1、實驗三 細(xì)菌的革蘭氏染色及芽孢染色法 （一）實驗?zāi)康模海ㄒ唬嶒災(zāi)康模簄1、學(xué)習(xí)并掌握革蘭氏染色法和芽孢染色法。 n2、鞏固顯微鏡油鏡的使用技術(shù)。（二）實驗原理：（二）實驗原理：n1、革蘭氏染色原理：n革蘭氏染色法是1884年由丹麥病理學(xué)c.gram所創(chuàng)立的。革蘭氏染色法可將所有的細(xì)菌區(qū)分為革蘭氏陽性菌（g+）和革蘭氏陰性菌（g）兩大類，是細(xì)菌學(xué)上最常用的鑒別染色法。n該染色法所以能將細(xì)菌分為g+菌和g菌，是由這兩類菌的細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)和成分的不同所決定的。g菌的細(xì)胞壁中含有較多易被乙醇溶解的類脂質(zhì)，而且肽聚糖層較薄、交聯(lián)度低，故用乙醇或丙酮脫色時溶解了類脂質(zhì)，增加了細(xì)胞壁的通透性，使初染的結(jié)晶紫和

2、碘的復(fù)合物易于滲出，結(jié)果細(xì)菌就被脫色，再經(jīng)蕃紅復(fù)染后就成紅色。g+菌細(xì)胞壁中肽聚糖層厚且交聯(lián)度高，類脂質(zhì)含量少，經(jīng)脫色劑處理后反而使肽聚糖層的孔徑縮小，通透性降低，因此細(xì)菌仍保留初染時的顏色。2、芽胞染色法原理芽胞染色法原理：n細(xì)菌的芽胞具有厚而致密的壁，透性低，不易著色，若用一般染色法只能使菌體著色而芽胞不著色（芽胞呈無色透明狀）。芽胞染色法就是根據(jù)芽胞既難以染色而一旦染上色后又難以脫色這一特點而設(shè)計的。所有的芽胞染色法都基于同一個原則：除了用著色力強(qiáng)的染料外，還需要加熱，以促進(jìn)芽胞著色。當(dāng)染芽胞時，菌體也會著色，然后水洗，芽胞染上的顏色難以滲出，而菌體會脫色。然后用對比度強(qiáng)的染料對菌體復(fù)染

3、，使菌體和芽胞呈現(xiàn)出不同的顏色，因而能更明顯地襯托出芽胞，便于觀察。（三）實驗器材（三）實驗器材n1、活材料：n革蘭氏染色：培養(yǎng)12h-16h枯草桿菌（bacillus subtilis）和培養(yǎng)24h大腸桿菌（escherichia coli）n芽孢染色：培養(yǎng)36 小時 的蘇云金桿菌（bacillus thuringiensis）或者枯草桿菌（bacillus subtilis）n2、染色液和試劑：n革蘭氏染色染色液：結(jié)晶紫、盧哥氏碘液、95%酒精、蕃紅；n芽孢染色液：5%孔雀綠水溶液、0.5%蕃紅水溶液 ；n二甲苯、香柏油 。n3、器材：n載玻片、接種杯、木夾子、酒精燈、擦鏡紙、顯微鏡。（四

4、）實驗步驟（四）實驗步驟n1、革蘭氏染色：n（1）涂片：涂片方法與簡單染色涂片相同。n（2）干燥：與簡單染色法相同n（3）固定，與簡單染色法相同n（4）初染：加適量（以蓋滿細(xì)菌涂面）結(jié)晶紫染色液染色1-2分鐘n（5）水洗：傾去染色液，用水小心地沖洗n（6）媒染：滴加盧哥氏碘液，媒染1minn（7）水洗：用水洗去碘液。n（8）脫色：將玻片傾斜，連續(xù)滴加95%乙醇脫色2025s至流出液無色，立即水洗。n（9）復(fù)染：滴加蕃紅復(fù)染2min。n（10）水洗：用水洗去涂片上的蕃紅染色液。n（11）干燥：將染好的涂片放空氣中晾干或者用吸水紙吸干。n（12）鏡檢：鏡檢時先用低倍，再用高倍，最后用油鏡觀察，并判

5、斷菌體的革蘭氏染色反應(yīng)性。2、schaeffer與fulton氏芽孢染色法n（1）涂片：按常規(guī)方法將待檢細(xì)菌制成一薄的涂片。n（2）干燥：與簡單染色法相同n（3）固定，與簡單染色法相同n（4）染色：加5%孔雀綠水溶液于涂片處（染料以鋪滿涂片為度），然后用木夾子夾住涂片一端，用酒精燈火焰加熱至染液冒蒸汽時開始計算時間，約維持5min。加熱過程中要隨時添加染色液，切勿讓標(biāo)本干涸。（加熱時溫度不能太高）。n（5）水洗：待玻片冷卻后 ，用水輕輕地沖洗，直至流出的水中無染色液為止。n（6）復(fù)染：用蕃紅液染色2min。n（7）水洗：n（8）干燥：n（9）鏡檢：先低倍，再高倍，最后在油鏡下觀察芽胞和菌體的形

6、態(tài)。n結(jié)果：芽胞呈綠色，菌體為紅色。3、芽孢染色（1）制備菌懸液，1-2滴 (2) 染色，2-3滴孔雀石綠，沸水15-20min(3)涂片，自然干燥，火焰固定(4)脫色（水洗）：輕輕沖洗，自然干燥(5)復(fù)染，番紅2-3min(6)水洗(7)鏡檢n（10）實驗完畢后的處理：n將浸過油的鏡頭按下述方法擦拭干凈，a.先用擦鏡紙將油鏡頭上的油擦去。b.用擦鏡紙沾少許二甲苯將鏡頭擦23次。c.再用干凈的擦鏡紙將鏡頭擦23次。注意擦鏡頭時向一個方向擦拭。n看后的染色玻片用廢紙將香柏油擦干凈。（五）實驗報告（五）實驗報告n1、給出bacillus thuringiensis和escherichia coli

7、的形態(tài)圖，并注明兩菌的革蘭氏染色的反應(yīng)性。n2. 當(dāng)你對一株未知菌進(jìn)行革蘭氏染色時，怎樣能確證你的染色技術(shù)操作正確，結(jié)果可靠？ n3.繪圖說明你所觀察的枯草芽孢桿菌菌體形態(tài)，芽孢的形態(tài)及著生位置。它們各呈什么顏色。n4.若涂片中觀察到的只是大量游離芽孢，很少看到芽孢囊和營養(yǎng)細(xì)胞，你認(rèn)為這是什么原因？ （六）注意事項（六）注意事項n1、革蘭氏染色革蘭氏染色注意事項注意事項n（1）革蘭氏染色成敗的關(guān)鍵是酒精脫色。如脫色過度，革蘭氏陽性菌也可被脫色而染成陰性菌；如脫色時間過短，革蘭氏陰性菌也會被染成革蘭氏陽性菌。脫色時間的長短還受涂片厚薄及乙醇用量多少等因素的影響，難以嚴(yán)格規(guī)定。n（2）染色過程中勿使染色液干涸。用水沖洗后，應(yīng)吸去玻片上的殘水，以免染色液被稀釋而影響染色效果。n（3）選用幼齡的細(xì)菌。g+菌培養(yǎng)12h-16h，e.coli培養(yǎng)24h。若菌