1、蛋白質(zhì)組學(xué)ProteomicsShen YShen Y溫州醫(yī)科大學(xué) 檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)院 生命科學(xué)學(xué)院2蛋白質(zhì)是基因的表達(dá)產(chǎn)物和基因功能的執(zhí)行者，基因組所包含的功能信息必須在蛋白質(zhì)水平上進(jìn)行解釋?zhuān)拍茏罱K得到明確的結(jié)論。因此，要想闡明生命過(guò)程的本質(zhì)，對(duì)蛋白質(zhì)組的研究就成了一個(gè)必然的選擇。 3Genome = static compositionProteome = highly flexible compositionIdentical Genome but different looks.?4Identical TwinsImportant traitsThrough the proteome5蛋白質(zhì)

2、組研究的必要性蛋白質(zhì)組研究的必要性蛋白質(zhì)蛋白質(zhì)基因基因多多少少動(dòng)態(tài)動(dòng)態(tài)靜態(tài)靜態(tài)翻譯后修飾翻譯后修飾序列恒定序列恒定組分復(fù)雜組分復(fù)雜簡(jiǎn)單簡(jiǎn)單網(wǎng)絡(luò)網(wǎng)絡(luò)獨(dú)立獨(dú)立 100,000 proteins3 billion bases28,000 genes 人類(lèi)基因組中絕大部分基因及其功能有人類(lèi)基因組中絕大部分基因及其功能有待于在蛋白質(zhì)水平上加以揭示與闡述。待于在蛋白質(zhì)水平上加以揭示與闡述。 基因組基因組 轉(zhuǎn)錄組轉(zhuǎn)錄組 蛋白質(zhì)組蛋白質(zhì)組基因組告訴你，理論上能夠發(fā)生什么？基因組告訴你，理論上能夠發(fā)生什么？mRNA告訴你，可能發(fā)生什么？告訴你，可能發(fā)生什么？蛋白質(zhì)組告訴你，正在發(fā)生什么？蛋白質(zhì)組告訴你，正在發(fā)生

3、什么？9蛋白質(zhì)組（蛋白質(zhì)組（proteome）：）：PROTEins + genOME，意思是，意思是Proteins expressed by a genome（基因組表達(dá)的所有蛋（基因組表達(dá)的所有蛋白質(zhì)）白質(zhì)）1994年由澳大利亞科學(xué)家年由澳大利亞科學(xué)家Wilkins提出，是一個(gè)動(dòng)態(tài)的概念，提出，是一個(gè)動(dòng)態(tài)的概念，指的是不同細(xì)胞在不同時(shí)相表達(dá)不同的蛋白質(zhì)指的是不同細(xì)胞在不同時(shí)相表達(dá)不同的蛋白質(zhì) 蛋白質(zhì)組（原核生物和真核生物）蛋白質(zhì)組（原核生物和真核生物）l對(duì)應(yīng)于基因組的所有蛋白質(zhì)構(gòu)成的整體，不是局限于一個(gè)對(duì)應(yīng)于基因組的所有蛋白質(zhì)構(gòu)成的整體，不是局限于一個(gè) 或幾個(gè)蛋白質(zhì)或幾個(gè)蛋白質(zhì)l同一基因

4、組在不同細(xì)胞、不同組織中的表達(dá)情況各不相同同一基因組在不同細(xì)胞、不同組織中的表達(dá)情況各不相同 在空間和時(shí)間上動(dòng)態(tài)變化著的整體在空間和時(shí)間上動(dòng)態(tài)變化著的整體l整體性、動(dòng)態(tài)性和系統(tǒng)性整體性、動(dòng)態(tài)性和系統(tǒng)性3.13.1概述概述10蛋白質(zhì)組學(xué)蛋白質(zhì)組學(xué)(proteomics): 指應(yīng)用各種技術(shù)手段來(lái)研究蛋白指應(yīng)用各種技術(shù)手段來(lái)研究蛋白質(zhì)組的一門(mén)新興科學(xué)，其目的是從整體的角度分析細(xì)胞內(nèi)動(dòng)質(zhì)組的一門(mén)新興科學(xué)，其目的是從整體的角度分析細(xì)胞內(nèi)動(dòng)態(tài)變化的蛋白質(zhì)組成成份、表達(dá)水平與修飾狀態(tài)，了解蛋白態(tài)變化的蛋白質(zhì)組成成份、表達(dá)水平與修飾狀態(tài)，了解蛋白質(zhì)之間的相互作用與聯(lián)系，揭示蛋白質(zhì)功能與細(xì)胞生命活動(dòng)質(zhì)之間的相互

