1、第八章 高效液相色譜法（High Performance Liquid Chromatograph）第一節 概述（ Generalization ）以高壓液體為流動相的液相色譜分析法稱高效液相色譜法（HPLC ）。 HPLC 是 20 世紀 70 年代初發展起來的一種新的色譜分離分析技術。具有分離效能高、選擇性好、靈敏度高、分析速度快、適 用范圍廣（樣品不需氣化，只需制成溶液即可）的特點，適用于高沸點、熱不穩定有機及生化試樣的 分離分析。HPLC 基本方法是用高壓泵將具有一定極性的單一溶劑或不同比例的混合溶劑泵入裝有填充劑的 色譜柱，經進樣閥注入的樣品被流動相帶入色譜柱內進行分離后依次進入檢測

2、器，由記錄儀、或數據 處理系統記錄色譜信號再進行數據處理而得到分析結果。高效液相色譜法按固定相不同可分為液液色譜法和液固色譜法；按色譜原理不同可分為分配 色譜法（液液色譜）和吸附色譜法（液固色譜）等。目前，化學鍵合相色譜應用最為廣泛，它是 在液液色譜法的基礎上發展起來的。 將固定液的官能團鍵合在載體上， 形成的固定相稱為化學鍵合 相，具有固定液不易流失的特點， 一般認為有分配與吸附兩種功能， 常以分配作用為主。 C18（ODS ） 是最常使用的化學鍵合相。根據固定相與流動相極性的不同，液 - 液色譜法又可分為正相色譜法和反相色譜法，當流動相的 極性小于固定相的極性時稱正相色譜法， 主要用于極性

3、物質的分離分析； 當流動相的極性大于固定相 的極性時稱反相色譜法，主要用于非極性物質或中等極性物質的分離分析。中國藥典中有 50 種中成藥的定量分析采用 HPLC 法，在中藥制劑分析中，大多采用反相鍵 合相色譜法。一、高效液相色譜法的特點目前經典 LC 主要用于制備，若用于分析則采用脫機或非連續檢測。經典 LC 填料缺陷，通常是 填料粒度大、 范圍寬、 不規則， 不易填充均勻， 擴散和傳質阻力大， 譜帶展寬加大。 它存在致命弱點： 速度慢、效率低和靈敏度低。 HPLC 填料（高效固定相）顆粒細、直徑范圍窄、能承受高壓。達到傳 質阻力小，分離效率高。早期 HPLC 的固定相用涂漬的方法制備，液膜

4、厚度df 大，這和 GC 一樣，會大大降低色譜柱的柱效。現代 HPLC 填料大多采用鍵合固定相，其固定相膜很薄，因而大大提高了 柱效。高效固定相會帶來什么新問題呢？使用高效填料帶來兩個新問題：一是柱流動阻力大大增大， 因此需要采用高壓泵輸液；二是表面能很大，要采用專業的裝柱技術。高效液相色譜法是在氣相色譜和經典液相色譜的基礎上發展起來的。現代液相色譜和經典液相色 譜沒有本質的區別。不同點僅僅是現代液相色譜比經典液相色譜有較高的效率和實現了自動化操作。 高效液相色譜的原理與經典液相色譜相同， 但是它采用了高效色譜柱、 高壓輸液泵和高靈敏度檢測器。 因此，高效液相色譜的分離效率、分析速度和靈敏度大

5、大提高。定量準確，達到可與 GC 相媲美的分 離分析性能。特別是結合計算機技術， HPLC 已成為高度自動化和智能化的現代分析儀器。經典的液相色譜法， 流動相在常壓下輸送， 所用的固定相柱效低， 分析周期長，例如柱長170 cm, 柱內徑0.9 cm,流動相速度30 cm 3/h，約需20多小時才能分離出20種氨氨基酸；而用高效液相色 譜法,只需 1 小時之內就完成。而現代液相色譜法引用了氣相色譜的理論,流動相改為高壓輸送,色 譜柱是以特殊的方法用小粒徑的填料（幾微米至幾十微米）填充而成,均勻、規則的固定相,傳質阻 力小，分離效率高。柱效大大高于經典液相色譜（每米塔板數可達幾萬或 100 幾十

6、萬），同時柱后連 有高靈敏度的檢測器，使分析靈敏度比經典色譜有較大提高。例如，用紫外檢測器最小檢測限可達到 10 -9 g ，而熒光檢測器則可達到 10 -11g。雖然氣相色譜法是一種很好的分離、分析方法，它具有分析速度快、分離效能好和靈敏度高等優 點。但是氣相色譜僅能分析在操作溫度下能汽化而不分解的物質。據估計，在已知化合物中能直接進 行氣相色譜分析的化合物約占 15 ，加上制成衍生物的化合物， 也不過 20 左右。 由于大量有機物、 離子型化合物易受熱分解或失活物質不能用 GC 分析，因此需要發展 HPLC 。對于高沸點化合物；難 揮發及熱不穩定的化合物、離子型化合物及高聚物等， 很難用氣

7、相色譜法分析。 為解決這個問題， 70 年代初發展了高效液相色譜。由于高效液相色譜法具有以上特點， 它適于分離、 分析沸點高、 熱穩定性差、 分子量大 （大于 400 ） 的氣相色譜法不能或不易分析的許多有機物和一些無機物，而這些物質占化合物總數的 75-80% 。因 此它已廣泛用于核酸、蛋白質、氨基酸、維生素、糖類、脂類、甾類化合物、激素、生物堿、稠環芳 烴、高聚物、金屬螯合物、金屬有機化合物以及多種無機鹽類的分離和分析。但是，高效液相色譜的 固定相的分離效率、檢測器的檢測范圍以及靈敏度等方面，目前還不如氣相色譜法。此外對于氣體和 易揮發物質的分析方面也遠不如氣相色譜法， 因此高效液相色譜法

