型口蹄疫陽性對照血清3.7 稀釋液3.8 待檢血清（每頭約0.5ml血清即可）56水浴滅活30分鐘4 試驗方法4.1 加稀釋液 在血凝板上1-6排的1-9孔；第7排的1-4孔第6-7孔；第8排的1-12孔各加稀釋液50L。4.2 稀釋待檢血清 取1號待檢血清50L加入第1排第1孔，并將塑咀插入孔底，右手拇指輕壓彈簧1-2次混勻（避免產生過多的氣泡），從該孔取出50L移入第2孔，混勻后取出50L移入第3 孔直至第9孔混勻后取出50L丟棄。此時第1排1-9孔待檢

40、血清的稀釋度（稀釋倍數）依次為：1:2、1:4、1:8、1:16、1:32、1:64、1:128、1:256、1:512。 取2號待檢血清加入第2排；取3號待檢血清加入第3排均按上法稀釋，注意！每取一份血清時，必須更換塑咀一個。4.3 稀釋陰性對照血清 在血凝板的第7排第1孔加陰性血清50L，對倍稀釋至第4孔，混勻后從該孔取出50L丟棄。此時陰性血清的稀釋倍數依次為1:2、1:4、1:8、1:16。第6-7孔為稀釋液對照。4.4 稀釋陽性對照血清 在血凝板的第8排第1孔加陽性血清50L，對倍數稀釋至第12孔，混勻后從該孔取出50L丟棄。此時陽性血清的稀釋倍數依次為1：2-1：4096。4.5

41、加血凝抗原 被檢血清各孔、陰性對照血清各孔、陽性對照血清各孔、稀釋液對照孔均各加O型血凝抗原（充分搖勻，瓶底應無血球沉淀）25L。4.6 振蕩混勻 將血凝板置于微量振蕩器上1-2分鐘，如無振蕩器，用手輕拍混勻亦可，然后將血凝板放在白紙上觀察各孔紅血球是否混勻，不出現血球沉淀為合格。蓋上玻板，室溫下或37下靜置1.5-2小時判定結果，也可延至翌日判定。4.7 判定標準 移去玻板，將血凝板放在白紙上，先觀察陰性對照血清1:16孔，稀釋液對照孔，均應無凝集（血球全部沉入孔底形成邊緣整齊的小圓點），或僅出現“+”凝集（血球大部沉于孔底，邊緣稍有少量血球懸浮）。 陽性血清對照1:2-1:256各孔應出現

42、“+”“+”凝集為合格（少量血球沉入孔底，大部血球懸浮于孔內）。在對照孔合格的前提下，再觀察待檢血清各孔，以呈現“+”凝集的最大稀釋倍數為該份血清的抗體效價。例如1號待檢血清1-5孔呈現“+”“+”凝集，6-7孔呈現“+”凝集，第8孔呈現“+”凝集，第9孔無凝集，那么就可判定該份血清的口蹄疫抗體效價為1:128。接種口蹄疫疫苗的豬群免疫抗體效價達到1:128（即第7孔）牛群、羊群免疫抗體效價達到1:256（第8孔）呈現“+”凝集為免疫合格。5 檢測試劑的性狀、規格5.1 性狀5.1.1 液體血凝抗原：搖勻呈棕紅色（或咖啡色），靜置后，血球逐漸沉入瓶底。5.1.2 陰性對照血清：淡黃色清亮稍帶粘

43、性的液體。5.1.3 陽性對照血清：微紅或淡色稍混濁帶粘性的液體。5.1.4 稀釋液：淡黃或無色透明液體，低溫下放置，瓶底易析出少量結晶，在水浴中加溫后即可全溶，不影響使用。5.2 包裝5.2.1 液體血凝抗原：搖勻后即可使用，5ml/瓶。5.2.2 陰性血清：1ml/瓶，直接稀釋使用。5.2.3 陽性血清：1ml/瓶，直接稀釋使用。5.2.4 稀釋液：100 ml/瓶，直接使用，4-8保存。5.2.5 保存條件及保存期5.2.5.1 液體血凝抗原：4-8保存（切勿凍結），保存期3個月。5.2.5.2 陰性對照血清：-15-20保存，有效期1年。5.2.5.3 陽性對照血清：-15-20保存，

44、有效期1年。6 注意事項6.1 為使檢測獲得正確結果，請在檢測前仔細閱讀說明書。6.2 嚴重溶血或嚴重污染的血清樣品不宜檢測，以免發生非特異性反應。6.3 勿用90°和130°血凝板，嚴禁使用一次性血凝板，以免誤判結果。6.4 用過的血凝板應及時在水龍頭沖凈血球。再用蒸餾水或去離子水沖洗2次，甩干水份放37恒溫箱內干燥備用。檢測用具應煮沸消毒，37干燥備用。血凝板應浸泡在洗液中（濃硫酸與重鉻酸鉀按1：1混合），48小時撈出后清水沖凈。6.5 每次檢測只做一份陰性、陽性和稀釋液對照。“-”表示完全不凝集或0-10%血球凝集。“+”表示10-25%血球凝集 “+”表示75%血球