5、作用與聯(lián)系，揭示蛋白質(zhì)功能與細(xì)胞生命活動(dòng)規(guī)律。規(guī)律。l細(xì)胞器蛋白質(zhì)組學(xué)細(xì)胞器蛋白質(zhì)組學(xué)：通過(guò)純化細(xì)胞器或用質(zhì)譜儀鑒定蛋白質(zhì)復(fù)合物組成來(lái)確定蛋白質(zhì)在亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)中的位置。l表達(dá)蛋白組學(xué)表達(dá)蛋白組學(xué)：把細(xì)胞、組織中的所有蛋白質(zhì)建立成定量表達(dá)圖譜或掃描EST圖。蛋白質(zhì)組學(xué)包括蛋白質(zhì)組學(xué)包括:3.1.3 蛋白質(zhì)組蛋白質(zhì)組學(xué)學(xué)11Western blot、免疫組化驗(yàn)證蛋白質(zhì)并確定其定位根據(jù)氨基酸序列合成寡核苷酸探針，克隆基因蛋白質(zhì)功能研究，包括蛋白質(zhì)生物活性、抗體制備、蛋白質(zhì)相互作用等方面蛋白質(zhì)樣品電泳前蛋白質(zhì)樣品的處理雙向電泳分離 Western blot檢測(cè)選擇目標(biāo)蛋白斑點(diǎn)，膠內(nèi)酶切質(zhì)譜分析（MALD

6、I/TOF或ESI/MS/MS）獲得肽質(zhì)量指紋譜或肽序列標(biāo)簽數(shù)據(jù)庫(kù)檢索鑒定蛋白質(zhì)電轉(zhuǎn)印到膜上 圖像分析 樣品處理蛋白質(zhì)分離蛋白質(zhì)鑒定 蛋白質(zhì)組學(xué)研究流程圖蛋白質(zhì)組學(xué)研究流程圖12蛋白質(zhì)組學(xué)的研究?jī)?nèi)容蛋白質(zhì)組學(xué)的研究?jī)?nèi)容1、蛋白質(zhì)組表達(dá)模式（組成）的研究、蛋白質(zhì)組表達(dá)模式（組成）的研究蛋白質(zhì)組成分鑒定、數(shù)據(jù)庫(kù)構(gòu)建、新型蛋白質(zhì)的發(fā)現(xiàn)、同源蛋白質(zhì)比較、蛋白質(zhì)加工和修飾分析。2、蛋白質(zhì)組功能模式（作用）的研究、蛋白質(zhì)組功能模式（作用）的研究基因產(chǎn)物識(shí)別、基因功能鑒定、基因調(diào)控機(jī)制分析。重要生命活動(dòng)的分子機(jī)制（如細(xì)胞周期、分化與發(fā)育、環(huán)境反應(yīng)與調(diào)節(jié)等）。醫(yī)藥靶分子的尋找和分析（包括新藥靶分子、腫瘤分子標(biāo)