8、和氣相色譜法配合使用可互相取長 補短，相輔相成。二、高效液相色譜法與氣相色譜法比較HPLC 的保留值等色譜分析有關術語以及分配系數、分配比、塔板高度、分離度、選擇性等方面 均與氣相色譜相一致；高效液相色譜所用基本理論：塔板理論與速率理論也與氣相色譜一致。因液相 色譜以液體代替氣相色譜中的氣體作流動相，則速率方程H=A+B/u + Cu 式中：縱向擴散項（分子擴散項） B/u 對板高的影響與氣相色譜不同，由于液相色譜中組分分子在流動相中的擴散系數僅為氣 相色譜中的萬分之一， 因此縱向擴散項對板高的影響可以忽略不計。 于是影響液相色譜的主要因素是 傳質項Cu。氣相色譜（GC）的流動相流速u增大時，

9、板高 H顯著增大（即柱效顯著降低），而液 相色譜（LC）的流速增大時，板高增大不顯著（即柱效降低不顯著）。這說明高效液相色譜也有很高 的分離效能。 HPLC 可分離分析高極性、高分子量和離子型的各種物質 。柱效很高，每米可達 3 萬 塊以上，一般用 20 - 25cm 長的柱子，由于固定相的不斷改進，最短的只有 3cm ，理論板數可達 3000-4000 ，能滿足一般分析的需要，而且具有很高的分析速度。柱子短，對壓力要求就低。過去 高壓，現在追求高精度、高穩定性，一般在室溫下操作，樣品不需預處理，操作方便，容易掌握。液相色譜與氣相色譜有一定差別，主要有以下幾方面：（一）應用范圍不同 液相色譜非

10、常適合分子量較大、難氣化、不易揮發或對熱敏感的物質、離子型化合物及高聚物的分離分析，大約占有機物的7080%。（二）流動相不同氣相色譜的流動相載氣是色譜惰性的永久性氣體， 不參與分配平衡過程， 與樣品分子無親和作用， 樣品分子只與固定相相互作用。 而在液相色譜中流動相是各種低沸點有機溶劑及水溶液。也參與樣品分子相互作用，因此液相色譜流動相的作用比氣相色譜大。氣相色譜的載氣僅數種，其性質差別也不 大，對分離效果影響也不大。而液相色譜的流動相種類多，性質差別也大，對分離效果影響顯著。因 對于 LC 來說，流動相的選擇很重要，為提高選擇性增加了一個因素。液相色譜也可選用不同比例的 兩種或兩種以上的液

11、體作流動相，增大分離的選擇性。第八章 - 1 -（三）液相色譜分離類型多，如離子交換色譜和排阻色譜。液相色譜能完成難度較高的分離工作。就其分離機理的不同， 高效液相色譜可分為液-固吸附色譜、液-液分配色譜、離子交換色譜和凝膠滲透色譜等多種類型。液一固色譜的色譜柱內填充固體吸附劑，由于不同組分具有不同的吸附能力，因此，流動相帶著被測組分經過色譜柱時，各組分被分 開。液一液色譜的流動相和固定相都是液體。作為固定相的液體涂在惰性擔體上，流動相與固定液不互溶。當帶有被測組分的流動相進入色譜柱時，組分在兩相間很快達分配平衡，由于各組分在兩相間 分配系數不同而彼此分離。以非極性溶液作流動相，極性物質作固定

12、相的液一液色譜叫正相色譜；極性溶液作流動相，非極性物質作固定相的液一液色譜叫反相色譜。離子交換色譜的色譜柱內填充離子交換樹脂，依靠樣品離子交換能力的差別實現分離。而凝膠色譜是按試樣中分子大小的不同來進行分離的。在上述四類色譜中，應用最廣泛的是液一液色譜。液相色譜作為分析時選擇余地大，而氣相色 譜達不到。（四）氣相色譜一般都在較高的溫度下進行分離分析，而液相色譜通常在室溫條件下操作。（五）柱外效應：由于液體的擴散性比氣體的小 105倍，因此，溶質在液相中的傳質速率慢，HPLC的柱外效應就顯得特別重要；而在氣相色譜中，柱外區域擴張可以忽略不計。（六）制備:液相色譜不僅可用于分離分析，還可用于制備純

13、樣品。液相色譜的餾分比氣相色譜 易于收集。回收樣品也比較容易，而且回收是定量的，適合于大量制備樣品。便于為紅外、核磁等方 法確定化合物結構提供純樣品。（七）檢測器等：液相色譜尚缺乏高靈敏度、通用型的檢測器，液相色譜柱子昂貴，要消耗大量 溶劑，液相色譜儀器比較復雜，操作嚴格。價格也較氣相色譜儀昂貴，主是因為采用了高壓泵。在實際應用中，這兩種色譜技術是互相補充的。表8-1 HPLC與GC的比較HPLCGC進樣方式樣品制成溶液樣品需加熱氣化流動相流動相可分為離子型、極性、非極性、溶液，可與被分析樣品發生相互作用，能改變分離的選擇性。是氣體，不與被分析樣品發生相 互作用。固定相分離類型多，如吸附色譜、

