1、第八章第八章 植物基因工程植物基因工程n轉基因植物轉基因植物 將將外源基因外源基因導入導入植物細胞植物細胞，經，經組織培養組織培養，獲得能夠獲得能夠表達外源基因表達外源基因的植物稱為轉基因的植物稱為轉基因植物。植物。 抗蟲抗蟲 抗病抗病 抗逆抗逆 生產藥物生產藥物第一節 植物的轉基因技術n植物細胞培養技術植物細胞培養技術n植物轉基因技術的基本路線植物轉基因技術的基本路線n轉基因的受體系統轉基因的受體系統n外源基因導入植物的方法外源基因導入植物的方法一、植物轉基因技術的基本路線一、植物轉基因技術的基本路線n分離目的基因分離目的基因n將目的基因與載體連接，形成重組將目的基因與載體連接，形成重組DN

2、ADNAn利用細菌繁殖擴增重組利用細菌繁殖擴增重組DNADNAn將與表達載體相連的重組將與表達載體相連的重組DNADNA導入到目標植導入到目標植物的細胞中物的細胞中n篩選轉化細胞，并誘導產生轉基因植株篩選轉化細胞，并誘導產生轉基因植株n轉基因植株大規模種植轉基因植株大規模種植三、外源基因導入植物的方法（一）（一）DNADNA直接轉移法直接轉移法n化學刺激法化學刺激法 PEGPEG、PNAPNA（肽核酸）、磷酸鈣、氯化鈣（肽核酸）、磷酸鈣、氯化鈣n電擊法電擊法n基因槍法基因槍法n花粉通道法花粉通道法 將外源將外源DNADNA片段在自花授粉后的特定時期注入片段在自花授粉后的特定時期注入柱頭或花柱，

3、外源柱頭或花柱，外源DNADNA沿花粉管通道或傳遞沿花粉管通道或傳遞組織通過珠心進入胚囊，轉化不具備細胞壁組織通過珠心進入胚囊，轉化不具備細胞壁的受精卵，合子或早期胚體細胞。的受精卵，合子或早期胚體細胞。（二）載體介導法（二）載體介導法nTi 質粒介導的整合轉化程序質粒介導的整合轉化程序n植物病毒介導的轉染程序（略）植物病毒介導的轉染程序（略）1 Ti 質粒介導的整合轉化程序nTi 質粒的結構與功能 雙子葉植物尤其豆科植物的根部常常會由于植物根部雙子葉植物尤其豆科植物的根部常常會由于植物根部被土壤桿菌農桿根瘤菌（被土壤桿菌農桿根瘤菌（A.tumefaciens）形成根瘤，形成根瘤，其致瘤特性是

4、由該菌細胞內的野生型質粒其致瘤特性是由該菌細胞內的野生型質粒 Ti質粒質粒（Tumor-inducing plasmid）介導的，介導的，又稱腫瘤誘又稱腫瘤誘導質粒導質粒。 （1 1） Ti Ti 質粒的圖譜區質粒的圖譜區整個質粒整個質粒160 -240 kb160 -240 kb nT-DNAT-DNA區、區、nVirVir區、區、nConCon區、區、nOriOri區區轉移DNA T-DNA（transfer-DNA）左邊界左邊界右邊界右邊界生長素生長素 基因基因細胞分裂細胞分裂 素基因素基因冠癭堿冠癭堿 合成合成tmstmstmttmttmrtmrnT-DNA 12 -24 kbT-DN

5、A 12 -24 kbntmstms的編碼：合成吲哚乙酸的編碼：合成吲哚乙酸ntmrtmr的編碼：合成植物分裂素的編碼：合成植物分裂素ntmttmt的編碼：合成氨基酸衍生物冠癭堿的編碼：合成氨基酸衍生物冠癭堿n在在T-DNA 的兩端還含有左右的兩端還含有左右2 個邊界，長為個邊界，長為25bp的末端重復順序，在切除及整合過程具的末端重復順序，在切除及整合過程具有重要意義。有重要意義。 毒性基因（vir）決定土壤農桿菌對植物的感染和決定土壤農桿菌對植物的感染和T-DNA的轉的轉移，移， 進入和整合。使根癌農桿菌表現出毒性進入和整合。使根癌農桿菌表現出毒性。Con 區區(regions encod

6、ing conjugations，接合轉移編碼區，接合轉移編碼區)：該區：該區段上存在與細菌間接合轉移的有關基因，段上存在與細菌間接合轉移的有關基因，調控調控Ti 質粒在農桿菌之間的轉移質粒在農桿菌之間的轉移。Ori區區(origin of replication，復制起，復制起始區始區)：Ori區上的基因調控區上的基因調控Ti 質粒的自我質粒的自我復制。復制。 第一步第一步: :植物受傷植物受傷 乙乙酰丁香酮、酰丁香酮、 羥基乙酰丁香羥基乙酰丁香酮誘酮誘導導TiTi質質粒的粒的毒性基因表毒性基因表達。達。第二步第二步 感染植物感染植物 膿桿菌吸附于植物的表面傷口部位膿桿菌吸附于植物的表面傷口

