1、1大腸桿菌感受態細胞的制備、大腸桿菌感受態細胞的制備、重組重組DNA的轉化、克隆篩選的轉化、克隆篩選21. 實驗目的和要求實驗目的和要求通過本實驗學習氯化鈣法制備大腸桿通過本實驗學習氯化鈣法制備大腸桿菌感受態細胞和外源質粒菌感受態細胞和外源質粒DNA轉入受轉入受體菌細胞的技術以及篩選轉化體的技體菌細胞的技術以及篩選轉化體的技術。了解細胞轉化的概念及其在分子術。了解細胞轉化的概念及其在分子生物學研究中的意義。生物學研究中的意義。32. 相關知識及原理相關知識及原理感受態細胞感受態細胞(Competent cells):受體細胞經過一些特殊方法（如：受體細胞經過一些特殊方法（如：CaCl，RuCl

2、等化學試劑法）的處理后，細胞膜的等化學試劑法）的處理后，細胞膜的通透性發生變化，成為能容許多有外源通透性發生變化，成為能容許多有外源D N A 的 載 體 分 子 通 過 的 感 受 態 細 胞的 載 體 分 子 通 過 的 感 受 態 細 胞(competent cell) 。 4轉化（轉化（transformation）：是將異源是將異源DNA分子引入一細胞株系，使受體細分子引入一細胞株系，使受體細胞獲得新的遺傳性狀的一種手段，是基因工程胞獲得新的遺傳性狀的一種手段，是基因工程等研究領域的基本實驗技術。等研究領域的基本實驗技術。 進入細胞的進入細胞的DNA分子通過復制表達，才能實現分子通過

3、復制表達，才能實現遺傳信息的轉移，使受體細胞出現新的遺傳性遺傳信息的轉移，使受體細胞出現新的遺傳性狀。轉化過程所用的受體細胞一般是限制修狀。轉化過程所用的受體細胞一般是限制修飾系統缺陷的變異株，即不含限制性內切酶和飾系統缺陷的變異株，即不含限制性內切酶和甲基化酶的突變株。甲基化酶的突變株。5轉化的方法：轉化的方法：化學的方法化學的方法(熱擊法熱擊法)；使用化學試劑（如；使用化學試劑（如CaCl）制備的感受態細胞，通過熱擊處）制備的感受態細胞，通過熱擊處理將載體理將載體DNA分子導入受體細胞；分子導入受體細胞；1. 電轉化法：使用低鹽緩沖液或水洗制備的電轉化法：使用低鹽緩沖液或水洗制備的感受態細

4、胞，通過高壓脈沖的作用將載體感受態細胞，通過高壓脈沖的作用將載體DNA分子導入受體細胞。分子導入受體細胞。6克隆的篩選：克隆的篩選：主要用不同抗生素基因篩選。常用的主要用不同抗生素基因篩選。常用的抗生素有：氨芐青霉素、卡那霉素、抗生素有：氨芐青霉素、卡那霉素、氯霉素、四環素、鏈霉素等；氯霉素、四環素、鏈霉素等；7將經過轉化后的細胞在選擇性抗生素培養將經過轉化后的細胞在選擇性抗生素培養基中培養，才能較容易地篩選出轉化體，基中培養，才能較容易地篩選出轉化體，即帶有異源即帶有異源DNA分子的受體細胞。否則，分子的受體細胞。否則，如果將轉化后的菌液涂在無選擇性抗生素如果將轉化后的菌液涂在無選擇性抗生素

5、的培養基平板上，會出現成千上萬的細菌的培養基平板上，會出現成千上萬的細菌菌落，將難以確認哪一個克隆含有轉化的菌落，將難以確認哪一個克隆含有轉化的質粒。雖然只有那些含有被轉化質粒的細質粒。雖然只有那些含有被轉化質粒的細菌才能在含有抗生素的平板上生長和繁殖，菌才能在含有抗生素的平板上生長和繁殖，但對于連接混合物而言，此時并不能確定但對于連接混合物而言，此時并不能確定哪個克隆含有插入片段。哪個克隆含有插入片段。8重組質粒克隆的鑒定重組質粒克隆的鑒定鑒定帶有重組質粒克隆的方法常用的有鑒定帶有重組質粒克隆的方法常用的有 -互補、小規模制備質粒互補、小規模制備質粒DNA進行酶切分析、進行酶切分析、插入失活