14、分配色譜、離子交換色譜、排阻色譜、親和色譜等，可供選擇的固定相 種類繁多。分離類型有吸附色譜、分配色 譜，可供選擇的固定相種類較 多。檢測器通用型檢測器： UVD , PDAD , FID , ECD 選擇性檢測器：ELSD , RID通用型檢測器：TCD , FID 選擇性檢測器：ECD , FPD ,NPD應用范圍可分析高沸點，高分子有機化合物；離子型無機化 合物；熱不穩定，具有生物活性的生物分子。可分析低分子量、低沸點有機化 合物；永久性氣體；配合裂解技 術可分析高聚物。三、高效液相色譜法的主要類型高效液相色譜法的主要分離類型有液-固色譜法（吸附色譜法）；液-液分配色譜法；化學鍵合相色譜

15、法；離子交換色譜法；凝膠色譜法（體積排阻色譜法）。其他色譜類型有：親合色譜法（affinity第八章-11 -chromatography(AC) )；手性色譜法(chiralchromatography(CC) )； chromatography(MC) ); 電色譜法(electrochromatography(EC) )。第二節高效液相色譜基本理論膠束色譜法(micellar高效液相色譜的基本理論和定性定量分析方法與氣相色譜基本相同。 程的許多基本關系式，絕大部分適用于高效液相色譜法。在氣相色譜法中表達分離過保留值基本關系式t R=t R +t M保留時間是樣品從進入色譜柱到流出色譜柱所

16、需要的時間，不同的物質在不同的色譜柱上以不 同的流動相洗脫會有不同的保留時間，因此保留時間是色譜分析法的重要參數。保留時間由物質在色譜中的分配系數決定：tR=t M (1+KVs/V M)= t M (1+K/ ?)= t M (1+ k)(8-2)?=V M/Vs(8-3)k=K/ ?= (t R-tM)/ t M(8-4)(8-1)式中tR表示某物質的保留時間，tM是色譜系統的死時間，即流動相進入色譜柱到流出色譜柱的時間，這個時間由色譜柱的孔隙、流動相的流速等因素決定。(8-2)式中K為分配系數，Vs、Vm表示固定相和流動相的體積，？為相比率。k為溶質在色譜柱中分離后的容量因子。k是決定組

17、分保留的關鍵數值，在HPLC中，測k值不像GC中那么容易，因為要找到一種完全不被保留的組分來測死時間是非常困難的，現在常用的方法 是：在吸附色譜中，使用比流動相極性更弱的溶劑作為樣品；在分配色譜中，使用重水( 樣品。總之，在液相色譜中死時間的測定是一個既重要，又沒有完全解決的問題。(8-1)D20 )作為t R(2) V R(2)2/1t R(1)IV R(1)(8-5)(8-5)式中|為分離因子，表示在相同的條件下，兩個相鄰組分的調整保留值之比, 譜柱分離的選項擇性。表征了色柱效基本關系式理論板數t R 2t R 2n %)554(兀)(8-6)理論板高(8-7)有效板數嚴5 4|制(8-8

18、)有效板高(8-9)基于熱力學的塔板理論是色譜學的基礎理論，塔板理論將色譜柱看作一個分餾塔，待分離組分在分餾塔的塔板間移動，在每一個塔板內組分分子在固定相和流動相之間形成平衡，隨著流動相的流動，組分分子不斷從一個塔板移動到下一個塔板，并不斷形成新的平衡。一個色譜柱的塔板數越多，則其 分離效果就越好。根據流出曲線方程人們定義色譜柱的理論塔板高度為單位柱長度的色譜峰方差：H=L/u = o2理論塔板高度H越低，在單位長度色譜柱中就有越高的塔板數，則分離效果就越好。決定理論塔板高 度的因素有：固定相的材質、色譜柱的填充物的均勻程度、流動相的理化性質以及流動相的流速等。塔板理論是基于熱力學近似的理論，

19、在真實的色譜柱中并不存在一片片相互隔離的塔板，也不能完全滿足塔板理論的前提假設。如塔板理論認為物質組分能夠迅速在流動相和固定相之間建立平衡， 還認為物質組分在沿色譜柱前進時沒有徑向擴散，這些都是不符合色譜柱實際情況的，因此塔板理論雖然能很好地解釋色譜峰的峰型、峰高，客觀地評價色譜柱效，卻不能很好地解釋與動力學過程相關 的一些現象，如色譜峰峰型的變形、理論塔板數與流動相流速的關系等。三、相鄰組分分離度的基本關系式(8-10)分離度還可表示為A 4空訓丿(為十1 (8-11)(8-12)f/t - 16 RHIL(8-14)理論板數可表示為、iTj心+1 n -1W_1I J保留時間可表示為=(l

20、+k)=4(l+k)=l(l+k)(8-13)式中，u為流動相平均線速度，表示流動相沿色譜柱軸向移動的平均線速度，單位為cm/s。式(8-14)表明，tR是分離度R、相鄰組分的分離因子、組分的容量因子k、色譜柱的理論板fy高H和流動相平均線速度 U等因素的函數。其中 K和 與色譜過程的熱力學因素相關；H和u與色譜過程的動力學因素相關。分離度R既與熱力學因素相關，也與動力學因素相關。由此也可看出保留時間tR是色譜分析中表征在一定的色譜柱上，溶質在分離過程分離特性的重要參數，式（8-14）也是討論高效液相色譜分離操作條件優化的關鍵方程式。四、高效液相色譜的速率理論傳質阻力本質上是由達到分配平衡的速

21、率帶來的影響。實際體系中，組分分子在固定相和流動相之間達到平衡需要進行分子的吸附、脫附、溶解、擴散等過程，這種過程稱為傳質過程，阻礙這種過 程的因素叫做傳質阻抗。在理想狀態中，色譜柱的傳質阻抗為零，則組分分子流動相和固定相之間會 迅速達到平衡。在實際體系中傳質阻抗不為零，這導致色譜峰展寬，柱效下降。在氣相色譜中Van Deemter 方程形式為：H = A +B/ u + C u（8-15）其中H為塔板數，A為渦流擴散系數，B為縱向擴散系數，C為傳質阻抗系數，u為流動相流速。 在高效液相色譜中，在液體流動相驅動下實現各個組分的分離，此過程與氣相色譜法相似，VanDeemter方程也一樣，但液體