7、部位第三步第三步 毒性基因（毒性基因（virvir）表達）表達第四步第四步 T-DNA T-DNA轉移轉移 單鏈單鏈T-DNAT-DNA被切下來，整合到植物基因被切下來，整合到植物基因組中。組中。第五步第五步 誘導冠癭瘤誘導冠癭瘤T-DNA上的產物催化產生過量的生長素和細胞分裂素，形成植物冠癭瘤。上的產物催化產生過量的生長素和細胞分裂素，形成植物冠癭瘤。(2). 農桿菌的感染和生存裸子植物、雙子葉被子植物、禾谷類單子葉裸子植物、雙子葉被子植物、禾谷類單子葉植物（植物（玉米）玉米）能夠自發地整合到植物的染色體上。能夠自發地整合到植物的染色體上。 能轉化多種植物。能轉化多種植物。 強強啟動子啟動子

8、 (3).Ti質粒轉化的對象(4). Ti質粒作為載體的可能性質粒作為載體的可能性T-DNA的的opine合成酶基因上有一個強合成酶基因上有一個強啟動子，能啟動外源基因的表達。啟動子，能啟動外源基因的表達。n野生型野生型Ti Ti 分子大（分子大（200kb200kb）操作起來十分麻煩；）操作起來十分麻煩；n各種限制型酶切位點各種限制型酶切位點多多，切割，切割產生產生很大片段。很大片段。且且單單一的酶切位點一的酶切位點很少很少；ntmstms和和tmr tmr 基因產物干擾植物內源激素的平衡，產基因產物干擾植物內源激素的平衡，產生冠癭瘤，阻礙轉基因植物細胞的分化和再生；生冠癭瘤，阻礙轉基因植物

9、細胞的分化和再生；n無無大腸桿菌的復制起點和作為轉化載體的選擇標記大腸桿菌的復制起點和作為轉化載體的選擇標記基因。基因。 (5) 天然天然Ti質粒作載體的缺點質粒作載體的缺點（6）Ti 質粒的改造n除去除去T-DNA上的上的tmt，tms和和tmr生物合成生物合成基因基因； n除去除去 Ti 質粒的其它非必需序列，質粒的其它非必需序列，n安裝大腸桿菌復制子，安裝大腸桿菌復制子，n安裝植物細胞的篩選標記，如安裝植物細胞的篩選標記，如 neor 基因，基因，使用植物基因的啟動子和使用植物基因的啟動子和polyA化信號序列；化信號序列；n插入人工多克隆位點，以利于外源基因的插入人工多克隆位點，以利于

10、外源基因的克隆。克隆。改造后的Ti質粒載體模式leftrightM C SAMProriVirselect(7)(7) Ti Ti載體的類型載體的類型n共整合載體（cointegrate vectors） 由比利時科學家由比利時科學家P.Zambrisky等等1983年改造年改造的的pGV3850 受體載體，需要同源重組才能插入外源基因。受體載體，需要同源重組才能插入外源基因。n雙元載體（binary vectors） 既有大腸桿菌復制起點也有農桿菌復制起點，既有大腸桿菌復制起點也有農桿菌復制起點，是個穿梭載體。是個穿梭載體。pGV3850n特點：外源基因不能直接插入，需要借助特點：外源基因不

11、能直接插入，需要借助于于pBR322質粒作為中間載體質粒作為中間載體n選擇標記選擇標記膿桿菌選擇標記膿桿菌選擇標記 宿主土壤農桿菌的選擇標記是位于中間載宿主土壤農桿菌的選擇標記是位于中間載體體pBR322上的卡那霉素抗性（上的卡那霉素抗性（Kanr）基）基因。卡那霉素抗性（因。卡那霉素抗性（ Kanr ）基因（卡那）基因（卡那霉素對植物有劇毒！）霉素對植物有劇毒！）最終受體植物的選擇標記最終受體植物的選擇標記 位于位于T-DNA右半部分的胭脂堿合成酶基因右半部分的胭脂堿合成酶基因（nos）。）。外外源基因插入源基因插入pGV3850的過程的過程外源基因外源基因Kanr pBR322土壤農桿菌土

