1、.新獸藥特殊毒性試驗技術要求  限于國內現有條件，經研究確定新獸藥特殊毒性試驗（“三致試驗”）一般只進行致突變試驗和致畸試驗。在致突發試驗中，考慮到檢測終點應有原核細胞和真核細胞，基因突變和染色體畸變，體內和體外試驗系統，體細胞和生殖細胞之分，確定Ames試驗和微核試驗為必做試驗。精子畸形、睪丸精原細胞染色體畸變、顯性致死三者可以任選一項，若前二者任一項為陽性均必做顯性致死試驗。這樣，在致突變試驗中必須至少做三項試驗。在致畸試驗中，對一般獸藥來說，傳統致畸試驗為必做試驗；對飼料藥物添加劑還應增加養致畸試驗，喂養繁殖毒性試驗。喂養繁殖毒性試驗一般只做一代繁殖毒性，一代為陽性時應再做第二

2、代繁殖毒性，即：各項試驗方法如后：一、艾母氏（Ames）試驗方法1、菌種組氨酸營養缺陷型鼠傷寒沙門氏菌TA97a、TA98、TA100、TA102四個標準株。2、菌種鑒定以上菌種需分別作抗氨芐、抗四環素、抗紫外、結晶紫、組氨酸需求、自發回變數的鑒定。3、劑量分組每次試驗要求45個劑量組，每個劑量做三個平行平皿。高劑量以不抑菌為原則。液態受檢物的劑量從0.0550l/皿之間選擇，固態受檢物從0.11000.0g/皿之間選擇，最高劑量可達5000.0g/皿。選定后的劑量應配制成適當濃度，使每皿加入受檢物的體積為100l或200l。4、溶劑一般以水為溶劑，選用其他溶劑需說明理由。5、對照物每次檢測要

3、求同時作陽性和陰性對照；用已知的陽性物作陽性對照，用溶劑作陰性對照。加S9混合液時要同時作不加S9混合液的對照平皿。6、S9制備選體重200克左右成年雄性大鼠，經誘導劑誘導后宰殺，處死前12小時禁食。在低溫條件下，無菌操作取出肝臟，用KCI液淋洗后置勻漿器中制成勻漿。低溫離心后分裝，保存于液氮或-80冰箱中。制得的S9需作S9活力測定。7、試驗步驟將經鑒定合格的TA97a、TA98、TA100和TA102菌株分別接種于增菌培養液中。37水浴振蕩培養，每毫升活菌數不得少于12×109。受檢物，包括對照物，按設計劑量配制。取受檢物0.10.2ml，菌液0.1ml，S9混合液0.5ml或磷

4、酸緩沖液0.5ml，依次加入無菌小試管中，37水浴振蕩培養20分鐘后（也可采用平板摻入法），加入45頂層培養基2.0ml，混勻倒入含底層培養基的平皿上，37培養48小時。8、結果評價在計數菌落前應先觀察背景菌苔的生長情況，正常的背景菌苔應呈均勻的砂粒狀。受試組與陰性對照組的背景菌苔應一致，陰性對照組的自發回數應在正常值之內。受試組的菌落數大于2倍自發回變數，并有劑量反應關系和重現性，判為誘變陽性。二、微核試驗1、動物選擇成年健康小鼠（應注明品系），將小鼠隨機分為受試組和對照組。每組動物數不少于10只（雌、雄各半）或至少6只雄性動物。2、受試物的處理將受試物溶于適宜的溶劑中，以0.10.2ml/

5、10g體重的給藥體積配制成適當的濃度。3、給藥方式原則上采用與推薦臨床使用相同的給藥途徑，內服時應用灌胃法。給藥劑量以LD50為依據，設3個劑量組。高劑量組應出現毒性反應，一般可采用LD50的0.80.5；低劑量組的給藥量為LD50的0.050.10。每次試驗應同時設陰性對照組和陽性對照組，陽性對照物可選用已知的能誘發微核陽性的誘變劑。、試驗操作一次給藥一般在24，48，72小時取樣制片。或二次給藥，從第二次給藥后的6，24小時取樣制片。處死小鼠取骨髓，將骨髓洗入離心管中，離心。常規涂片。姬姆薩染色，鏡檢。5、鏡檢采用雙盲法計數分析，每只小鼠在同一張片子上計數1000個嗜多染紅細胞，同時計數嗜

6、多染紅細胞（PCE）同正染紅細胞（NCE）之比。必要時，亦可采用吖啶橙染色，熒光顯微鏡分析計數。6、結果評價將數據列表，分別列出嗜多染紅細胞數，微核數及PCE/NCE之比。所得結果用t檢驗進行數據分析，經重復試驗P<0.01并有劑量反應關系時，判為陽性。三、哺乳動物培養細胞染色體畸變試驗、細胞采用中國倉鼠卵巢細胞系CHO，染色體數目21。或中國倉鼠肺細胞系CHL，染色體數目25。2、細胞培養使用MEN-Eagles培養基或1640培養基，配制完全培養液，加15滅活的小牛血清，100IU/ml青霉素，調節PH7.27.4。進行常規單層細胞培養。在細胞處于指數生長期時用胰酶-EDTA液處理，