6、、插入失活、PCR以及雜交篩選的方法。最以及雜交篩選的方法。最常用的方法是小規模制備質粒常用的方法是小規模制備質粒DNA進行酶進行酶切分析，對于帶有切分析，對于帶有LacZ基因的載體還可以基因的載體還可以結合結合 -互補現象來篩選。互補現象來篩選。9 -互補現象：互補現象：因為有些載體都帶有一個因為有些載體都帶有一個LacLacZ Z基因的調控序基因的調控序列和頭列和頭146146個氨基酸的編碼信息，編碼個氨基酸的編碼信息，編碼 - -互補互補肽，該肽段能與宿主編碼的缺陷型肽，該肽段能與宿主編碼的缺陷型 - -半乳糖半乳糖苷酶實現基因內互補（苷酶實現基因內互補（ -互補互補）。）。當這種載當這

7、種載體轉入可編碼體轉入可編碼 半乳糖苷酶半乳糖苷酶C C端部分序列的端部分序列的宿主細胞中時，在異丙基宿主細胞中時，在異丙基- - -D-D硫代半乳糖苷硫代半乳糖苷（IPTGIPTG）的誘導下，）的誘導下，宿主可同時合成這兩種宿主可同時合成這兩種肽段，肽段，雖然它們各自都沒有酶活性，但它們雖然它們各自都沒有酶活性，但它們可以融為一體形成具有酶活性的蛋白質。所可以融為一體形成具有酶活性的蛋白質。所以稱這種現象為以稱這種現象為 - -互補現象。互補現象。10由互補產生的由互補產生的 半乳糖苷酶半乳糖苷酶( (LacLacZ)Z)能夠作能夠作用于生色底物用于生色底物5 5溴溴4 4氯氯3 3吲哚吲哚

8、 D D半乳糖苷半乳糖苷(X-gal)(X-gal)而產生藍色的菌落，所以而產生藍色的菌落，所以利用這個特點，在載體的該基因編碼序列之利用這個特點，在載體的該基因編碼序列之間人工放入一個多克隆位點，當插入一個外間人工放入一個多克隆位點，當插入一個外源源DNADNA片段時，會造成片段時，會造成LacLacZ(Z( ) )基因的失活，基因的失活，破壞破壞 -互補作用，互補作用，就不能產生具有活性的酶。就不能產生具有活性的酶。所以，有重組質粒的菌落為白色，而沒有重所以，有重組質粒的菌落為白色，而沒有重組質粒的菌落為藍色。組質粒的菌落為藍色。1112重組重組DNADNA轉化細菌過轉化細菌過程示意圖程示

9、意圖133儀器、材料和試劑儀器、材料和試劑無菌超凈臺，電熱恒溫水浴，分光光度計，離心無菌超凈臺，電熱恒溫水浴，分光光度計，離心機，移液器，微型離心管等；機，移液器，微型離心管等；菌株：菌株：E.coliE.coli DH5 DH5質粒：質粒：pBluscript KS+DNA 片段的重組質粒以片段的重組質粒以及及pBluscript KS 空質粒；空質粒；LBLB培養基；含抗菌素的培養基；含抗菌素的LBLB平板培養基（氨芐青霉平板培養基（氨芐青霉素，濃度素，濃度50-10050-100g gmLmL，X-gal 20-48X-gal 20-48g/ml, g/ml, IPTG 100 IPTG

10、 100 g/mlg/ml。一般將抗生素、。一般將抗生素、X-galX-gal和和IPTGIPTG配制成配制成10001000 儲備液，用時按培養基的量再加儲備液，用時按培養基的量再加入入）；）；預冷預冷CaClCaCl2 2溶液（溶液（0.1mol0.1molL L） 144操作步驟操作步驟 1）大腸桿菌感受態細胞的制備）大腸桿菌感受態細胞的制備(CaCl2法法) （1）從新活化的）從新活化的E.coli DH5菌平板上挑取菌平板上挑取一單菌落，接種于一單菌落，接種于35ml LB液體培養中，液體培養中，37振蕩培養振蕩培養12h左右，直至對數生長期。將左右，直至對數生長期。將該菌懸液以該菌

11、懸液以1:1001:50轉接于轉接于100ml LB液體液體培養基中，培養基中，37振蕩擴大培養，當培養液開振蕩擴大培養，當培養液開始出現混濁后，每隔始出現混濁后，每隔2030min測一次測一次OD600nm，至，至OD600nm0.5時停止培養；時停止培養；15（2）每組取培養液）每組取培養液3個個2ml轉入轉入2ml離心管離心管中，在冰上冷卻中，在冰上冷卻20-30min，于，于4，4000rmin離心離心10min（從這一步開始，所有操（從這一步開始，所有操作均在冰上進行，速度盡量快而穩）；作均在冰上進行，速度盡量快而穩）；（3）倒凈上清培養液，用）倒凈上清培養液，用1ml冰冷的冰冷的0

