1、細 胞 生 物 學 實驗課程教案（1）實驗題目 血涂片的制備及細胞大小的測量實驗學時3 實驗目的1. 掌握血涂片的制備方法2. 認識紅細胞及各種白細胞的典型形態3掌握顯微測微尺的使用方法實驗原理 將血液樣品制成單層細胞的涂片標本，經瑞氏染液染色后，不同白細胞中的顆粒可以呈現不同的顏色。堿性粒細胞的顆粒呈藍紫色，酸性粒細胞的顆粒呈橘紅色，中性粒細胞的顆粒呈粉紅色。根據細胞中顆粒的顏色、大小及多少，再結合細胞的大小及細胞核的形態，就可以將白細胞進行分類計數。實驗儀器顯微鏡、粗天平、載玻片、滴管、離心管、離心機、醫用一次性采血針、酒精棉球、鑷子、載玻片、目鏡測微尺和鏡臺測微尺等實驗材料雞血細胞實驗內

2、容與實施過程備 注1.血涂片的制備與血細胞的觀察（50分鐘）: 采血前用70酒精棉球消毒人的指腹采血推片：擠出第二滴血置于載玻片的右側再取另一張邊緣光滑的雙凹片，斜置于血滴的前緣，先向后稍移動輕輕觸及血滴，使血液沿玻片端展開成線狀兩玻片的角度以3045°為宜，輕輕將雙凹片向前勻速推進，即涂成血液薄膜染色：用天平稱取去皮的土豆塊莖2g+10mlPBS緩沖液，浸泡2h粗提液中含有可溶性土豆凝集素。2. 顯微測微尺的使用（35分鐘）：以無菌方法抽取雞血注射器中抽取3.8%檸檬酸鈉1ml抽取雞靜脈血液2ml，用生理鹽水洗5次，每次2000r/min，離心5min，最后按壓積紅細胞體積用生理鹽

3、水配成2%紅細胞液。3.細胞的觀察與討論（50分鐘）：淋巴細胞、白細胞、中性粒細胞、堿性粒細胞和酸性粒細胞4、實驗小結（15分鐘）：總結實驗過程中學生的操作是否規范；實驗是否成功，如果不成功，問題出在哪里；哪些實驗作得比較好。提醒預習下節課實驗內容，提問。共150分鐘。實驗作業1.繪制各種不同類型的血細胞,并說明它們的主要作用？2.任選20個紅細胞，測量其直徑，并計算出平均值. 。參考資料（含參考文獻、期刊、雜志等）實驗總結 對于涂片的厚度一定要掌握，不然太厚不方便觀察細胞，對于各種白細胞的染色一定要把握好，適度的染色可容易的區分開五種白細胞，并進行大小的測量和繪圖。細 胞 生 物 學 實驗課

4、程教案（2）實驗題目 細胞化學實驗實驗學時3 實驗目的 熟悉細胞脂類的顯示技術，了解其在細胞中的分布；學習區別定位細胞DNA、RNA的顯示方法實驗原理 （1）蘇木精為堿性染料染細胞核，蘇丹紅為偶氮脂溶性染料，可顯示細胞中的脂類的分布及量； （2）甲基綠與DNA雙螺旋外側的磷酸根基團結合力強，結合后阻止派洛寧從堿基之間插入。甲基綠與DNA的結合產物為綠色。派洛寧與RNA的結合力強，RNA結構較松散，派洛寧可以插入，從而中和磷酸基團，阻止甲基綠染色，派洛寧與RNA的結合物呈紅色，根據顏色的部位可以判斷DNA和RNA的定位并且判斷兩種核酸的相對含量。實驗儀器水浴鍋、冰凍切片機、載玻片等；實驗材料豬肝

5、、花生子葉實驗內容與實施過程備 注1. 脂類顯示（65分鐘）：用豬肝切片和花生的超薄切片，學習掌握使用冰凍切片機的操作技術，獲得理想的切片；2. 細胞中DNA和RNA的顯示（70分鐘）：材料選用豬肝印片，學習如何制備肝印片的片子，而后進行固定、浸洗、染色等即可顯示二者在細胞中的分布。3、實驗小結（15分鐘）：總結實驗過程中學生的操作是否規范；實驗是否成功，如果不成功，問題出在哪里；哪些實驗作得比較好。提醒預習下節課實驗內容，提問。共150分鐘。凝集素是一類含糖、并能與糖專一結合的蛋白質,被認為與糖的運輸、儲存物質的積累、細胞間的互作以及細胞分裂的調控有關。實驗作業細胞中脂類和核酸顯示的原理是什