45、凝集。“+”表示50%血球凝集 “+”表示90-100%血球凝集。6.6 用不同批次的血凝抗原檢測同一份血清時，應事先用陽性血清準確測定各批次血凝抗原的效價，取抗原效價相同或相近的血凝抗原檢測待檢血清抗體水平的結果是基本一致的，如果血凝抗原效價差別很大用來檢測同一血清樣品，肯定會出現檢測結果不一致。6.7 收到本試劑盒時，應立即打開包裝，取出血凝抗原瓶，用力搖動，使粘附在瓶蓋上的紅細胞搖下，否則易出現沉渣，影響使用效果。附件四口蹄疫病料的采集、保存與運送采集、保存和運輸樣品須符合下列要求，并填寫樣品采集登記表。1 樣品的采集和保存1.1 組織樣品1.1.1 樣品的選擇用于病毒分離、鑒定的樣品以

46、發病動物(牛、羊或豬)未破裂的舌面或蹄部,鼻鏡,乳頭等部位的水泡皮和水泡液最好。對臨床健康但懷疑帶毒的動物可在撲殺后采集淋巴結、脊髓、肌肉等組織樣品作為檢測材料。1.1.2 樣品的采集和保存水泡樣品采集部位可用清水清洗，切忌使用酒精、碘酒等消毒劑消毒、擦拭。1.1.2.1 未破裂水泡中的水泡液用滅菌注射器采集至少1毫升，裝入滅菌小瓶中(可加適量抗菌素)，加蓋密封；盡快冷凍保存。1.1.2.2 剪取新鮮水泡皮35克放入滅菌小瓶中,加適量（2倍體積）50甘油/磷酸鹽緩沖液(pH7.4), 加蓋密封；盡快冷凍保存。1.1.2.3 在無法采集水泡皮和水泡液時，可采集淋巴結、脊髓、肌肉等組織樣品35克裝

47、入潔凈的小瓶內, 加蓋密封；盡快冷凍保存。每份樣品的包裝瓶上均要貼上標簽，寫明采樣地點、動物種類、編號、時間等。1.2 牛、羊食道-咽部分泌物(O-P液)樣品1.2.1 樣品采集被檢動物在采樣前禁食(可飲水)12小時，以免反芻胃內容物嚴重污染O-P液。采樣探杯在使用前經0.2檸檬酸或2氫氧化鈉浸泡5分鐘，再用自來水沖洗。每采完一頭動物,探杯要重復進行消毒和清洗。采樣時動物站立保定，將探杯隨吞咽動作送入食道上部1015cm處，輕輕來回移動23次，然后將探杯拉出。如采集的O-P液被反芻胃內容物嚴重污染，要用生理鹽水或自來水沖洗口腔后重新采樣。1.2.2 樣品保存 將探杯采集到的810mL O-P液

48、倒入25 mL以上的滅菌玻璃容器中, 容器中應事先加有810mL細胞培養液或磷酸鹽緩沖液（0.04mol/L 、pH7.4），加蓋密封后充分搖勻，貼上防水標簽,并寫明樣品編號、采集地點、動物種類、時間等，盡快放入裝有冰塊的冷藏箱內，然后轉往-60冰箱凍存。通過病原檢測，做出追溯性診斷。1.3 血清 懷疑曾有疫情發生的畜群，錯過組織樣品采集時機時，可無菌操作采集動物血液，每頭不少于10mL。自然凝固后無菌分離血清裝入滅菌小瓶中，可加適量抗菌素，加蓋密封后冷藏保存。每瓶貼標簽并寫明樣品編號，采集地點，動物種類，時間等。通過抗體檢測，做出追溯性診斷。1.4 采集樣品時要填寫樣品采集登記表2 樣品運送

49、運送前將封裝和貼上標簽，已預冷或冰凍的樣品玻璃容器裝入金屬套筒中，套筒應填充防震材料，加蓋密封，與采樣記錄一同裝入專用運輸容器中。專用運輸容器應隔熱堅固，內裝適當冷凍劑和防震材料。外包裝上要加貼生物安全警示標志。以最快方式，運送到檢測單位。為了能及時準確地告知檢測結果，請寫明送樣單位名稱和聯系人姓名、聯系地址、郵編、電話、傳真等。送檢材料必須附有詳細說明，包括采樣時間、地點、動物種類、樣品名稱、數量、保存方式及有關疫病發生流行情況、臨床癥狀等。附件五口蹄疫撲殺技術規范1 撲殺范圍：病畜及規定撲殺的易感動物。2 使用無出血方法撲殺：電擊、藥物注射。3 將動物尸體用密閉車運往處理場地予以銷毀。4