12、.1mo1L CaCl2溶液輕輕懸浮細胞，冰浴；溶液輕輕懸浮細胞，冰浴；（4）04，4000rmin離心離心10min；（5）棄去上清液，加入）棄去上清液，加入500l冰冷的冰冷的0.1mo1L CaCl2溶液，小心懸浮細胞。溶液，小心懸浮細胞。04，4000rmin離心離心10min；16（6）棄去上清液，加入）棄去上清液，加入100l冰冷的冰冷的0.1mo1L CaCl2溶液，小心懸浮細胞，冰上放置片刻溶液，小心懸浮細胞，冰上放置片刻后，即制成了感受態細胞懸液；后，即制成了感受態細胞懸液；（7）制備好的感受態細胞懸液可直接用于轉）制備好的感受態細胞懸液可直接用于轉化實驗，也可加入占總體積化

13、實驗，也可加入占總體積15左右高壓滅菌左右高壓滅菌過的甘油，混勻后分裝于過的甘油，混勻后分裝于1.5ml離心管中，置離心管中，置于于-70條件下，可保存半年至一年。條件下，可保存半年至一年。172）細胞轉化）細胞轉化 (1) 分別取分別取3個個100l感受態細胞懸液感受態細胞懸液(如是冷如是冷凍保存液，則需化凍后馬上進行下面的操凍保存液，則需化凍后馬上進行下面的操作作)，第一組，加入，第一組，加入10 l重組質粒重組質粒DNA(體體積不超過積不超過10l)+ 100l感受態細胞，此管為感受態細胞，此管為轉化實驗組。第二組，插入轉化實驗組。第二組，插入DNA片段對照片段對照組，即酶切后組，即酶切

14、后DNA片段片段25ng+100l感受態感受態細胞懸液；第三組，質粒細胞懸液；第三組，質粒DNA對照組，即對照組，即1ng 未酶切未酶切pBluescript 質粒質粒DNA十十100l感感受態細胞懸液。受態細胞懸液。 18(2) 將以上各樣品輕輕搖勻，冰上放置將以上各樣品輕輕搖勻，冰上放置20-30min，于，于42水浴中保溫水浴中保溫12min，然后，然后迅速冰上冷卻迅速冰上冷卻2min(3) 立即向上述管中分別加入立即向上述管中分別加入0.4ml LB液體液體培養基（不需在冰上操作），使總體積到培養基（不需在冰上操作），使總體積到0.5ml，該溶液稱為轉化反應原液，搖勻后，該溶液稱為轉化

15、反應原液，搖勻后于于37振蕩培養約振蕩培養約45-60min ，使受體菌恢復，使受體菌恢復正常生長狀態，并使轉化體表達抗生素基因正常生長狀態，并使轉化體表達抗生素基因產物產物(Ampr)。193) 平板培養（有時需要稀釋）平板培養（有時需要稀釋）(1)取各樣品培養液取各樣品培養液0.1ml，分別接種于，分別接種于含抗菌素含抗菌素LB平板培養基上，涂勻平板培養基上，涂勻（如果用玻璃棒涂抹，酒精燈燒過（如果用玻璃棒涂抹，酒精燈燒過后稍微涼一下再用，不要過燙）。后稍微涼一下再用，不要過燙）。20(2) 菌液完全被培養基吸收后菌液完全被培養基吸收后，倒置培養皿，倒置培養皿，于于37恒溫培養箱內培養過夜

16、恒溫培養箱內培養過夜(12-16小時小時)，待菌落生長良好而又未互相重疊時停止培養，待菌落生長良好而又未互相重疊時停止培養，對于可以藍白斑篩選的質粒和菌株來說，此對于可以藍白斑篩選的質粒和菌株來說，此時應該能清楚地看到藍色和白色菌落。時應該能清楚地看到藍色和白色菌落。用用 CaCl2法制備的感受態細胞，可使每微克法制備的感受態細胞，可使每微克超螺旋質粒超螺旋質粒 DNA產生產生5 106-2 107個轉化菌個轉化菌落。在實際工作中，每微克有落。在實際工作中，每微克有105以上的轉化以上的轉化菌落足以滿足一般的克隆實驗。菌落足以滿足一般的克隆實驗。214) 檢出轉化體和計算轉化率檢出轉化體和計算轉化率統計每個培養皿中的菌落數，各