6、么？參考資料（含參考文獻、期刊、雜志等）實驗總結植物材料兩種化學成分的顯示結果都比較好，但是豬肝的效果較差，這可能與切片的厚度有很大的關系，豬肝組織柔軟不像花生子葉好切。細 胞 生 物 學 實驗課程教案（3）實驗題目 細 胞 凝 集 反 應實驗學時3 實驗目的1. 學習制備土豆凝集素2. 掌握細胞凝集反應的實驗方法及細胞凝聚的原理。3. 觀察凝集的現象實驗原理 細胞質膜外表面的一層黏性多糖物質構成的細胞全委會被在細胞間的聯系和識別、細胞的生長分化、免疫反應及腫瘤發生等過程中發揮著重要作用。 動物細胞表面的糖蛋白、糖脂中的糖鏈伸向膜表面，它們是細胞識別、細胞免疫及細胞接觸抑制現象的必要組分。凝集

7、素是一類含糖的(少數例外)并能與糖專一性結合的蛋白質，它具有凝集細胞和刺激細胞分裂的作用。凝集使細胞凝集是由于它與細胞表面的糖分子連接，在細胞間形成“橋”的結果。凝集素與糖分子結合有一定的專一性和結合價，并與細胞膜上受體的分布有關。實驗儀器顯微鏡、粗天平、載玻片、滴管、離心管、離心機等實驗材料土豆塊莖、雞血細胞實驗內容與實施過程備 注1.凝集素粗提液制備（50分鐘）：用天平稱取去皮的土豆塊莖2g+10mlPBS緩沖液，浸泡2h粗提液中含有可溶性土豆凝集素。2.雞紅細胞懸液制備（35分鐘）：以無菌方法抽取雞血注射器中抽取3.8%檸檬酸鈉1ml抽取雞靜脈血液2ml，用生理鹽水洗5次，每次2000r

8、/min，離心5min，最后按壓積紅細胞體積用生理鹽水配成2%紅細胞液。3.細胞凝集反應現象的觀察與討論（50分鐘）：用滴管吸取土豆凝集素和2%紅細胞液各一滴，置載玻片上，充分混勻，靜置20min后于低倍顯微鏡下觀察血球凝集現象。本實驗過程很簡單，只需要將植物凝集素與紅細胞混合后用低倍顯微鏡觀察現象即可。具體如下：實驗組凝集素1滴紅細胞懸液1滴對照組PBS液1滴紅細胞懸液1滴4、實驗小結（15分鐘）：總結實驗過程中學生的操作是否規范；實驗是否成功，如果不成功，問題出在哪里；哪些實驗作得比較好。提醒預習下節課實驗內容，提問。共150分鐘。凝集素是一類含糖、并能與糖專一結合的蛋白質,被認為與糖的運

9、輸、儲存物質的積累、細胞間的互作以及細胞分裂的調控有關。實驗作業1.細胞間凝集的原理是什么？2.簡圖表示血細胞凝集原理。參考資料（含參考文獻、期刊、雜志等）實驗總結1.為什么對照組有PBS液作對照呢？沒什么巧，因為凝集素中本身含PBS緩沖液，當含本身凝集素是不含PBS的，只是因為本實驗中凝集素的提取時用到了PBS.2.那么紅細胞懸液是怎么制備的呢？其實也不難，無菌抽取動物靜脈血液，當然血液抽出來后肯定要先加抗凝劑了，然后再加生理鹽水。那么怎么從血液中將紅細胞分離出來呢？想想，血液中有血清、紅細胞、白細胞和血小板，按道理來講紅細胞應該最重吧(有待查證)，用離心機在2000r/min下離心5min