22、與氣體流動相在影響色譜峰擴展上有明顯差別。如表8-2所示，液體擴散系數比氣體約小 10 4倍，黏度比氣體大100倍，密度比氣體大1000倍。表8-2液體與氣體流動相的差別性質/流動相液體氣體擴散系數D /(C m2 /S)10 -510-1密度 p (g /mL)110-3黏度 n/(mPa.s)110-2雷諾數Re *10010*雷諾數Re是流體在管道內，內摩擦流動的一項重要指標。Re=v.d. p/ n其中：v介質線速；d 管道內徑；p介質密度；n介質黏度。層流：Re 2320影響分離的主要因素有流動相的流速、性質和極性。因為流動相液體的黏度比氣體要大一百倍， 密度是氣體的一千倍，故降低傳

23、質阻力是提高LC柱效主要途徑。氣相色譜法中流動相與固定相之間的相互作用可忽略不計，而在液相色譜法中流動相與固定相之間的相互作用是不能忽略的。（一）影響色譜峰形擴展的各種因素影響譜帶展寬主要由渦流擴散、分子擴散和傳質三部分組成，但是，由于流動相物理性質的差別很大。每一種擴散對板高的貢獻，在GC和HPLC中是不同的。由于溶質在液譜中擴散系數比在GC中小104,加上液相色譜柱填料的顆粒度一般小于10 m，所以，渦流擴散、分子擴散對板高的貢獻，相對GC是較小的，相對來說，傳質的影響大些。與GC不同，HPLC有其特點，因而其速率理論的表述方式也有區別：H He Hl Hs Hmm Hsm(8-16)(8

24、-16)式中各項分別為：渦流擴散項、分子擴散項、傳質阻力項(固定相、流動流動相和滯留 流動相)。表達如下：IIF -A -上皿戸 卞ffy =:1 .渦流擴散項A=2巾p入是不均勻因子，表達了色譜柱填充的均勻程度，當固定相為40-50呵 時，入值為1-2。dp為固定相的粒徑。固定相小粒度、均勻，勻漿高壓填充，可以降低A。2 分子擴散項(可以忽略)B _2vDm(8-17)分子擴散是也稱為縱向擴散。由于濃度梯度的存在，而產生的濃差擴散。(8-17)式中：丫為柱中填料間的彎曲因子，丫 0.6 ; DM為溶質在液體流動相中的擴散系數，Dm 10-5 C怦S由于Dm很小，因此B/U -0，因此，在不考

25、慮分析速度時，可用更低的線速度。這也是當樣品注入呈現出點進樣時， 存在無限直徑效應的原因。3 傳質阻力項Cu圖8-1固定液的傳質阻力引起的峰形擴展圖8-1表示固定液液膜厚度為df時樣品流出色譜柱時的峰形。溶解在固定液表面的溶質分子到達峰的前沿；溶解在固定液內部的溶質分子到達峰的后尾。液膜厚度為df大時會引起色譜峰形的明顯擴展。傳質阻力項C u包括：固定相的傳質阻力項 Hs ;流動相移動時的傳質阻力項Hmm ;流動相滯留時的傳質阻力項 H SM。C u = H s + Hmm+ Hsm(8-18)(1 )固定相的傳質阻力項Hs：對液液色譜k 丐 我 +1 ? Q(8-19)(8-19)式中：df

26、為固定液液膜(或薄殼)厚度，q為構型因子(對均勻液膜或薄殼材料q=2/3、對大孔固定相q=1/2、對球形非多孔固定相q=1/30)。對液固色譜I卻=盤u *B, 6I Ar +11(8-20)(8-20)式中：td為樣品分子被吸附在固定相表面的平均停留時間。(2)流動相移動時的傳質阻力項Hmm=干-吐(8-21)式中：Q為色譜柱填充因子，對柱子短、內徑粗的柱子Q數值較小。(3)流動相滯留時的傳質阻力項Hsm即靜態流動相傳質阻抗，是由于部分流動相在固定相微孔內的滯留引起,數CSM匕亦 =n：也JO I U 十片 I靜態流動相傳質阻抗系(8-22)式中：為孔洞中滯留流動相在總流動相中占的百分數；丫

27、0為顆粒內部孔洞的彎曲因子。(二) Van Deemter 方程的表達及圖示I片-11 6必 30十上I ：勺為(8-23)u圖8-2 HPLC與GC的H-u曲線比較在高效液相色譜中，對液液分配色譜，Van Deemter 方程的完整表達形式為(三) 方程討論H對U作圖，可繪出與氣相色譜相似的曲線，但液相色譜H-u曲線與氣相色譜的形狀不同，如圖8-2所示。在HPLC中，由于使用固定相與流動相與GC不同，H-u曲線的最低點遠低于 GC。HPLC中,流動相粘度遠遠高于氣相色譜，縱向擴散對峰型的影響很小，由低的Hmin值可看出，HPLC色譜柱要比GC填充柱有更高的柱效。由低的Uopt值可看出H-u曲