7、并自培養瓶表面將細胞洗脫下來。計數每毫升培養液含有的細胞數。在含有10ml培養液的25cm2的培養瓶中加25×105個細胞。在37，濕度95%，5%CO2培養箱中培養過夜。3、試驗分組與劑量試驗分3個受試組，另設陰性和陽性對照組。高劑量組以50%細胞生長抑制濃度為準，否則應說明理由。低劑量組接近于陰性對照組細胞成活率。各組均需有加S9和不加S9試驗。4、試驗操作向經過夜培養的培養瓶中依次加入S9，受試物或對照物。培養1822小時。在細胞收獲前24小時，加秋水仙素，使最終濃度為每毫升培養液0.1g，胰酶洗脫后加入含小牛血清的培養液終止胰蛋白酶的作用。0.075mol氯化鉀溶液低滲處理，

8、甲醇：冰醋酸液固定，離心，取混勻沉淀舞常規制片，姬母薩染色。鏡檢分析。5、結果評價采用雙盲法鏡檢分析。每個劑量組的兩個培養物至少各分析100個中期相細胞。將數據列表，分別列出數目畸變和結構畸變數，所得結果用t檢驗進行數據分析。經重復試驗P<0.01，并有劑量反應關系時為染色體畸變陽性。四、顯性致死試驗1、動物一般用大白鼠，也可用小白鼠。為保證試驗結果的重現性，應用近交系或近交系之間雜交的F1代。雌、雄鼠不能來自同一雜交群。所有試驗動物都應達到性成熟，雌鼠應未交配過。2、劑量應設三個劑量組，一個陽性和一個陰性對照組。每組用雄鼠10只。高劑量應導致毒性癥狀，明顯降低繁殖率，約為LD50的1/

9、10。低劑量為LD50的1/100。3、給藥方式原則上采用與推薦臨床使用相同的給藥途徑，內服時應用灌胃法。受試物應連續給藥5天，每天一次。4、交配方法在最后一次給藥的當天，將雄鼠與雌鼠按1：2同籠，第5天取出雌鼠，間隔2天后再防入新的雌鼠。如此需要連續812周（大鼠）或68周（小鼠）。查出陰栓的當天為妊娠第0天，未查出者以同籠第4天為妊娠第0天。5、胎仔檢查雌鼠必須在妊娠后第13天（大鼠）或第12天（小鼠）處死，剖腹，檢查兩側子宮角的著床數，早期死胎，晚期死胎及活胎數。每制雌鼠分別記錄。6、結果評價以顯性致死率DL（%）表示。試驗組妊娠鼠的平均生存胎仔數DL（%）= ×100%陰性對

10、照組妊娠鼠的平均生存胎仔數如果死亡胎仔數增加，胚胎著床數減少，未著床胚胎數增加，生存胎仔總數減少，這些結果具有統計學意義并有劑量反應關系時記為陽性顯性致死反應。五、精子畸形試驗1、動物選用810周齡成年雄性小鼠（注明品系來源）。標本采集時每組動物為5只。2、劑量與分組試驗組至少設高、中、低3種劑量，同時設陰性和陽性對照組。高劑量組的總劑量為42LD50；低劑量組的總劑量為0.51LD50。3、給藥方式原則上采用與推薦臨床使用相同的給藥途徑，內服時應用灌胃法。每天給藥一次，連續5天。4、制片于第一次給藥后35天，將小鼠處死，取出兩側附睪，在生理鹽水中剪碎，攪拌、過濾；常規涂片，甲醇固定，伊紅染色

11、。5、鏡檢高倍鏡下每只小鼠檢查完整的精子200500個，每一劑量組至少檢查1000個精子，查看精子畸形數及畸形類型。6、結果評價將試驗組的精子畸形百分率與對照組作統計學處理，經重復試驗P<0.01，并有劑量反應關系時，判為陽性。六、繁殖試驗1、動物一般選斷乳大鼠，也可用家兔，所用動物應注明品系。2、劑量與分組試驗設3個劑量組，1個空白對照組。高劑量應使親代動物出現輕微中毒（不能有死亡）；低劑量應不引起可觀察到的毒性作用。也可按亞慢性試驗的劑量給予受試物。大鼠每組雌鼠20只，雄鼠10只。家兔每組雌雄各12只。3、給藥方式混飼或飲水。4、試驗操作大鼠斷乳后開始飼喂含受試物的飼料或飲水，90天