7、記、人體病理介導(dǎo)分子等）。133.2.3 蛋白質(zhì)組研究技術(shù)蛋白質(zhì)組研究技術(shù)一、雙向凝膠電泳技術(shù)一、雙向凝膠電泳技術(shù)二、液相色譜技術(shù)二、液相色譜技術(shù)三、生物質(zhì)譜技術(shù)與蛋白質(zhì)鑒定三、生物質(zhì)譜技術(shù)與蛋白質(zhì)鑒定四、蛋白質(zhì)相互作用的研究技術(shù)四、蛋白質(zhì)相互作用的研究技術(shù)14 一、雙向凝膠電泳技術(shù)一、雙向凝膠電泳技術(shù)（一）（一）2-DE的概念的概念two dimensional gel electrophoresis 2-DE是指第一向的固相pH梯度（immobilized pH gradient，IPG）等電聚焦電泳與第二向SDS-PAGE組成的分離系統(tǒng)，也稱(chēng)雙向聚丙烯酰胺凝膠電泳，簡(jiǎn)稱(chēng)2-DE。等電聚焦

8、電泳是基于蛋白質(zhì)等電點(diǎn)（pI）的差異進(jìn)行分離，SDS-PAGE則是根據(jù)蛋白質(zhì)分子量（Mw）的不同進(jìn)行分離。 15第一向等電聚焦酸堿IPG膠條pH梯度低分子量高分子量第二向SDS-PAGE圖圖7-2 雙向凝膠電泳示意圖雙向凝膠電泳示意圖161、第一向電泳IPG等電聚焦電泳 1）等電聚焦電泳的基本原理）等電聚焦電泳的基本原理 等電聚焦（IEF）是60年代發(fā)展起來(lái)的一種蛋白質(zhì)分析分離手段，如圖所示，在電場(chǎng)中電泳基質(zhì)形成一個(gè)從正極到負(fù)極不斷增大的pH梯度，由于蛋白質(zhì)為兩性電解質(zhì)，帶負(fù)電荷的蛋白質(zhì)分子向正極移動(dòng)，帶正電荷的蛋白質(zhì)分子向負(fù)極移動(dòng)，當(dāng)?shù)鞍踪|(zhì)分子運(yùn)動(dòng)到各自的pI處時(shí)，所帶凈電荷變?yōu)榱悖谑峭Ｖ?/p>

9、遷移而留在該位置上。這種不同的蛋白質(zhì)分別聚集在各自的pI處，形成一條狹窄穩(wěn)定的區(qū)帶而彼此分開(kāi)的現(xiàn)象稱(chēng)為等電點(diǎn)聚焦。171098765432pHpI8.0蛋白質(zhì)pI4.0蛋白質(zhì) 等電聚焦的等電聚焦的“聚焦效應(yīng)聚焦效應(yīng)”18+pH 3pH 7.5pH 10+pH 3pH 7.5pH 10+pH 3pH 7.5pH 10+pH 3pH 7.5pH 10第一向：等電聚焦第一向：等電聚焦19第一向第一向 等電聚焦等電聚焦IEF20212、第二向電泳SDS- PAGE1）SDS-PAGE的原理 在PAGE系統(tǒng)中加入SDS和還原劑后所組成的電泳系統(tǒng)。SDS是一種陰離子去垢劑，疏水端能插入蛋白質(zhì)分子內(nèi)，破壞蛋

10、白質(zhì)分子內(nèi)的氫鍵及疏水作用，改變蛋白質(zhì)分子的三級(jí)和四級(jí)結(jié)構(gòu)；還原劑則斷裂蛋白質(zhì)分子內(nèi)的二硫鍵，使蛋白質(zhì)分子去折疊，結(jié)構(gòu)變得舒展。蛋白質(zhì)分子與SDS充分結(jié)合后，形成帶負(fù)電荷的蛋白質(zhì)-SDS復(fù)合物，所帶負(fù)電荷大大超過(guò)蛋白質(zhì)分子原有的電荷量，消除了不同分子間原有電荷的差異。蛋白質(zhì)-SDS復(fù)合物在聚丙烯酰胺凝膠電泳系統(tǒng)中的遷移率不再與電荷相關(guān)，而主要取決于橢圓棒的長(zhǎng)軸長(zhǎng)度，即蛋白質(zhì)的分子量大小。 第二向第二向 SDS-PAGE23+pH 3pH 7.5pH10chargesize第二向：第二向：SDS-PAGE電泳電泳Proteins migrate through the gel at a rate