28、線具有平穩的斜率，表明采用高的液體流動相流速時，色譜柱效無明顯的損失，這也是 HPLC的快速分離的基礎。在U等于或稍大于 Uopt時，速率方程中的分子擴散項B/u較小，可以忽略不計，而只有兩項，因而Van Deemter 方程的形式為：H A + C u從Van Deemter方程的完整表達式(8-23)看出，HPLC的實驗條件應該是：小粒度、均勻的 球形化學鍵合相；低粘度流動相，流速不宜過快；柱溫適當。渦流擴散、流型效應和停滯流動相慢傳質均與dp有關，小的dp有利于提高柱效。高效固定相的重要特征是顆粒細小。固定相的慢傳質與df有關，減少df有利于提高柱效。鍵合相色譜有效降低 df,柱效進一步

29、提高。五、影響分離的因素(一) 色譜填充性能1 .液相色譜填充性能參數總孔率(8-24)Ur r(8-24)式中訂指色譜柱橫截面上可供流動相通過的孔隙率，F為流動相體積流流速，cm3/s ; 丫為柱內徑的半徑 cm ; tM為柱的死時間；L為柱長cm ; V為色譜柱的空體積。(2) 柱填充壓力降(8-25)式中，n為流動相的黏度，MPas; ko為色譜柱的比滲透系數；dp為固定相顆粒直徑，卩m為色譜柱對流路的阻抗因子，表征色譜柱對流動相阻力的大小，與色譜柱所用的固定相性質和填充方法密切相關。Pi、P0為色譜柱的入口壓力和出口壓力，MPa。柱滲透率(8-26)(8-26)式中K0等于1/ 0,柱

30、滲透率Kp表示流動相通過柱子的難易程度。在高效液相色譜法中,由于液體流動相黏度大于氣體流動相，而且固定相顆粒又小，為保證柱子在較低壓力下正常操作，總 希望柱的滲透率大。液相色譜柱分離性能的優劣，是由固定相粒度、柱長、由柱內徑和填充狀況決定的柱壓降這三個 參數度決定的。這三個參數度也決定了樣品組分的保留時間：-IX為（l+k（8-27）綜上所述，保留時間不僅與色譜過程的熱力學因素k有關，還直接與決定柱效與分離度的柱性能參數t、AP、Kp及流動相的黏度n有關，這些參數都是影響色譜分離過程動力學的重要因素。2 固定相及分離柱氣相色譜中的固定液原則上都可以用于液相色譜，選用原則與氣相色譜一樣。但在高效

31、液相色譜中，分離柱的制備是一項技術要求非常高的工作，一般都是購買商品柱，很少自行制備。（二）流動相及流動相的極性液相色譜中，改變淋洗液組成、極性是改善分離的最直接因素。液相色譜不可能通過增加柱溫來 改善傳質。因此大多是恒溫分析。1 流動相選擇在液相色譜中顯得特別重要，流動相可顯著改變組分分離狀況，液相色譜的流動 相又稱為：淋洗液，洗脫劑。2 親水性固定液常采用疏水性流動相，即流動相的極性小于固定相的極性，稱為正相液液色譜 法，極性柱也稱正相柱。3 若流動相的極性大于固定液的極性，則稱為反相液一液色譜柱，非極性柱也稱為反相柱。組 分在兩種類型分離柱上的出峰順序相反。（三）流速流速大于0.5 cm

32、/s時,Hu曲線是一段斜率不大的直線。降低流速，柱效提高不是很大。但在 實際操作中，流量仍是一個調整分離度和出峰時間的重要可選擇參數。（四）高效液相色譜的進樣問題液相色譜的進樣系統，由于其柱壓力高，不可能采用直接進樣法，只能用進樣閥進樣。相對來說, 進樣方法較為簡單，但兩個效應是不可忽視的。1 .壁效應采用通常進樣方式時，樣品和流動相一起加到柱入口。樣品到達柱中心，不是呈一個濃度高度集 中的規則的“點”，而是以不均勻的輻射方式分散在整個柱子的入口處。一部分樣品很快到達柱壁區 域。在柱壁區的譜帶展寬尤為嚴重，且峰形不對稱，甚至發生畸變，柱效明顯下降。這種現象稱為壁 效應。他冰書怖r1卩品I圖8-

33、3 壁效應圖8-3 無限直徑效應2 .無限直徑效應為消除壁效應，可采用點進樣（或稱中心進樣）技術，將樣品導入柱頭中心，而流動相直接穿過整個柱入口截面。這種進樣方式把一個尖細的樣品脈沖送到柱中心，在此樣品脈沖向出口移動時，始 終保持它的完整性，不接觸柱壁。只要柱徑足夠大，加之組分在液體流動相中的徑向展寬（從圓心沿 半徑向圓周的擴散） 相當慢，使組分在擴散到管壁之前就已流出柱子。這種柱子稱為“無限直徑”柱。第三節高效液相色譜儀（HPLC Instrument）色譜處理機圖8-4 HPLC的基本裝置典型的高效液相色譜儀是由高壓輸液系統、進樣系統、分離系統、檢測系統和色譜數據處理系統（色譜工作站）五個

34、基本部分和相關輔助部件構成。高壓輸液系統由貯液罐、 脫氣裝置、高壓輸液泵、過濾器、梯度洗脫裝置等組成， 貯液罐由玻璃、 不銹鋼或氟塑料等耐腐蝕材料制成。高壓輸液泵是高效液相色譜儀的關鍵部件之一，用以完成流動相的輸送任務。對泵的要求是：耐腐蝕、耐高壓、無脈沖、輸出流量范圍寬、流速恒定，且泵體易于清 洗和維修。高壓輸液泵可分為恒壓泵和恒流泵兩類，常使用恒流泵（其壓力隨系統阻力改變而流量不 變）。進樣系統常用六通閥進樣器進樣，進樣量由定量環確定。操作時先將進樣器手柄置于采樣位置（LOAD ），此時進樣口只與定量環接通，處于常壓狀態，用微量注射器（體積應大于定量環體積） 注入樣品溶液，樣品停留在定量環