10、，去掉上清液，得到的應該就是紅細胞了，再加適量生理鹽水洗滌幾次后，加一定量是(按壓積紅細胞體積算)生理鹽水即可配成相應濃度的紅細胞懸液了。除了土豆中有凝集素外，還有韭菜葉片也有。凝集素使細胞凝集是因為它與細胞表面的糖分子連接,在細胞間形成“橋”的結果,加入與凝集素互補的糖可以抑制細胞發生凝集。大多數凝集素存在于儲藏器官中,作為一種氮源；對某些植物而言,受到危害時,凝集素作為一種防御蛋白發揮作用。細 胞 生 物 學 實驗課程教案（4）實驗題目 細胞膜的滲透性實驗學時3 實驗目的了解細胞膜的滲透性及各類物質進入細胞的速度。實驗原理細胞膜為一種半透膜，對物質的通透具有選擇性。當紅細胞放入低滲溶液中時

11、，細胞吸水膨脹而發生溶血。當紅細胞放入含不同溶質的等滲溶液中時，由于細胞膜對不同溶質的透性不同，細胞發生溶血的時間也會不同，故發生溶血現象時間長短可作為測量物質進入紅細胞速度的一種指標。實驗儀器離心機、移液槍、試管、試管架實驗材料雞血實驗內容與實施過程備 注1.雞血細胞懸液的制備：一份雞血+10份0.17mol/L氯化鈉，形成一種不透明的紅色液體，此即稀釋的雞血。2.低滲溶液：一支試管中，加入10ml蒸餾水+1ml稀釋的雞血，觀察溶液顏色的變化？3.雞紅細胞的滲透性觀察：在10種等滲溶液中觀察細胞溶血現象及時間。實驗作業將觀察到的現象列入下表，對實驗結果進行比較和分析。附表：不同低滲溶液下的溶

12、血現象。試管編號是否溶血時間結果分析1.10ml氯化鈉+1ml稀釋羊血2.10ml氯化銨+1ml稀釋羊血3.10ml醋酸銨+1ml稀釋羊血4.10ml硝酸鈉+1ml稀釋羊血5.10ml草酸銨+1ml稀釋羊血6.10ml硫酸鈉+1ml稀釋羊血7.10ml葡萄糖+1ml稀釋羊血8.10ml甘油+1ml稀釋羊血9.10ml乙醇+1ml稀釋羊血10.10ml丙酮+1ml稀釋羊血參考資料（含參考文獻、期刊、雜志等）實驗總結溶血時間及現象的觀察比較困難，可采用離心輔助的方法來判別雞血在哪些等滲液中最易溶血，哪些較慢，做一些定性的分析。經過離心之后，若上清液無色，證明在這個時間段血細胞沒發生溶血，若上清液略

13、紅，證明有溶血發生。當然這個方法不很精確，但卻快速、便于觀察。細 胞 生 物 學 實驗課程教案（5）實驗題目 線粒體和液泡系的超活染色與觀察實驗學時3 實驗目的 觀察動、植物活細胞內線粒體和液泡系的形態、數量及分布； 掌握細胞超活染色技術及原理； 學習一些細胞器的超活染色技術。實驗原理活體染色：應用無毒或毒性較小的染色劑真實地顯示活細胞內某些細胞結構而又很少影響細胞生命活動的染色方法。詹納斯綠B：詹納斯綠B能專一的對線粒體進行活體染色。線粒體中細胞色素氧化酶使染料保持氧化狀態，即有色狀態，呈藍綠色，而在周圍的細胞質中染料被還原，成為無色狀態中性紅：中性紅對高爾基體、液泡系的染色具有專一性。只將

14、活細胞中的液泡系當成紅色，細胞核與細胞質完全不著色(這可能與液泡系中某些蛋白質有關。實驗儀器顯微鏡、恒溫水浴鍋、解剖盤、剪刀、鑷子、雙面刀片、解剖盤載玻片、凹面載玻片、蓋玻片、表面皿、吸管、牙簽、吸水紙。 實驗材料人口腔上皮細胞、洋蔥、小麥種子或黃豆幼根根尖實驗內容與實施過程備 注1.人口腔粘膜上皮細胞線粒體的超活染色與觀察清潔載玻片放在37恒溫水浴鍋的金屬板上 滴2滴1/5000詹納斯綠B染液 用牙簽口腔頰粘膜處稍用力刮取上皮細胞 刮下的粘液狀物放大載玻片的染液滴中 染色10-l5min(注意不可使染液干燥，必要時可再加滴染液) 蓋上蓋玻片,顯微鏡下觀察 2. 植物細胞液泡系的超活染色與觀察