11、 proportional to their size.Smallest proteins travel the furthest distance24l樣品制備樣品制備l第一向等電聚焦第一向等電聚焦l第二向第二向SDS-PAGEl凝膠上蛋白的檢測(cè)凝膠上蛋白的檢測(cè)l蛋白的軟件的檢測(cè)蛋白的軟件的檢測(cè)25（二）凝膠上蛋白質(zhì)的檢測(cè)蛋白質(zhì)樣品經(jīng)2-DE分離后，凝膠上的蛋白質(zhì)斑點(diǎn)須用一定的方法使其顯現(xiàn)出來(lái)，讓儀器或人眼檢測(cè)到。26染色方法染色方法考馬斯亮藍(lán)染色考馬斯亮藍(lán)染色銀染（不含戊二醛）銀染（不含戊二醛）熒光染色（熒光染色（Cy3, Cy5），放射性同位素標(biāo)），放射性同位素標(biāo)記等記等28 （一）考馬

12、斯亮藍(lán)染色（一）考馬斯亮藍(lán)染色 考馬斯亮藍(lán)染色是最常用的蛋白質(zhì)染色方法。考馬斯亮藍(lán)R-250化學(xué)名為三苯基甲烷，R代表紅藍(lán)色。考馬斯亮藍(lán)R-250與蛋白質(zhì)的堿性基團(tuán)可逆結(jié)合，染色線性范圍可達(dá)155g，靈敏度為30100ng蛋白質(zhì)。考馬斯亮藍(lán)染色的最大優(yōu)點(diǎn)最大優(yōu)點(diǎn)是染色重復(fù)性好，操作簡(jiǎn)便，不影響后續(xù)的質(zhì)譜鑒定，靈敏度比常用的氨基黑高100倍，但低于銀染色和熒光染色，不能滿足對(duì)低豐度蛋白質(zhì)的檢測(cè)要求，樣品用量大。29 （二）銀染色（二）銀染色 原理 在酸性硝酸銀溶液酸性硝酸銀溶液中蛋白質(zhì)與銀離子發(fā)生作用，然后在堿性pH條件下，銀離子被甲醛還原成銀顆粒沉淀在蛋白質(zhì)上而呈顯棕黑色。銀染色靈敏度很高銀染

13、色靈敏度很高，是考馬斯亮藍(lán)染色法的100倍，但操作繁瑣，重復(fù)性不如考馬斯亮藍(lán)染色，對(duì)糖蛋白、鈣結(jié)合蛋白的染色效果差。30考染和銀染的比較考染和銀染的比較31 (三三) 熒光染料染色熒光染料染色 熒光染料染色法是利用結(jié)合于蛋白質(zhì)的熒光染料發(fā)出的熒光來(lái)檢測(cè)蛋白質(zhì)。用于蛋白質(zhì)染色的熒光染料很多，有的共價(jià)結(jié)合于蛋白質(zhì)上，有的和蛋白質(zhì)形成非共價(jià)結(jié)合。目前商品化的熒光染料有SYPRO Ruby, 其染色方法操作簡(jiǎn)便，靈敏度高達(dá)110ng，染色線性范圍寬，對(duì)糖蛋白、脂蛋白染色效果好，不影響后續(xù)的質(zhì)譜鑒定，是一種較理想的蛋白質(zhì)染色方法，但價(jià)格較昂貴。 32（三）雙向凝膠電泳圖譜的計(jì)算機(jī)分析 細(xì)胞或組織樣本經(jīng)2

