1、1/5冰凍切片制作方法與注意事項1、固定：固定即借助化學試劑是組織和細胞屮的有機和無機成分凝固或 沉淀，停止發生死后組織變化，盡量保持其活體狀態的過程。固定的方法有浸泡固定法，注射、灌注固定法，蒸汽固定法，本 實驗用的是注射、關注固定法：某些組織塊由于體積過大或固定液極難流入內部或需要對整個 臟器或整個動物進行固定，就可采用灌注或灌流固定法。固定時 將固定液直接注入動物的血管，經血管分支到達整個組織或全身, 從二十只得到充分固定。固定液分為單純固定液和混合固定液。單純固定液有甲醛、乙醇、 氯化汞、醋酸、苦味酸等，混合固定液包括Bouin液、Zenker液、 Carnoy液、屮性甲醛液等。本實驗

2、用的固定液為4%甲醛（10% 福爾馬林）。固定后的處理：用水配制的固定液固定后應用流水沖洗，可是組織屮的固定液隨 時溢出和隨時洗去。對小動物和腦組織等，應以浸泡為主，即能 達到沖洗的目的，又不損害組織。【注意事項】1固定要及時。2 組織塊的大小要合適。3應有足夠的固定液，一般與組織塊的比例為20:1,容器勿過小， 組織勿過多。4固定時間要合適，甲醛固定液一般固定兩天左右，第一天要更 換一次固定液。2/55要進行促使固定，在固定期間輕輕地攪動組織或搖動容器使組 織移動有利于固定液的滲透，適當提高溫度也可縮短固定時間。6.選擇合適的固定液。7次取材數量過多時，應對取材部位和順序進行編號，并及時 做

3、好記錄。二、脫水脫水就是用某些溶劑逐步將組織塊內的水分置換出來的過程，使 用的試劑稱為脫水劑。脫水劑有非石蠟溶劑的脫水劑如乙醇、丙 酮等，和脫水兼石蠟的脫水劑如正丁醇等。本實驗所用的是乙醇脫水。乙醇是最常用的脫水劑，其優點是脫 水能力強，即能與水相混合，又能與透明劑相混，并可使組織硬 化，便于切片。缺點是穿透組織的速度快，且容易使組織收縮、 變脆。為克服這一缺點，在一般脫水屮，應采用循序漸進的方法， 逐步升級，經一系列不同濃度的乙醇，使組織屮的水分逐漸被乙 醇代替。脫水時間視組織塊大小、性質和類型而定。【注意事項】1 脫水必須徹底，組織塊只有脫水充分才能在透明劑屮有良好的 透明，也有利于染色。

4、脫水須在有蓋子的瓶中進行，高濃度乙醇易吸收空氣中的水 分。2脫水劑的用量不能太少，應為組織塊的570倍以上，并及時 更換。三、透明在切片制作過程屮有兩次透明，第一次是脫水以后組織塊的透明, 第二次是染色以后切片的透明。二甲苯是最常用的透明劑。它是 一種無色透明的液體，容易揮發，透其明能力強，但易使組織收 縮變脆，所以組織塊在二甲苯中不宜久留。3/5【注意事項】1 透明劑的用量不能太少，應為組織塊的570倍以上。2透明過程中用的器材如銀子必須干燥，不得將水滴入二甲苯屮。3二甲苯是一種易揮發的有毒氣體，長期接觸對呼吸道粘膜等有 刺激作用，所以在使用時應在盛二甲苯的容器上加蓋蓋子。四、組織切片（冰凍

5、切片法）操作程序：1切片前先安裝好刀片，調整好切片厚度及切片角度。根據標本 的組織類型，確定最佳切片溫度。2將待切的組織塊平放在軟塑瓶蓋或特質小盆內，直接或涂敷包 埋劑后馬上放到冷凍臺上冷凍。3 將凍好的組織塊安裝到組織塊夾持器上，調整好刀片與組織塊 Z間的角度和距離，調整好防卷板的位置和角度。4準備好后，轉動切片機旋轉輪的手柄進行切片。將切好的切片 黏附在載玻片上，室溫下自然晾干1-2小時后可根據不同的需要 進行固定、染色等制片步驟，也可用錫紙包好后封存于20C攝氏 度冰箱中待用。【注意事項】1 切片時恒冷箱內的適宜溫度是-2015攝氏度。2為防止組織屮形成冰晶而影響細胞的形態，甚至破壞細胞

6、的結 構，在組織冰凍時要采用速凍的方法。3組織塊在冰凍時，應根據組織的形狀和結構來放，切片也是如 此。4切片時，若發現冰凍過度，可將冰凍組織塊取出在室溫下放置 片刻再切片。4/5五、染色（HE染色）（一）染色試劑配制1 蘇木精染液是常用的一種燃料，主要用于對細胞核的染色。蘇 木精本身與組織的親和力很弱，HE染色實際是通過蘇木精的氧化物一 蘇木紅對組織細胞進行染色。蘇木精可通過自然和化學方法兩種方式氧化成蘇木紅。自然方法是將蘇木精溶液爆率在陽光下或空 氣屮。化學方法是將化學氧化劑加入蘇木精溶液。Harrisxx精配方:A液（蘇木精lg,無水乙醇10ml）, B液（鉀明磯20g,蒸餡水200ml）

7、,氧化汞05g,冰醋酸8ml。配制方法：想將A液攪拌溶解，再將B液煮沸融化去火。將A液緩緩加入B 液，混合后煮沸約1分鐘。離火后在該混合液中加入氯化汞，用 玻璃棒充分攪拌至染液變為紫紅色，冷卻后加入冰醋酸混勻，過 濾后即可使用。2伊紅染液伊紅是一種煤焦油染料，是細胞質較為想的染色劑。 常用的是1%伊紅醇溶液。其配方是在95%乙醇100ml屮加入lg 伊紅，玻璃棒攪拌均勻。3.1%鹽酸酒精分化液36%38%的鹽酸lml加入75%乙醇99ml屮 混勻即可。（二）染色過程1.切片進入蘇木精染液5-30min （根據不同需要和顏色情況決定 染色時間）。2.自來水洗去浮色。5/53. 1%鹽酸酒精分化數秒。4.自來水沖洗半小時以上，是切片藍化。5.蒸鐳水洗。6.如伊紅染液復染110分鐘，使細胞質染成紅色。7.按順序經95%乙醇？、中脫水兼分化伊紅顏色各lmin。8.入無水乙醇中徹底脫水45min （?、各兩分鐘左右）。9.二甲苯（無水乙醇：二甲苯=1:1） Imino10二甲苯?、透明，每次各約2-3mino封固切片（三）染色結果細胞核被蘇木精