15、 取小麥種子發芽的根尖 用刀片縱切根尖 放入中性紅染液滴中，染色510min。 吸去染液，滴一滴Ringer液 蓋上蓋玻片進行鏡檢(鑷子輕輕地下壓蓋玻片，使根尖壓扁，利于觀察) 實驗結果：在高倍鏡下，先觀察根尖部分的生長點的細胞，可見細胞質中散在很多大小不等的染成玫瑰紅色的圓形小泡，這是初生的幼小液泡。然后，由生長點向延長區觀察，在一些已分化長大的細胞內，液泡的染色較淺，體積增大，數目變少。在成熟區細胞中，一般只有一個淡紅色的巨大液泡，占據細胞的絕大部分，將細胞核擠到細胞一側貼近細胞壁處。實驗作業（1）繪口腔上皮細胞示線粒體的形態與分布 （2）繪小麥根尖細胞示液泡的形態與分布 參考資料（含參考

16、文獻、期刊、雜志等）實驗總結人口腔上皮細胞的線粒體的超活染色與觀察效果很好，但是洋蔥表皮細胞和小麥根尖細胞的染色效果不是很理想。細 胞 生 物 學 實驗課程教案（6）實驗題目 葉綠體的分離與熒光觀察實驗學時3 實驗目的1.通過植物細胞葉綠體的分離，了解細胞器分離的一般原理和方法；2.觀察葉綠體的自發熒光和次生熒光，并熟悉熒光顯微鏡的使用方法。實驗原理組織勻漿后懸浮在等滲介質中進行差速離心，是分離細胞器的常用方法。一個顆粒在離心場中的沉降速率取決于顆粒的大小、形狀和密度，也同離心力以及懸浮介質的粘度有關。在一給定的離心場中，同一時間內，密度和大小不同的顆粒其沉降速率不同。依次增加離心力和離心時間

17、，就能夠使非均一懸浮液中的顆粒按其大小、密度先后分批沉降在離心管底部，分批收集即可獲得各種亞細胞組分。實驗儀器普通離心機、組織搗碎機、粗天平、熒光顯微鏡。燒杯2個, 250ml量筒1個, 滴管20支, 10ml刻度離心管20支, 試管架5個，紗布若干，無熒光載片和蓋片各4片。 實驗試劑 0.35mol/L氯化鈉溶液，0.01%吖啶橙(acridine orange)。實驗材料新鮮菠菜實驗內容與實施過程備 注（一）葉綠體的分離與觀察 1.選取新鮮的嫩菠菜葉，洗凈擦干后去除葉梗脈，稱30g于150ml 0.35mol/L NaCl溶液中，裝入組織搗碎機。 2. 利用組織搗碎機低速(5000r/mi

18、n)勻槳3-5min。 3. 將勻漿用6層紗布過濾于500ml燒杯中。 4. 取濾液4ml在1000r/min下離心2min，棄去沉淀。 5. 將上清液在3000r/min下離心5min。棄去上清液，沉淀即是葉綠體(混有部分細胞核)。 6. 將沉淀用0.35mol/LNaCl溶液懸浮。 7. 取葉綠體懸液一滴滴于載玻片上，加蓋玻片后即可在顯微鏡下觀察。在普通光鏡下觀察。在熒光顯微鏡下觀察。取葉綠體懸液一滴滴在無熒光載片上，再滴加一滴0.01%丫啶橙熒光染料，在熒光顯微鏡下觀察。（二）實驗結果：普通光鏡下，可看到葉綠體為綠色橄欖形，在高倍鏡下可看到葉綠體內部含有較深的綠色小顆粒，即基粒。在選用B

