1、破譯密碼的實驗研究的發展破譯密碼的實驗研究先后由三個實驗逐步發展了四種破譯方法，于1965年完成。體外實驗折疊1）在體外無細胞蛋白質合成體系中加入人工合成的polyu開創了破譯遺傳密碼的先河。自1961年發現mrna后，許多實驗室開始在無細胞蛋白質合成系統中加入mrna,去研究蛋 白質生物合成過程，并表明加入idrna能刺激無細胞系統中蛋白質合成。1961年，美國nih 的nirenberg和mathaoi,設想:即然mrna有刺激無細胞系統中的蛋白質合成作用,加入 人工合成的多聚核昔酸亦將會有這種促進作用。按此設想，他們合成了 polyu作為模板，以 觀察無細胞系統中蛋白質合成速率。因為在反

2、應體系中加入高驅2+濃度，可有利于if （起 始因子）的作用和fmet-trnanet的形成，從而保證肽鏈合成的起始不mrna的適當信號。 當把翻譯產物分離、純化和做序列分析后，結果出乎意料，合成的肽鏈中的氨基酸殘基全部 是苯丙氨酸，即polypheo于是第一次確認了 uuu是phc的密碼子。這樣，就在一個偶然的 機會開創了破譯密碼的工作。隨后，他們又以polya和polyc為模板，證明了分別可指導合 成polylys和polypro,即確定了 am是lys的密碼子，ccc是pro的密碼子。但是類似的 實驗不能證明ggg是何種氨基酸的密碼子，因為polyg產生牢固的氫鍵結合，形成三股螺旋, 而

3、不與核糠體結合。混合共聚物堿基配對折疊2）混合共聚物（mixed copolymers）實驗對密碼子中堿基組成的測定：1963年，speyer 和ochoa等發展了用兩個堿基的共聚物破譯密碼的方法。例如，以a和c原料，合成polyaco poly ac含有8種不同的密碼子:ccc、cca、caa、aaa、aac、acc、aca和cac。各種密碼子 占的比例隨著a和c的不同而不同，例如當a和c的比例等于5： 1吋，aaa： aac的比例=5 x 5x5： 5x5x1=125： 25。依次類推。實驗顯示ac共聚物作模板翻譯出的肽鏈由六種氨 基酸組成，它們是asp, his, thr, pro,和l

4、ys,其屮pro和lys的密碼子早先已證明分別 是ccc和am。根據共聚物成份不同的比例和翻譯產物中氨基酸比例亦不同的關系，speyer 等確定了 asp、glu和thr的密碼子含2alc;iiis的密碼子含la2c;thr的密碼子也可以含 la2c;pro為3c或la2c;lys為3a。但上述方法不能確定a和c的排列方式，而只能顯示密 碼子中堿基組成及組成比例。例如，asp, glu和thr的2a1c可能有三種排列方式,即a ac、 aca、caao此外，通過反復改變共聚物成份比例的方法亦十分麻煩和費時。aa-trxa與確定的三核昔酸序列結合折疊正當speyer等人按上述2）方法奮力時，ni

5、renberg和leder于1964年建立了破譯密碼的 新方法，即trna與確定密碼子結合實驗。該方法利用了如下事實：即是在缺乏蛋白質合成 所需的因子的條件下，特界氨基酸-tra （aa-trna）也能與核糖體-mrna復合物結合。最重 要的是這種結合并不一定需要反的mrna分子，而三核昔酸實際上就可以與核糖體結合。例 如，當polyu與核糖體混合時，僅有phe-trna （苯丙氨酰-trna）與之結合;相應地pro-trna（脯氨酰-trna）特異地與polyc結合。還有guu可促進val-trna （纏氨酰-trna）結合，uug促進leu-trna （亮氨酰-trna）結合等。雖然所有6

6、4個三核昔酸（密碼子）都可按設想 的序列合成，但并不是全部密碼子均能以這種方法決定因為有一些三核昔酸序列與核糖體結 合并不象uuu或guu等那樣有效，以致不能確定它們是否能為特異的氨基酸編碼。用重復共聚物破譯密碼折證3）用重復共聚物（repeating copolymers）破譯密碼：幾乎在上述nirenberg和leder工作的同時,nishimura, jones,和khorana等人應用有機 化學和酶學技術，制備了已知的核昔酸重復序列。蛋白質在核糖體上的合成可以在這些有規 律的共聚物的任一點開始，并把特異的氨基酸參入肽鏈。例如，重復序列cucucucucu是多肽leu-ser-leu-s

7、er或者是多肽ser-leu-ser的信使分子.使用共聚物構成三核背酸為單位的重復順序，如（mg） n,它可合成三種類型的多肽：polylys、polyarg 和polyglu,即aag是lys的密碼子，aga是arg的密碼子，gaa是glu的密碼子。又如（auc） n序列是polyile polyser和polyhis的模板。如此至1965年破譯了所有氨基酸的密碼子。 遺傳學的第二套密碼系統折疊遺傳學的第二套密碼系統（the second genetic code）以上所述存在于mrna中的遺傳密碼稱為經典密碼系統或第一套密碼系統。以下所要討論的 笫二套密碼系統，蘊含于trna分子中，這是自