12、后，各試驗組大鼠按雌雄2：1同籠2周，進行交配，然后自然分娩（此間仍飼喂含受試物飼料）。每周稱飼料和體重各一次，觀察母性行為及是否出現中毒癥狀。親代動物處死后可對其生殖系統進行肉眼或病理組織學檢查。分娩后，應盡快檢查每窩活仔數，外觀畸形和發育情況，每窩選留8只（最好雌、雄各半），期于淘汰。于出生后第5日和第21日稱重，第21日斷乳（此時親代可全部處死）。仔鼠斷乳后，每組隨機取雌雄各10只，雌雄分養，用基礎飼料飼喂6090天，觀察指標同親代。（建議本試驗結合亞慢性試驗進行）。5、結果與處理試驗可得出4個繁殖機能指標：妊娠雌性動物數受孕率= ×100%交配雌性動物數正常分娩雌性動物數妊娠

13、率= ×100%妊娠雌性動物數出生第5天活仔數出生存活率= ×100%出生時活仔數第21天斷乳活仔數哺育存活率= ×100%出生后第5天活仔數試驗結果可用X2檢驗進行統計處理。6、結果評價根據統計結果的顯著（P<0.01）與否以及是否存在劑量反應關系，評價受試物對試驗動物繁殖機能的影響。七、喂養致畸試驗1、動物選擇性成熟的動物，一般用大鼠，每組雌鼠20只以上，雄鼠10以上，注明品系。2、劑量采用三個劑量組和一個空白對照組，最高劑量應理想地誘發毒性反應，但在親代動物中不出現死亡，中劑量應引起最小的毒性反應，而低劑量不應引起任何可觀察到的不良反應。3、給藥時期交

14、配前雄性動物連續給藥60天以上，雌性動物連續給藥14天以上，雌性動物在受孕后繼續給藥14天。4、給藥方式混飼或飲水。5、檢查同傳統致畸試驗，給藥的雄鼠及末交配上的雄鼠均作剖檢，必要時進行病理學組織學檢查。6、結果評價數據混總列表，用方差分析或X2方檢驗進行分析及評價。八、傳統致畸試驗1、動物健康大白鼠，雌鼠日齡為7085天，無孕、未生育，體重200300克，雄鼠日齡不小于70天，體重250克以上。注明品系，每組1220只孕鼠。2、劑量高、中、低三種劑量，并另設陰性及陽性對照組。高劑量可使母體產生中毒癥狀但不使母鼠的死亡率高于10%，低劑量應不引起母鼠有可觀察到的中毒癥狀；在高低劑量組之間按等比

15、級差設立中劑量組，中劑量可引起某些母體中毒以及胚胎毒性癥狀。3、給藥時期胚胎器官形成期（715天）。4、給藥方式原則上與推薦臨床應用的給藥方式相同，內服時應用灌胃法。5、檢查將雌雄動物同籠交配過夜后，檢查交配成功與否，將已受孕的雄鼠取出標明日期，隨機分至各劑量組。各劑量組在給藥后每隔3天稱體重一次，根據體重變化隨時調整劑量，并掌握孕鼠的妊娠和胚胎的發育情況，全部動物在分娩前12天剖檢，觀察妊娠的確立，有無死胎和吸收胎及子宮內活胎的發育情況。（1）活胎鼠的外觀檢查：區別性別，分別稱體重，測身長、尾長，用肉眼進行外部畸形檢查。分別檢查頭部、面部、軀干、四肢、尾部等有無畸形。（2）胎鼠的內臟檢查：將

16、每窩1/2的胎鼠經鮑音氏液固定后，用簡單的徒手切片法對胎鼠內臟進行檢查。頭部器官通過下列、切面進行觀察檢查：用單面刀片徒手沿口經耳作一水平切面，使上、下腭分開，主要檢查有無腭裂，舌缺失或分叉。將上述切面切下的顱頂部沿眼球前垂直作額狀切面，檢查鼻道有無畸形。沿眼球正中垂直作第二額狀切面，檢查眼球有無畸形。沿眼球后緣作第三個額狀切面，檢查腦的畸形。胸腔、腹腔和骨盆腔器官的檢查：沿胸、腹壁中線和肋下緣水平切開胸、腹腔，逐步檢查各主要臟器的位置、數目、大小及形狀等有無異常。（3）胎鼠骨骼檢查：將剩余的活胎制成的骨骼透明染色標本于放大鏡或解剖鏡下進行檢查。主要觀察顱骨、枕骨、頸椎骨、胸內、肋骨、腰椎、四肢骨、尾椎骨等發育及畸形情況。6、結果評價將數據匯總成表，用方差分析或X2檢驗進行分析及評價。九、小鼠睪丸精原細胞染色體畸變試驗1、動物性成熟雄性小鼠，每組5只。2、劑量與分組試驗至少設三