19、（blue）激發濾片的條件下，葉綠體發出火紅色熒光。加入丫啶橙后，葉綠體可發出橘紅色熒光，其中混有的細胞核則發綠色熒光。實驗作業1.在倒置顯微鏡相連的電腦軟件支配下，測量一下葉綠體的長軸和短軸，分別測量510個葉綠體，求其平均值。2.在分離葉綠體時應注意些什么問題？參考資料（含參考文獻、期刊、雜志等）實驗總結實驗結果非常理想，提醒學生們在使用熒光顯微鏡時應注意保護眼睛，避免紫外線的傷害。細 胞 生 物 學 實驗課程教案（7）實驗題目 細胞器的分離與觀察實驗學時3 實驗目的1.通過植物細胞葉綠體的分離，了解細胞器分離的一般原理和方法；2.觀察葉綠體的自發熒光和次生熒光，并熟悉熒光顯微鏡的使用方法

20、。實驗原理細胞由細胞膜、細胞核和細胞質組成，細胞質中含有若干細胞器和細胞骨架等，這些也稱作亞細胞組分。對于細胞的結構和功能的研究，是細胞生物學的基本課題，其重要的研究手段之一是分離純的亞細胞組分，觀察它們的結構或進行生化分析。分離亞細胞組分的方法主要有差速離心和密度梯度離心。差速離心（differential centrifugation）在密度均一的介質中由低速到高速逐級離心，用于分離不同大小的細胞和細胞器。速度逐漸提高，樣品按大小先后沉淀在差速離心中細胞器沉降的順序依次為：核、線粒體、溶酶體與過氧化物酶體、內質網與高基體、最后為核蛋白體。由于各種細胞器在大小和密度上相互重疊，而且某些慢沉降

21、顆粒常常被快沉降顆粒裹到沉淀塊中，一般重復23次效果會好一些。差速離心只用于分離密度和大小懸殊的細胞，更多用于分離細胞器。對于精細的分離，則是密度梯度離心效果更好。密度梯度離心（density gradient centrifugation）用一定的介質在離心管內形成一連續或不連續的密度梯度，將細胞混懸液或勻漿置于介質的頂部，通過重力或離心力場的作用使細胞分層、分離。這類分離又可分為速度沉降和等密度沉降平衡兩種。實驗儀器普通離心機、組織搗碎機、粗天平、熒光顯微鏡。燒杯2個, 250ml量筒1個, 滴管20支, 10ml刻度離心管20支, 試管架5個，紗布若干，無熒光載片和蓋片各4片。 實驗試劑

22、 0.35mol/L氯化鈉溶液實驗材料新鮮菠菜實驗內容與實施過程備 注（一）葉綠體的分離與觀察 1.選取新鮮的嫩菠菜葉，洗凈擦干后去除葉梗脈，稱30g于150ml 0.35mol/L NaCl溶液中，裝入組織搗碎機。 2. 利用組織搗碎機低速(5000r/min)勻槳3-5min。 3. 將勻漿用6層紗布過濾于500ml燒杯中。 4. 取濾液4ml在1000r/min下離心2min，棄去沉淀。 5. 將上清液在3000r/min下離心5min。棄去上清液，沉淀即是葉綠體(混有部分細胞核)。 6. 將沉淀用0.35mol/LNaCl溶液懸浮。 7. 取葉綠體懸液一滴滴于載玻片上，加蓋玻片后即可在

23、顯微鏡下觀察。在普通光鏡下觀察。在熒光顯微鏡下觀察。取葉綠體懸液一滴滴在無熒光載片上，再滴加一滴0.01%丫啶橙熒光染料，在熒光顯微鏡下觀察。（二）實驗結果：普通光鏡下，可看到葉綠體為綠色橄欖形，在高倍鏡下可看到葉綠體內部含有較深的綠色小顆粒，即基粒。在選用B（blue）激發濾片的條件下，葉綠體發出火紅色熒光。加入丫啶橙后，葉綠體可發出橘紅色熒光，其中混有的細胞核則發綠色熒光。實驗作業1.在倒置顯微鏡相連的電腦軟件支配下，測量一下葉綠體的長軸和短軸，分別測量510個葉綠體，求其平均值。2.在分離葉綠體時應注意些什么問題？參考資料（含參考文獻、期刊、雜志等）實驗總結實驗結果非常理想，提醒學生們在