14、-DE分離后，得到一張含有成百上千個(gè)蛋白質(zhì)斑點(diǎn)的凝膠電泳圖譜。凝膠圖譜分析包括確定蛋白質(zhì)斑點(diǎn)的位置、大小、染色深淺、pI和分子量；圖譜間的比較、差異蛋白質(zhì)斑點(diǎn)的確定；圖譜質(zhì)量的優(yōu)化、數(shù)據(jù)的儲(chǔ)存管理、數(shù)據(jù)庫(kù)分析等內(nèi)容。借助先進(jìn)的計(jì)算機(jī)技術(shù)和生物信息學(xué)工具，能客觀、有效地從電泳圖譜中提取到有價(jià)值的信息。 33（四） 2-DE的分辨率、重復(fù)性及局限性 2-DE系統(tǒng)有很高的分辨率。商品化的IPG膠條以及標(biāo)準(zhǔn)化的實(shí)驗(yàn)操作使得2-DE具有很高的重復(fù)性，可在不同實(shí)驗(yàn)室間進(jìn)行圖譜的比較，給蛋白質(zhì)組數(shù)據(jù)的共享帶來(lái)了極大的方便。目前沒(méi)有一種分離技術(shù)在分辨率上能與雙向凝膠電泳相媲美。 342-DE存在的不足和缺陷：

15、 首先，2-DE的分辨率仍不能滿足蛋白質(zhì)組學(xué)研究的需要，人類(lèi)基因組有2萬(wàn)3萬(wàn)個(gè)基因，可能表達(dá)的蛋白質(zhì)達(dá)數(shù)十萬(wàn)種，這對(duì)2-DE技術(shù)的分離能力提出了嚴(yán)峻挑戰(zhàn)； 其次，2-DE對(duì)極酸、極堿性和疏水性膜蛋白的分離效果不盡人意，對(duì)具有重要功能的低豐度蛋白質(zhì)的檢測(cè)也是個(gè)很大的難題； 最后，2-DE操作過(guò)程的自動(dòng)化是一個(gè)亟待解決的難點(diǎn)，自動(dòng)化的操作平臺(tái)可減少人為誤差，提高實(shí)驗(yàn)結(jié)果的重復(fù)性，帶來(lái)高通量的分析速度，滿足大規(guī)模蛋白質(zhì)組學(xué)研究的需要。35（五）雙向凝膠電泳分離前的樣品處理 1、分部提取法 用不同的蛋白質(zhì)提取液分部抽提細(xì)胞或組織裂解液，先用水溶液抽提，離心后的上清液中含大部分水溶性蛋白；再用對(duì)膜蛋白具

16、有中等溶解度的提取液抽提沉淀，離心后上清液中含中等疏水性的蛋白質(zhì)，包括膜表面蛋白和膜相關(guān)蛋白；最后用強(qiáng)溶解力的提取液抽提沉淀，得到疏水性強(qiáng)的蛋白質(zhì)。 36 2、亞細(xì)胞成分的分離 亞細(xì)胞成分的分離是指分離細(xì)胞中的各種細(xì)胞器和亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)，如細(xì)胞核、線粒體、細(xì)胞骨架、核基質(zhì)、核仁等，用于蛋白質(zhì)組研究。這是近來(lái)蛋白質(zhì)組學(xué)研究中興起的一個(gè)分支亞細(xì)胞蛋白質(zhì)組學(xué)，它不但可提高蛋白質(zhì)的檢出效率，還能獲得許多關(guān)于亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)和功能方面的重要信息。 373、激光捕獲顯微切割技術(shù)（LCM） 1996年基因公司發(fā)明了一種稱(chēng)為激光捕獲顯微切割（LCM）的新技術(shù)，即在顯微鏡下從組織切片中分離、純化單一類(lèi)型細(xì)胞群或單個(gè)細(xì)胞的