12、壤農桿菌 含含pGV3850植物組織植物組織卡那霉素篩選卡那霉素篩選胭脂堿篩選胭脂堿篩選抗卡那霉素抗卡那霉素 的土壤農桿菌的土壤農桿菌外源基因外源基因 表達鑒定表達鑒定轉化轉化插入插入感染感染pBR322與與pGV3850重組重組整合到整合到 染色體上染色體上pBR322不能在土壤農桿菌中復制，只能同不能在土壤農桿菌中復制，只能同pGV3850重組。只有這樣，土壤農桿菌才能得重組。只有這樣，土壤農桿菌才能得到抗卡那霉素性狀。到抗卡那霉素性狀。轉化后可誘導愈傷組織分化成轉基因植物共共整整合合轉轉化化程程序序雙元載體（雙元載體（binary vectors）能在大腸桿菌和農桿菌中復制，是穿梭載體。

13、能在大腸桿菌和農桿菌中復制，是穿梭載體。n雙元載體的結構雙元載體的結構 Ti質粒被剔除了質粒被剔除了T-DNA、冠癭堿代謝基因、冠癭堿代謝基因、vir基因。基因。 大幅度減小質粒的體積。（大幅度減小質粒的體積。（10kb）Ti的精髓：的精髓：Vir基因（轉移）和左右界（整合）基因（轉移）和左右界（整合）雙元載體的轉化雙元載體的轉化n基因插入基因插入 轉化農桿菌之前，所有的克隆步驟都在大轉化農桿菌之前，所有的克隆步驟都在大腸桿菌里操作。腸桿菌里操作。n幫助質粒（幫助質粒（ helper plasmid） 受體農桿菌內要求帶有整套受體農桿菌內要求帶有整套vir基因（但缺基因（但缺失失T-DNA及左

14、右邊界）的及左右邊界）的“幫助質粒幫助質粒”提提供供vir產物。產物。左左右右外源基因外源基因雙元載體雙元載體Vir幫助質粒幫助質粒農桿菌農桿菌Vir農桿菌農桿菌左左右右外源基因外源基因感染植物感染植物轉化轉化左左右右外源基因外源基因進入植物細胞核，進入植物細胞核，整合，表達整合，表達E.colin雙元系統是雙元系統是穿梭質粒穿梭質粒和和TiTi質粒質粒兩個兩個質粒質粒 ，在接合，在接合后可以自主性地共存于同一農桿菌細胞中。后可以自主性地共存于同一農桿菌細胞中。n穿梭質粒編碼植物選擇標記穿梭質粒編碼植物選擇標記、表達信號表達信號、多克隆多克隆位點位點、兩個兩個T-DNAT-DNAn雙元系統中的

15、雙元系統中的 Ti Ti 具有具有VirVir基因和農桿菌復制起基因和農桿菌復制起始子始子(OriA)(OriA)，但沒有，但沒有T-DNAT-DNA邊界序列。邊界序列。n接合后，兩個質粒可以自主共存于同一農桿菌細接合后，兩個質粒可以自主共存于同一農桿菌細胞中。胞中。 穿梭質粒穿梭質粒可在農桿菌內自主復制可在農桿菌內自主復制n插入外源基因的重組穿梭質粒直接轉化含有插入外源基因的重組穿梭質粒直接轉化含有TiTi質質粒的根瘤農桿菌，經篩選后直接感染植物細胞。粒的根瘤農桿菌，經篩選后直接感染植物細胞。雙元系統的特點雙元系統的特點第三節第三節 植物轉基因技術在植物品種改良植物轉基因技術在植物品種改良中

16、的應用中的應用n控制果實成熟的轉基因植物控制果實成熟的轉基因植物n抗病蟲害的轉基因植物抗病蟲害的轉基因植物n抗除草劑的轉基因植物抗除草劑的轉基因植物n改變花卉形狀和顏色的轉基因植物改變花卉形狀和顏色的轉基因植物n抗環境壓力的轉基因植物抗環境壓力的轉基因植物n產高品質產物的轉基因植物產高品質產物的轉基因植物轉基因育種的程序轉基因育種的程序基因分離基因分離體外重組轉化轉化體安全性評價結合常規育種轉基因品種遺傳穩定性評價市場開發載體的構建農桿菌介導基因槍轟擊篩選 轉基因植物引發的安全事件轉基因植物引發的安全事件n英國英國Pusztai事件事件n康奈爾大學斑蝶事件康奈爾大學斑蝶事件n 加拿大加拿大“超級雜草超級雜草”事件事件n 墨西哥玉米事件墨西哥玉米事件n 中國中國Bt抗蟲棉事件抗蟲棉事件七、轉基因生物潛在危害 潛在危害潛在危害n轉基因食品可能具有毒性轉基因食品可能具有毒性 ;n轉基因食品可能產生過敏反應轉基因食品可能產生過敏反應; n