24、使用熒光顯微鏡時應注意保護眼睛，避免紫外線的傷害。細 胞 生 物 學 實驗課程教案（7）實驗題目 植物原生質體的分離與培養實驗學時6 實驗目的原生質體是除去細胞壁的裸露細胞。在適宜的條件下，分離的原生質體能夠再生細胞壁，進行細胞分裂，并再生完整植株。通過實驗，掌握原生質體分離和培養的基本方法，并對培養結果進行觀察和分析。實驗原理植物原生質體是除去細胞壁后為原生質所包圍的“裸露細胞”，是開展基礎研究的理想材料。其中酶解法分離原生質體是一個常用的技術，其原理是植物細胞壁主要由纖維素、半纖維素和果膠質組成，因而使用纖維素酶、半纖維素酶和果膠酶能降解細胞壁成分，除去細胞壁而使原生質體釋放出來。原生質體

25、分離純化或融合后，在適當的培養基上應用合適的培養方法，能夠再生細胞壁，并啟動細胞持續分裂，直至形成細胞團，長成愈傷組織或胚狀體，再分化發育成苗。其中，選擇合適的培養基及培養方法是原生質體培養中最基礎也是最關鍵的環節。實驗儀器三角瓶、離心管、燒杯、200目不銹鋼濾網、解剖刀、長、短鑷子、培養皿、濾紙、0.2m濾膜、濾器、培養瓶（注：以上用品要進行高壓滅菌）、臺式離心機、高壓滅菌鍋、倒置顯微鏡、超靜工作臺實驗材料煙草幼苗的葉片、新鮮菠菜的葉實驗內容與實施過程備 注1、實驗原理的講解；（15分鐘）2、液體培養基的配制；（實驗前由教師完成）3、酶液的制備：（20分鐘）1纖維素酶、1果膠酶、0.6mol

26、/L甘露醇 、0.1%MES、0.05mol/LCaCl2·2H2O、 pH6.87.0 3、植物原生質體的分離和培養：（ 課內完成，150分鐘）取充分展開的嫩葉，用自來水沖洗干凈；將葉片在0.1%升汞溶液中浸泡滅菌10min，然后用無菌蒸餾水漂洗5次；用鑷子撕去葉的下表皮，然后將葉放有酶液的培養皿或帶蓋三角瓶，每10ml酶液放2g葉片；在2528黑暗條件下，酶解23h,用200目網過濾除去未完全消化的殘渣。在1000rpm條件下離心5分鐘，棄上清。加入3 4ml 0.2mol/LCaCl2·2H2O洗液，用注射器向離心管底部緩緩注入20蔗糖溶液6ml，在1000rpm條件

27、下離心510分鐘，由于密度梯度離心的作用，生活力強狀態好的原生質體漂浮在20的蔗糖與0.2mol/LCaCl2·2H2O之間，破碎的細胞殘渣沉入管底。用200l移液器輕輕將狀態好的原生質體吸出(注意盡可能不要吸入下層的蔗糖溶液)，放入另一干凈的離心管中加4ml 0.2mol/LCaCl2·2H2O懸浮，1000rpm離心25分鐘，棄上清將收集的原生質體懸浮在適量的DPD培養基中，用血球計數板調整原生質體密度為5×104/ml（請參考細胞計數）之間。用帶皮頭的移液管將原生質體懸液分裝在培養皿中，每皿放5ml。用石蠟膜帶封口。置26左右條件下進行暗培養。4、培養結果的

28、觀察（活力檢查，細胞壁再生的觀察，細胞分裂的觀察）。（在課外由教師指導學生進行）5、實驗小結：總結實驗過程中學生的操作是否規范。提醒預習下節課實驗內容，提問。（10分鐘）共195分鐘教學重點、難點重點：無菌操作；原生質體的分離和培養。難點：酶解去壁，原生質體培養方法的選擇實驗內容與實施過程備 注實驗的意義：植物原生質體融合和培養在理論和實踐上都有很大的意義，在植物遺傳工程和育種研究上具有廣闊的應用前景。它是植物同源、異源多倍體獲得的途徑之一，它不僅能克服遠緣雜交有性不親和障礙，也可克眼傳統的通過有性雜交誘導多倍體植株的麻煩，最終將野生種的遠緣基因導入栽培種中，原生質體融合技術可望成為作物改良的