17、技術(shù)。它成功地解決了組織中的細(xì)胞異質(zhì)性問(wèn)題,是分子病理學(xué)和腫瘤基因組學(xué)研究的一項(xiàng)革命性技術(shù) 38二、生物質(zhì)譜技術(shù)與蛋白質(zhì)鑒定（一）質(zhì)譜的基本原理（一）質(zhì)譜的基本原理 質(zhì)譜分析法（質(zhì)譜分析法（MS）是指在一定條件下，將樣品分子電離成離子，然后通過(guò)測(cè)定這些離子的質(zhì)荷比（m/z）和強(qiáng)度來(lái)進(jìn)行定性和定量的一種分析方法。質(zhì)譜分析法的過(guò)程為：將樣品氣化并電離成帶電離子，然后通過(guò)一定方法將不同m/z的離子分開(kāi)，并測(cè)定其強(qiáng)度，繪出質(zhì)譜圖，對(duì)質(zhì)譜圖進(jìn)行分析可得到關(guān)于樣品分子結(jié)構(gòu)和定量方面的信息。39UB m v2 21F= Bzv F mRmv2Rm 離子源 S質(zhì)譜方程 ：zmURBm222離子檢測(cè)器圖7-5

18、質(zhì)譜儀的原理40 有機(jī)分子受到電子轟擊后，會(huì)斷裂形成不同的多種離子，以離子的質(zhì)荷比m/z為橫座標(biāo)，離子強(qiáng)度為縱坐標(biāo)作圖，得到的質(zhì)譜圖稱(chēng)為標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)譜圖標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)譜圖，也叫棒圖棒圖。 4110 0806040200204010 08060分子離子峰基峰相對(duì)強(qiáng)度（）質(zhì)荷比（m/z)圖7-6 質(zhì)譜棒圖42 完整的現(xiàn)代質(zhì)譜儀由完整的現(xiàn)代質(zhì)譜儀由進(jìn)樣系統(tǒng)進(jìn)樣系統(tǒng)、離子源離子源、質(zhì)量分析器質(zhì)量分析器、離子檢測(cè)離子檢測(cè)器器、數(shù)據(jù)處理數(shù)據(jù)處理及及控制系統(tǒng)控制系統(tǒng)五部分組成，此外還有一個(gè)保持質(zhì)譜儀高真五部分組成，此外還有一個(gè)保持質(zhì)譜儀高真空度的真空系統(tǒng)。空度的真空系統(tǒng)。離子源和質(zhì)量分析器離子源和質(zhì)量分析器是質(zhì)譜儀最重要

19、的兩個(gè)部件，是質(zhì)譜儀最重要的兩個(gè)部件，也是不同質(zhì)譜儀的主要差別所在。也是不同質(zhì)譜儀的主要差別所在。電噴霧質(zhì)譜（電噴霧質(zhì)譜（ESI）和和基質(zhì)輔助激基質(zhì)輔助激光解吸電離飛行時(shí)間質(zhì)譜（光解吸電離飛行時(shí)間質(zhì)譜（MALDI）為離子源的質(zhì)譜技術(shù)已廣泛應(yīng)用為離子源的質(zhì)譜技術(shù)已廣泛應(yīng)用于生物大分子研究，是蛋白質(zhì)組學(xué)研究中不可或缺的分析工具，因此于生物大分子研究，是蛋白質(zhì)組學(xué)研究中不可或缺的分析工具，因此被稱(chēng)為生物質(zhì)譜（被稱(chēng)為生物質(zhì)譜（BMS）。 進(jìn)樣進(jìn)樣系統(tǒng)系統(tǒng)離子源離子源質(zhì)量質(zhì)量分析器分析器檢測(cè)器檢測(cè)器數(shù)據(jù)采集數(shù)據(jù)采集及分析及分析真空系統(tǒng)真空系統(tǒng) （二）生物質(zhì)譜二）生物質(zhì)譜 43（三）蛋白質(zhì)的鑒定（三）蛋白