35、中。然后轉動手柄至進樣位置（INJECT），使定量環接入輸液管路，樣品由高壓流動相帶入色譜柱中。色譜柱由柱管和填充劑組成。柱管大多用不銹鋼制成。柱內填充劑有硅膠和化學鍵合固定相。在 化學鍵合固定相中有十八烷基硅烷鍵合硅膠（又稱ODS柱或C18柱）、辛烷基硅烷鍵合硅膠（C8柱）、氨基或氰基鍵合硅膠等。常使用 ODS柱,由于ODS屬于非極性固定相，在分離分析時一般使 用極性流動相，所以屬反相色譜法，洗脫時極性大的組分先出峰，極性小的組分后出峰。流動相常用 甲醇-水或乙腈-水為溶劑系統，流動相在使用前必須脫氣，否則很易在系統的低壓部分逸出氣泡， 氣泡的出現不僅影響柱分離效率，還會影響檢測器的靈敏度甚

36、至不能正常工作，脫氣的方法有加熱回流法、抽真空脫氣法、超聲脫氣法和在線真空脫氣法等。檢測器主要使用紫外檢測器（ UVD ）, UVD可分為固定波長、可變波長和二極管陣列檢測器三 種類型，以可變波長紫外檢測器應用最廣泛。檢測器由光源、流通池和記錄器組成，其工作原理是進 入檢測器的組分對特定波長的紫外光能產生選擇性吸收，其吸收度與濃度的關系符合光吸收定律。分析前，選擇適當的色譜柱和流動相，開泵，沖洗柱子，待柱子達到平衡而且基線平直后，用微 量注射器把樣品注入進樣口，由流動相把試樣帶入色譜柱進行分離，分離后的組分依次流入檢測器的流通池，最后和洗脫液一起排入流出物收集器。當有樣品組分進入流通池時，檢測

37、器把組分濃度轉變 成電信號，經過放大，用記錄器記錄下來就得到色譜圖。色譜圖是定性、定量和評價柱效高低的依據。圖8-5 HPLC的流程圖8-6 HPLC的結構一、液相色譜儀-高壓輸液系統輸液系統由貯液罐、過濾器、梯度洗脫裝置、高壓輸液泵、脫氣裝置等組成。高壓泵是高效液相色譜儀最重要的部件之一。由于高效液相色譜儀所用色譜柱直徑細，固定相粒度小，流動相阻力大， 因此，必須借助于高壓泵使流動相以較快的速度流過色譜這。高壓泵需要滿足以下條件：能提供150-450kg/cm2 的壓強；流速穩定，流量可以調節；耐腐蝕。目前所用的高壓泵有機械泵和氣動放大 泵兩種。梯度淋洗裝置可以將兩種或兩種以上的不同極性溶劑

38、，按一定程序連續改變組成，以達到提 高分離效果，縮短分離時間的目的。梯度淋洗的作用與氣相色譜中的程序升溫裝置類似。（一）貯液罐貯液罐為不銹鋼、玻璃或氟塑料制成的容器，容量為1到2L ,用來貯存足夠數量、符合要求的流動相。貯液罐可以是一個普通的溶劑瓶，也可以是一個專門設計的儲液器。儲液器往往和泵通過管 路構成循環系統以便除去溶劑中的氣體。現多數使用溶劑瓶，一般采用耐腐蝕的玻璃瓶或聚四氟乙烯 瓶。貯液罐的放置位置要高于泵體，以保持輸液靜壓差，使用過程應密閉，以防止因蒸發引起流動相 組成改變，還可防止氣體進入。(二) 高壓輸液泵氣相色譜由高壓鋼瓶直接提供動力， 高壓輸液泵是高效液相色譜儀中關鍵部件之

39、一，是流動相的動力源。高壓輸液泵功能是將溶劑貯存器中的流動相以高壓形式連續不斷地送入液路系統，使樣品在色譜柱中完成分離過程。 液相色譜為了獲得高柱效， 所用色譜柱徑較細，所填固定相粒度很小， 因此, 對流動相的阻力較大，為了使流動相能較快地流過色譜柱，就需要高壓輸液泵。1.對高壓輸液泵的要求(1) 能在高壓下連續工作，一般要求耐壓4050MPa cm2,能在824 h連續工作。(2) 輸出流量范圍寬：分析型填充柱在0.1-10mL/min 內連續調節，制備型填充柱要求在 100mL以上。(3) 輸出流量穩定，要求無脈沖，流量精度和重復性為0.5%左右。(4) 耐腐蝕，能適合各種有機溶劑、水和緩

40、沖溶液。(5 )密封性好。泵體易于清洗和維修。高壓輸液泵，按其性質可分為恒壓泵和恒流泵兩大類。恒壓泵是保持輸出壓力恒定，而流量隨外界阻力變化而變化，如果系統阻力不發生變化，恒壓泵 就能提供恒定的流量。2 泵的類型高壓輸液泵主要有恒壓泵和恒流泵兩類，常使用恒流泵。恒流泵又稱機械泵，主要有機械注射泵 與機械往復泵兩類。恒流泵特點是在一定操作條件下，輸出流量保持恒定，其流量與流動相粘度和色譜柱引起阻力變化無關；恒壓泵是指輸出壓力恒定，但其流量隨色譜系統阻力而變化，故保留時間的重現性差。如果 系統阻力不發生變化，恒壓泵就能提供恒定的流量。恒壓泵和恒流泵各有優缺點。(1 )恒壓泵A:氣動泵直接式，簡單，