29、有力工具之一。      植物原生質體培養方法起源于植物單細胞的培養方法。1954年，植物單細胞培養才獲得成功。Mllir 培養的萬壽菊及煙草懸浮細胞植入到長有愈傷組織的培養基上得到了它們的單細胞克隆，并建立了看護培養的方法；1960年Jones等建立了微室培養法。同年，Cocking應用酶法分離原生質獲得成功，從而在實驗條件下很容易獲得大量的原生質體。隨著多種適用于原生質體分離的商品酶的出現，原生質體的培養方法也得到了不斷地改進，現在常用的原生質體培養方法有：液體淺層培養法、雙層培養法、瓊脂糖包埋法、瓊脂島培養法以及使用條件培養基或飼喂培養等。實驗作業

30、1酶解液及原生質體起始培養基中，為何要保持較高滲透壓？2.如何判斷分離原生質體的活力和新壁再生？參考資料（含參考文獻、期刊、雜志等）實驗總結將原生質體培養分化過程進行顯微攝影，并分析結果。以植物根、莖、葉、葉柄作為原生質體的分離材料,經過分離收集在一定條件下才能培養獲得完整的原生質體,原生質體培養基的滲透壓應與酶液的滲透壓相等.細 胞 生 物 學 實驗課程教案（8）實驗題目 動物血細胞的電融合技術實驗學時3 實驗目的動物的游離細胞以及植物成微生物去壁后的原生質體，在電刺激下進行細胞融合，且融合率高、無毒性，操作簡便及融合后的細胞繼續培養成活率高等優點，是細胞工程手段的又一進展。本實驗使學生在了

31、解電融合原理的基礎上，學會掌握各種細胞懸液的制備及電融合過程的操作。實驗原理制備的游離細胞或原生質體，置于電融合室中，在高頻交流電場的作用下，細胞被極化，成為偶極子，造成細胞之間相互連接，如果施加的高頻交流電壓(即正弦波的p-p值)過高或作用時間過長，則細胞連接成串珠狀，應適當控制以上條件，盡量使兩細胞處于點接觸狀態，然后施加方波脈沖予以刺激，由于電脈沖的瞬間作用，可擊破兩細胞接觸點部位的質膜，此時質膜的脂類分子發生重組，同時由于細胞表面的張力作用，使兩細胞融合逐步完全。 動物的游離細胞在電刺激下可進行細胞融合，且具有融合率高、無毒性、操作簡便及融合后的細胞繼續培養成活率高等特點，是

32、細胞工程手段的又一進展。實驗儀器CRY-3型細胞融合儀、細胞融合池、倒置顯微鏡、刻度離心管、移液槍、血細胞計數板、實驗材料雞 的 紅 細 胞實驗內容與實施過程備 注（一）動物血細胞的制備1.用滅菌的注射器先吸入Alsver液(葡萄糖2.05g，枸椽酸鈉0.88，NaCl0.42g，加重蒸水至100mil）lml，再從雞的翼下靜脈取血0.5-1ml，取出后放入刻度離心管中，再加入2-3ml Alsver液，使總量為4-5ml，混勻并封口，置于4冰箱內可供一周內使用；2.實驗時取貯備的雞血細胞lml，加入4ml0.85生理鹽水，混勻后以1200r/min離心5min，去上清液后，最后用0.6mol

33、/L的甘露醇液(或0.6mol/L蔗糖溶液)混勻后以上述離心條件洗滌兩次，最后用0.6mol/L的甘露醇液將雞細胞稀釋并調整成每毫升含2×105個。如采用傳代培養的骨髓或腹水瘤細胞，可先用0.9的生理鹽水洗滌兩次，離心速度為800-1000r/min，每次5min，再用0.6mol/L的甘露醇或蔗糖液洗滌兩次，每次600-800r/min，離心5min，最后用甘露醇調整成每毫升含瘤細胞1×105個。（二）細胞電融合 1.介紹CRY-3型細胞融合儀的結構和使用方法； 2.電融合操作：用移液管吸取0.1ml調整好的血細胞懸液于融合小室中，將融合池置于倒置顯微鏡載物臺上，并將兩電