20、質(zhì)的鑒定 蛋白質(zhì)樣本經(jīng)2-DE分離后，需對(duì)蛋白斑點(diǎn)進(jìn)行鑒定，以確定其身份。利用獲得的蛋白質(zhì)斑點(diǎn)的各種屬性參數(shù)，在蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫(kù)中進(jìn)行檢索，尋找與這些參數(shù)相符合的蛋白質(zhì)。如果在數(shù)據(jù)庫(kù)中搜尋不到，可能為新蛋白質(zhì)，需用其它方法進(jìn)一步鑒定和研究。 44 蛋白質(zhì)組學(xué)研究需要有高通量的蛋白質(zhì)鑒定方法，MS技術(shù)能快速、準(zhǔn)確地獲得多種蛋白質(zhì)屬性參數(shù)，結(jié)合生物信息學(xué)工具，可迅速進(jìn)行蛋白質(zhì)的鑒定。因此，MS已成為蛋白質(zhì)組學(xué)研究中不可或缺的有力工具。下面介紹兩種應(yīng)用MS技術(shù)進(jìn)行蛋白質(zhì)鑒定的方法。 451、肽質(zhì)量指紋圖譜法、肽質(zhì)量指紋圖譜法 基本過(guò)程為：蛋白質(zhì)混合物樣品經(jīng)過(guò)2-DE分離后，從膠上切下需要鑒定的蛋白質(zhì)斑點(diǎn)

21、，用胰蛋白酶進(jìn)行水解，胰蛋白酶在特定位點(diǎn)切割蛋白質(zhì)，形成長(zhǎng)短不一的多肽混合物，用MALDI-TOF質(zhì)譜儀對(duì)多肽混合物進(jìn)行質(zhì)量分析，得到肽片段質(zhì)譜圖，一個(gè)質(zhì)譜峰代表一種肽片段離子。由于各種蛋白質(zhì)的一級(jí)結(jié)構(gòu)不同，胰酶水解后產(chǎn)生的肽片段數(shù)目及質(zhì)量均不相同，具有特征性，因此將得到的肽片段質(zhì)譜圖稱(chēng)為PMF。下圖為卵白蛋白PMF：46472、肽序列標(biāo)簽鑒定法、肽序列標(biāo)簽鑒定法 蛋白質(zhì)由20種氨基酸組成，在蛋白質(zhì)上隨意選取一個(gè)四肽序列，根據(jù)概率論計(jì)算，另一個(gè)蛋白質(zhì)上出現(xiàn)相同四肽序列的概率為1/204，即1/160,000，因此從理論上說(shuō)，只要測(cè)定一個(gè)蛋白質(zhì)中56個(gè)氨基酸殘基的序列，就足以作為鑒別蛋白質(zhì)的特異

22、性標(biāo)簽，稱(chēng)為肽序列標(biāo)簽。48四、蛋白質(zhì)相互作用的研究技術(shù) 蛋白質(zhì)功能的研究是一項(xiàng)艱難而又重要的工作，它是闡明生命現(xiàn)象本質(zhì)的必由之路。任何蛋白質(zhì)，不管它是酶、抗原、抗體，還是信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)分子，必須和其它蛋白質(zhì)分子（或非蛋白質(zhì)分子）在空間上相互接近，形成某種相互作用，才能發(fā)揮功能作用。因此，研究蛋白質(zhì)的相互作用對(duì)闡明其功能具有重要意義 。49酵母雙雜交技術(shù)酵母雙雜交技術(shù) 1、基本概念 酵母雙雜交技術(shù)酵母雙雜交技術(shù)(yeast two-hybrid system)是20世紀(jì)90年代初期發(fā)展出來(lái)的一種用于研究蛋白質(zhì)相互作用的方法手段，它利用酵母細(xì)胞內(nèi)的真核表達(dá)系統(tǒng)，將兩種外源蛋白質(zhì)的基因分別與酵母轉(zhuǎn)錄因子