8、1988年5月份以來在分子生物學領域引人注 目的新進展。1）第二套密碼系統的實驗證據一trna分子上某些（個）堿基對能決定trna的特異性。早 在70年代初，一些實驗室就觀察到酪氨酸trna （trnatyr）琥珀抑制子在氨基酸接受柄上 的突變能使trnatyr錯誤地攜帶谷氨酸（glu）。同樣，cua琥珀抑制反密碼子也能引起其它 一些trna誤被谷酰化。其后的大約十年，有關方面的實驗證據少有報道。1984年，prather 等發現突變的賴氨酸trna（trnalys）不僅保留對lys的特異性，而且也能攜帶丙氨酸（ala） 或甘氨酸（gly）。這個突變的誤義抑制子trnalys是在氨基酸接受柄螺

9、旋區的g3 c70被g3 u70堿基對所取代。更為直接的證據是二年前notmanly等的實驗顯示，取代亮氨酸trna(trnaleu)屮的12個堿基(無反密碼子堿基的取代)，能夠使trnaleu轉變為絲氨酸trna(trnaser)o rfl此可見，反密碼子在決定trna的特異性并非是唯一的關鍵。又比如，琥珀 型抑制性半胱氨酸trna (trnacys)苯丙氨酸trna (trnaphe)和丙氨酸trna (trnaala), 其反密碼子均是cua,然而它們卻攜帶不同的氨基酸。特別是近來美國麻省理工學院的hou 和schimmel的實驗證明，用其它堿基或堿基對(見下述)取代e。colitrna

10、ala的氨基酸接 受柄上單個堿基對g3 u70,能夠使該trna失去負載ala的功能;進一步將g3 u70引入trnacys 或trnaphe,亦可予二者攜帶ab的功能。他們主要采用上述三種琥珀型抑制性trna在二 蛍尿卩密噪柄(d柄)，反密碼柄、twc柄、氨基酸柄和氨基酸接受柄等部位進行單個或多個 堿基突變，然后檢測宿主e. col 1ftp3689的表型抑制作用。發現在總共36種不同突變的trna 屮只有在氨基酸接受柄上a3, c70和c6g7c66g67c70三種突變具有清楚的sup-表型(即這 種宿主e. coly在二天內不生長)，而這三種突變共同都有原來的堿基對g3 u70堿基對的改

11、 變。顯而易見，trnaala氨基酸接受柄上g3 u70單個堿基對決定著ala的特異性。本文作 者也觀察到：只有在多胺下，哺乳動物(大鼠、牛)肝異亮氨酸trna (trnaile)才能負載 ileo通過測定trnaile序列證明它的氨基酸接受柄的g5 g69堿基不配對。多胺(精胺)通 過在此處的橋接，穩定了 tknalle的空間構象，從而使trnaile氨基酸酰化。換言z,即 g5 g69對trnatle負載可能有決定性作用。2) 笫二套密碼系統的概念和特征根據上述hou和schimmel等人的工作，christiandeduve提出了第二套密碼系統的概念或 學說。該學說認為：trna氨基酸接

12、受柄有一輔密碼區(paracodon reg ion),可以被氨基酰 trna合成酶(aars)識別，并決定trna的特異性。他認為第二套密碼系統蘊含于aars結 構中作者將第二套密碼系統的特征描述為：1與經典密碼系統不同。輔密碼子密碼系統或 笫二套密碼系統是非簡并性的(nondrgenerate)0可能只有20種aars,每種爼ars能夠識 別特異于某種氨基酸的所有trna,這種識別與該種特異trna的不同特征有關。2第二套 密碼系統比經典的密碼系統對氨基酸更具有決左性，這與密碼子和相應的氨基酸間的立體化 學相互反應有關。認為輔密碼僅與酶-氨基酰-腺昔酸(aars-aa-amp)發生一個非常

13、簡單的 反應，而trna則起著刪除錯誤氨基酰的作用。3第二套密碼系統比經典的密碼系統更原始。 一些作者猜測trna起源于攜帶氨昔酰的寡核芹酸，其原始形式能與氨基酸直接反應。3) 對第二密碼系統的思考上文提到的hou和schimmel的丁.作，是christiandeduve提出第二套密碼系統概念的主要 依據。在hou和schinunel的論文屮，只認為在氨基酸柄上的三種突變(a3, c70和 c6g7c66g67c70）,由于都有原堿基對g3 u70改變，抑制了 trnaala的正常負載，沒有觀察 到由其它部位突變所產生的影響。tra的其它部位對輔密碼子區特異性功能的發揮可能具 有協助作用。因

14、為單依靠trna分子的單個堿基對決定其負載的特異性，這不僅尚未得到用 其它trna大量實驗證實，而在理論上造成trna氨基酰化錯誤機率增高，相應使遺傳變異的 危險性加大。不論是經典的密碼系統或第二套密碼系統的表達均需aarso aars與trm倒l 型構象的內側結構（包括氨基酸接受臂和柄，d反密碼和環）結合。然而，己有的結論認為 與aars相接觸的trna部位對aarsr的識別作用是非必需的。至今己發表的trna序列（除 個別低等的生物的外），幾乎都含76或77個堿基，其中15或16個位點是保守性的（conserved position）即固定地在所有trna中存在。這些位點是：u8, a14, g18, g19, a21, u33, g53, t54, 3, c56, a58, u60, c61,和3'末端的c75, c76, a77。其它61個部位在不同來源和 不同trna中是可變的（variable position） trna上61個可變堿基與mrna中含的61個有 意義密碼子達到巧合。然而，deduve認為第二套密碼系統存在于aars結構中，并假定僅僅是輔密碼子與 aars-aa-amp或aa-aars復合物的一個簡單反應。酶是一種蛋白質，而蛋白質怎么能作為攜 帶遺傳信息的載體呢?a