41、但高壓氣體可溶解于溶劑中，當溶劑進入檢測器時會放出氣體影響檢測。圖8-7 氣動泵B:氣動放大泵泵出口壓力在系統中是恒定的，流速由柱的阻力決定。壓力由兩活塞的面積比決定。操作簡便，流量范圍大，但流速取決于溶劑粘度和柱滲透性。液 缸大不便清洗。流量有波動。圖8-8氣動放大泵特點：高壓、無脈動、成本低，用空氣壓縮機或氣體鋼瓶低壓驅動，操作成本低。缺點是更換 溶劑困難。（2）恒流泵恒流泵有往復泵和螺旋柱塞泵，這類泵輸出流量恒定，柱壓力由柱的阻力決定。A :螺旋注射泵步進馬達控制活塞移動，同時控制流量。至限位開關時停泵后退活塞、吸液，然后繼續。壓力 大（可達60 MPa），無脈沖。但清洗不便，精密而價高

42、。圖8-9 螺旋注射泵B :往復柱塞泵圖8-10往復柱塞泵往復柱塞泵由偏心輪帶動活塞往復移動，恒流輸出，并通過改變電機轉速調節流量。體積小清洗 方便，特別適用于梯度淋洗。往復柱塞泵有明顯脈沖，需采取增加脈沖阻尼器、改變凸輪形狀、加電 子線路保護、用多頭泵系統（并聯串聯）等措施。往復柱塞泵目前應用較多。往復柱塞泵特點是單位時間輸出的液體流量由單位時間柱塞往復的次數決定，因此，流量恒定， 與系統阻力無關，可以連續不斷的輸送液體，更換溶劑方便，可用于梯度洗脫，主要缺點是有脈動。C :多頭柱塞泵并聯雙柱泵少用一組單向閥。用兩相差180度的凸輪推動兩交替工作的柱塞。流量穩定。單泵衆黍三泵住豆泵的球動圖8

43、-11多頭柱塞泵D:往復隔膜泵柱室間用不銹鋼薄膜隔開而使活塞不與流動相接觸，靠油壓迫鋼膜而輸出。 流量穩定，單形成高壓慢 。圖8-12往復隔膜泵（三）輸液體統的輔助裝置1 過濾器：除掉機械雜質及固體顆粒。第八章-17 -由于液相色譜柱、進樣器等都很精密，微小的機械雜質將導致這些部件的損害，而不能正常工作,同時機械雜質在柱頭的積累還影響柱子的使用，因此，溶劑需要過濾。r4彈黃圖 8-14（b）管遒過迪乘圖8-13過濾器的結構2 .混合器：體積不宜大。3 脈動阻尼器：種類多，都有一定容積和彈性。4 壓力測量裝置：電子壓力控制器流量5 .流量測量裝置：電子流量計6 脫氣裝置：除掉溶于流動相中的各類氣

44、體，以保證柱效能。可采用通氮脫氣、超聲波脫氣、 自動脫氣機脫氣等。（四）梯度洗脫裝置在液相色譜中，當樣品組成復雜時，有時會出現先出的峰分不開，后面的峰保留值又太大的現象, 這時，可以采用梯度洗脫來調整混合溶劑的組成，改變溶劑強度或選擇性。梯度洗脫就是在分離過程中使兩種或兩種以上不同極性的溶劑按一定程序連續改變它們之間的比例，從而使流動相的強度、極性、pH值或離子強度相應地變化，達到提高分離效果，縮短分析時間的目的。梯度洗脫裝置分為兩類：1 外梯度裝置（又稱低壓梯度），流動相在常溫常壓下混合，用高壓泵壓至柱系統，僅需一臺 泵即可。2 內梯度裝置（又稱高壓梯度），先將兩種溶劑分別用泵增壓后，再由泵

45、按程序壓入混合室，梯度洗脫裝置示意圖低壓梯度混合，再注入色譜柱。落制A/混合器 廠Y溶制混合點 擁劑 B第八章-16 -梯度洗脫的實質是通過不斷地變化流動相的強度，來調整混合樣品中各組分的k值，使所有譜帶都以最佳平均k值通過色譜柱。它在液相色譜中所起的作用相當于氣相色譜中的程序升溫，所不同的是，在梯度洗脫中溶質 k值的變化是通過流動相的極性、pH值和離子強度來實現的，而不是借改變溫度（溫度程序）來達到。流動相A、洗脫時，若樣品中各成分容量因子k相差大，則K 如 如大的峰寬而低且分析時t|M間長。流動相B、是溶解力強。洗脫時，各成分很快出來，則k（12）小的峰達不到分離。AtB 若將A、B流動相

46、的組成隨時間改變，則即分離好，又縮短分析時間。當我們需要混合三種流動相時，可利用電磁閥的功能將吸液分劃成A : B：C三部分，劃分比一定，組分送液時是一定時，相當于GC中恒溫分析。在梯度送液時，劃分比則按所設定的程度時時刻刻都在變化，相當于GC中程序升溫。二、液相色譜儀-進樣系統進樣系統包括進樣口、注射器和進樣閥等，它的作用是把分析試樣有效地送入色譜柱上進行分離。高效液相色譜柱比氣相色譜柱短得多（約540 cm ）,因此柱外效應較突出。柱外效應是指色譜柱外因素引起的峰展寬，包括進樣系統，連接管，檢測器中存在的死體積。柱外展寬可分為柱前和柱后 展寬，進樣系統是引起柱前展寬的主要因素，因此高效液相