23、的兩個(gè)功能結(jié)構(gòu)域融合，通過(guò)質(zhì)粒導(dǎo)入酵母細(xì)胞，以酵母細(xì)胞表型的改變作為外源蛋白是否發(fā)生相互作用的篩選標(biāo)志。502、基本原理、基本原理 酵母雙雜交系統(tǒng)酵母雙雜交系統(tǒng)利用真核生物轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子的組利用真核生物轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子的組件式結(jié)構(gòu)特征。件式結(jié)構(gòu)特征。這些蛋白質(zhì)往往由兩個(gè)或兩個(gè)以這些蛋白質(zhì)往往由兩個(gè)或兩個(gè)以上相互獨(dú)立的結(jié)構(gòu)域構(gòu)成。上相互獨(dú)立的結(jié)構(gòu)域構(gòu)成。 DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域（結(jié)合結(jié)構(gòu)域（DNA binding domain，BD）和轉(zhuǎn)錄激活結(jié)構(gòu)域（）和轉(zhuǎn)錄激活結(jié)構(gòu)域（activation domain，AD）是轉(zhuǎn)錄激活因子發(fā)揮功能所必須的。）是轉(zhuǎn)錄激活因子發(fā)揮功能所必須的。 單獨(dú)的單獨(dú)的BD能與特定基因

24、的啟動(dòng)區(qū)結(jié)合，但不能激活基因能與特定基因的啟動(dòng)區(qū)結(jié)合，但不能激活基因的轉(zhuǎn)錄。的轉(zhuǎn)錄。 而由不同轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子的而由不同轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子的BD和和AD所形成的雜合蛋白卻能所形成的雜合蛋白卻能行使激活轉(zhuǎn)錄的功能。行使激活轉(zhuǎn)錄的功能。51UASLacZ/His報(bào)告基因表達(dá)X外源基因 BDGAL4 DNA-BD外源基因GAL4 ADADDNA-BD 質(zhì)粒AD質(zhì)粒表達(dá)表達(dá)融合蛋白融合蛋白圖710 酵母雙雜交原理圖Y BDXYADYADRNA多聚酶 BDX523.3 3.3 蛋白質(zhì)組學(xué)的研究意義及應(yīng)用蛋白質(zhì)組學(xué)的研究意義及應(yīng)用3.3.1 蛋白質(zhì)組學(xué)的研究意義3.3.2 蛋白質(zhì)組學(xué)的應(yīng)用53研研 究究 意意 義義

25、DNA RNA 蛋白質(zhì)蛋白質(zhì)存在存在3個(gè)層次的調(diào)控個(gè)層次的調(diào)控轉(zhuǎn)錄水平調(diào)控轉(zhuǎn)錄水平調(diào)控翻譯水平調(diào)控翻譯水平調(diào)控翻譯后水平調(diào)控翻譯后水平調(diào)控蛋白質(zhì)存在復(fù)雜的翻譯后修飾，作為生命功能的行蛋白質(zhì)存在復(fù)雜的翻譯后修飾，作為生命功能的行使者，使者，它比基因更能直接地反映生理過(guò)程及其變化。它比基因更能直接地反映生理過(guò)程及其變化。蛋白質(zhì)相互作用及空間構(gòu)向等問(wèn)題是生命現(xiàn)象復(fù)雜蛋白質(zhì)相互作用及空間構(gòu)向等問(wèn)題是生命現(xiàn)象復(fù)雜性的真實(shí)體現(xiàn)性的真實(shí)體現(xiàn)。54l疾病的蛋白質(zhì)組研究疾病的蛋白質(zhì)組研究 l病原微生物的蛋白質(zhì)組研究病原微生物的蛋白質(zhì)組研究 l蛋白質(zhì)組在藥物開(kāi)發(fā)中的應(yīng)用蛋白質(zhì)組在藥物開(kāi)發(fā)中的應(yīng)用 3.3.2 3.3.2 蛋白質(zhì)組學(xué)的應(yīng)用蛋白質(zhì)組學(xué)的應(yīng)用551.疾病的蛋白質(zhì)組研究疾病的蛋白質(zhì)組研究 通過(guò)測(cè)定體液和組織的蛋白質(zhì)組通過(guò)測(cè)定體液和組織的蛋白質(zhì)組, 尋找特異疾病的生尋找特異疾病