34、極的輸出端與儀器的輸出電纜接通，然后用低倍鏡找出融合室中央兩電極間的焦面，此時可觀察到血細胞呈平均分布狀態，互不接觸；開啟電源，此時可根據實驗需要，將正弦額度選擇在11.3MHz，脈沖寬度為0.1ms，脈沖電壓為250V，脈沖頻率為1次/s，并依次按下各標定按鍵，最后調整成串交流電壓(即正弦幅度)旋扭，使電壓表處于10-15V處，待細胞成串相接觸后，按下脈沖觸發按鈕，此時電融合結束，關閉電源。實驗結果：在倒置顯微鏡下可觀察到由同種細胞融合形成的細胞，稱為同核體 (homokaryons)，利用不同親本的不同細胞彼此融合所形成的細胞，稱為異核體 (heterokaryons)，還可觀察到3個以上

35、細胞融合在一起的合胞體。細胞融合率系指在顯微鏡的視野內，已發生融合的細胞其細胞核總數與該視野內所有細胞(包括已融合的細胞)的細胞核總數之比，稱為融合率，通常以百分比表示，而且要進行多個視野測定，再加以平均統計，更為準確。電融合發展于20世紀80年代，是使細胞在電場中成為偶極子，沿電力線排布成串，再利用高強度、短時程的電脈沖擊破細胞膜，膜的脂類分子發生重排，由于表面張力作用，兩細胞發生融合。實驗作業1. 繪圖表示所觀察到的融合細胞。2. 請寫出細胞電融合的注意事項。參考資料（含參考文獻、期刊、雜志等）實驗總結思考題：1、說明細胞電融合的原理2、在細胞電融合中，設對細胞產生可逆性電擊穿的總能量為Q

36、，如何理解各項電參數之間及其與Q值的關系?實驗結果不是很理想，融合率低。原因可能有一下幾點：動物細胞的膜結構比原生質體具有更大的電刺激耐受性，要造成細胞接觸點處的膜擊穿，需要適當加大各種電融合參數。此外還可在細胞懸液中加入鏈霉蛋白酶，可改變細胞膜結構，并增強膜活性。影響細胞電融合因素：一、用于供原生質體或動物細胞懸浮的介質，必須滿足兩個條件：一是為了保持細胞的生物活性，使融合后的細胞能繼續存活，并通過培養能繼續分裂和分化，其介質要求與細胞本身具有等滲性；二是為了保證融合之前所施加的各項電參數充分發揮作用，其介質應具有高純度的非離子溶液，如果在溶液中存在Na+、 K+、Ca2+等金屬離子或Cl離

37、子，將使介質的導電性增加，當施加脈沖波刺激時，據報導，其總能量Q將通過離子的傳導作用損失80以上，而直接通過細胞，用于擊穿膜接觸點使其細胞融合的能量僅占1020%，當有離子存在并使電脈沖能量高度損失的情況下，將不能保證細胞進行融合。在介質中有金屬離子存在，當施加高頻正弦波電場時，不能將細胞極化成偶極子，從而不能使細胞間相互接觸和連接，更談不上細胞間相互融合。為了解決以上存在的問題，一是采用高純度的蒸餾水(三蒸水或四蒸水)來配制介質，二是選用適當的非電介質溶質如甘露醇、山梨醉或蔗糖等來配制供細胞懸浮的等滲溶液，另外，在清洗電融合室時，以要以高純度的蒸餾水用毛筆擦凈。細 胞 生 物 學 實驗課程教案（9）實驗題目 利用PEG為媒介物進行動物血細胞融合實驗學時3 實驗目的掌握利用聚乙二醇為介導物對各類細胞的融合方法實驗原理聚乙二醇分子能改變各類細胞的腆結構，使兩細胞接觸點處質膜的脂類分子發生疏散和重組，由于兩細胞接口處雙分子層質膜的相互親和以及彼此的表面張力作用，使細胞發生融合。實驗儀器離心機