50、撲殺工作人員防護技術要求4.1 穿戴合適的防護衣服4.1.1 穿防護服或穿長袖手術衣加防水圍裙。4.1.2 戴可消毒的橡膠手套。4.1.3 戴N95口罩或標準手術用口罩。4.1.4 戴護目鏡。4.1.5 穿可消毒的膠靴，或者一次性的鞋套。4.2 洗手和消毒4.2.1 密切接觸感染牲畜的人員,用無腐蝕性消毒液浸泡手后，在用肥皂清洗2次以上。4.2.2 牲畜撲殺和運送人員在操作完畢后，要用消毒水洗手，有條件的地方要洗澡。4.3 防護服、手套、口罩、護目鏡、膠鞋、鞋套等使用后在指定地點消毒或銷毀。附件六口蹄疫無害化處理技術規范所有病死牲畜、被撲殺牲畜及其產品、排泄物以及被污染或可能被污染的墊料、飼料

51、和其他物品應當進行無害化處理。無害化處理可以選擇深埋、焚燒等方法，飼料、糞便也可以堆積發酵或焚燒處理。1 深埋1.1 選址：掩埋地應選擇遠離學校、公共場所、居民住宅區、動物飼養和屠宰場所、村莊、飲用水源地、河流等。避免公共視線。1.2 深度：坑的深度應保證動物尸體、產品、飼料、污染物等被掩埋物的上層距地表1.5米以上。坑的位置和類型應有利于防洪。1.3 焚燒：掩埋前，要對需掩埋的動物尸體、產品、飼料、污染物等實施焚燒處理。1.4 消毒：掩埋坑底鋪2CM厚生石灰；焚燒后的動物尸體、產品、飼料、污染物等表面，以及掩埋后的地表環境應使用有效消毒藥品噴灑消毒。1.5 填土：用土掩埋后，應與周圍持平。填

52、土不要太實，以免尸腐產氣造成氣泡冒出和液體滲漏。1.6 掩埋后應設立明顯標記。2 焚化疫區附近有大型焚尸爐的，可采用焚化的方式。3 發酵飼料、糞便可在指定地點堆積，密封發酵，表面應進行消毒。以上處理應符合環保要求，所涉及到的運輸、裝卸等環節要避免灑漏，運輸裝卸工具要徹底消毒后清洗。附件七口蹄疫疫點、疫區清洗消毒技術規范1 成立清洗消毒隊清洗消毒隊應至少配備一名專業技術人員負責技術指導。2 設備和必需品2.1 清洗工具：掃帚、叉子、鏟子、鍬和沖洗用水管。2.2 消毒工具：噴霧器、火焰噴射槍、消毒車輛、消毒容器等。2.3 消毒劑：醛類、氧化劑類、氯制劑類等合適的消毒劑。2.4 防護裝備：防護服、口

53、罩、膠靴、手套、護目鏡等。3 疫點內飼養圈舍清理、清洗和消毒3.1 對圈舍內外消毒后再行清理和清洗。3.2 首先清理污物、糞便、飼料等。3.3 對地面和各種用具等徹底沖洗，并用水洗刷圈舍、車輛等，對所產生的污水進行無害化處理。3.4 對金屬設施設備，可采取火焰、熏蒸等方式消毒。3.5 對飼養圈舍、場地、車輛等采用消毒液噴灑的方式消毒。3.6 飼養圈舍的飼料、墊料等作深埋、發酵或焚燒處理。3.7 糞便等污物作深埋、堆積密封或焚燒處理。4 交通工具清洗消毒4.1 出入疫點、疫區的交通要道設立臨時性消毒點，對出入人員、運輸工具及有關物品進行消毒。4.2 疫區內所有可能被污染的運載工具應嚴格消毒，車輛

54、內、外及所有角落和縫隙都要用消毒劑消毒后再用清水沖洗，不留死角。4.3 車輛上的物品也要做好消毒。4.4 從車輛上清理下來的垃圾和糞便要作無害化處理。5 牲畜市場消毒清洗5.1 用消毒劑噴灑所有區域。5.2 飼料和糞便等要深埋、發酵或焚燒。6 屠宰加工、儲藏等場所的清洗消毒6.1 所有牲畜及其產品都要深埋或焚燒。6.2 圈舍、過道和舍外區域用消毒劑噴灑消毒后清洗。6.3 所有設備、桌子、冰箱、地板、墻壁等用消毒劑噴灑消毒后沖洗干凈。6.4 所有衣服用消毒劑浸泡后清洗干凈，其他物品都要用適當的方式進行消毒。6.5 以上所產生的污水要經過處理,達到環保排放標準。7 疫點每天消毒1次連續1周,1周后每兩天消毒1次.疫區內疫點以外的區域每兩天消毒1次。附件八口蹄疫流行病學調查規范1 范圍本規范規定了暴發疫情時和平時開展的口蹄疫流行病學調查工作。本規范適用于口蹄疫暴發后的跟蹤調查和平時現況調查的技術要求。2 引用文件下列文件中的條款通過本規范的引用而成為本規范的條款。凡是注日期的引用文件，其隨后所有的修改單位（不包括勘誤的內容）或修訂版均不適用