47、色譜法中對進樣技術要求較嚴。在液相色 譜中，進樣方式有隔膜式注射進樣器進樣，高壓進樣閥進樣，自動進樣裝置等。（一）隔膜式注射進樣器隔膜式注射進樣器有硅橡膠隔膜，在原理上與氣相色譜法完全一致。用微量注射器進樣的優點可柱頭進樣，減小死體積，充分發揮柱的效能，簡單便宜。缺點是高壓進樣時漏液會產生誤差，隔墊 使用次數有限，進樣量小，重復性差。（二）進樣閥方式一六通閥進樣目前，廣泛采用多通路進樣閥， 它可以承受很高的壓力， 由于進樣量是由進樣定量管決定的，因此,可以獲得好的重復性，更換不同體積的進樣定量管，可調整進樣量。進樣時，樣品中不應混入機械雜 質，溶解樣品的溶劑最好與使用的流動相相同，以防止溶劑變

48、化出現不溶物而堵塞柱子。一般高效液相色譜流路中為高壓力工作狀態，通常使用耐高壓的六通閥進樣裝置，六通閥結構如圖所示，進樣量由定量環確定。操作時先將進樣器手柄置于采樣位置（LOAD ），此時進樣口只與定量環接通，處于常壓狀態，用微量注射器（體積應大于定量環體積）注入樣品溶液，樣品停留在定量環 中。然后轉動手柄至進樣位置（INJECT），使定量環接入輸液管路，由高壓泵輸送的流動相將樣品 送人色譜柱中。樣品定量管的容積是固定的，因此進樣重復性好。缺點是不能注入小體積樣品（玄1.2此），改變注入量時要更換定量管。圖8-15旋轉式六通閥進樣裝置、液相色譜儀一一分離系統（一）色譜柱分離系統包括色譜柱、恒溫

49、器和連接管等部件。進行色譜分離的首要工作是選擇性能良好的色譜柱，即選擇在確定的分離條件下分離效率高和分析時間短的色譜柱。色譜柱的選擇應考慮： 固定相類型的選擇，主要取決于樣品分離模式；柱填料的結構，主要指顆粒的形狀大小、均勻性、比表面、平均孔徑和孔容等；柱規格指柱內徑、柱長度和填料粒度；色譜柱的牌號/廠商。色譜柱多為直形，內部充滿微粒固定相。發展趨勢是減小填料粒度和柱徑以提高柱效。色譜柱可 分為分析柱；制備柱；分析柱的保護柱。1 .柱材料及規格色譜柱是液相色譜的心臟部件，它包括柱管與固定相兩部分。柱管材料有玻璃、不銹鋼、鋁、銅及內襯光滑的聚合材料的其他金屬。玻璃管耐壓有限，故金屬管用得較多，它

50、是由內部拋光的不銹鋼管制成。一般色譜柱長 540cm，內徑為16 mm，柱效達500010000塊/m理論塔板數。凝膠色 譜柱內徑312mm。，制備往內徑較大，可達 25mm 以上。2 .柱的填料固定液涂在擔體上而成。擔體有兩類：一類是表面多孔型擔體；另一類是全多孔型擔體。近年來又出現了全多孔型微粒擔體 ，這種擔體粒度為 510 m，是由10 nm級的硅膠微粒堆積而成，又叫 堆積硅珠。由于顆粒小，所以柱效高，是目前最廣泛使用的一種擔體。3 .保護柱一般在分離柱前有一個前置柱，前置柱內填充物和分離柱一樣，安裝在分析柱前。其作用是收集、 阻斷來自進樣器的機械和化學雜質，以保護和延長分析柱的使用壽命

51、。一只1cm長的保護柱就能提供充分的保護作用。若選用較長的保護柱，雖可降低污染物進入色譜柱，但會引起譜帶擴張。因此選 擇保護柱的原則是在滿足分離要求的前提下，盡可能選擇對分離樣品保留低的短保護柱。保護柱也可裝填和分析柱不同的填料，如較粗顆粒的硅膠（1015呵）。保護柱裝填的填料較少，價格較低，為消耗品，通常分析50100次樣品，柱壓力呈增大趨向時就是需要更換保護柱的信號。目前市場上供應的結構新穎的可更換芯式設計保護柱，是由保護套和可更換式保護芯，兩部分組成。（二）柱連接方式第八章-21 -柱出、入口的連接管的死體積越小越好，一般常用窄孔（內徑0.13mm）的厚壁（1.52.0mm）不銹鋼管 ,

52、以減少柱外死體積 .（三 ） 柱溫控制 在高效液相色譜分析中，柱溫一般為室溫或接近室溫。適當提高柱溫可改善傳質，提高柱效，縮 短分析時間。因此，在分析時可以采用帶有恒溫加熱系統的金屬夾套來保持色譜柱的溫度。溫度可以 在室溫到60 C之間調節。對凝膠滲透色譜儀，其柱溫可從室溫至150 C實現精確控制。四、液相色譜儀檢測系統檢測器實際上是一種換能裝置，它將流動相中組分含量的變化，轉變成可測量的電信號（通常是電壓 ），然后輸入記錄器。從原理分析，任何一種分析鑒定方法都可能用作色譜檢測器。理想的檢測 器應該是靈敏度高、線性范圍大、對所有待測組分相同響應。高效液相色譜的檢測器很多，光學（紫外， 熒光，

53、折光檢測器 ）；電化學 （極譜、電導、庫侖、離子選擇電極）等。對檢測器要求是高靈敏度；低噪聲；大的線性范圍；對所有化合物都響應。與 GC 一樣。用得最多的是 UV 檢測器，常用于有雙鍵的芳香族化合物檢測，有 UV 吸收就可用 UV 檢測器。 因為 UV 對甲醇，水無吸收，所以甲醇，水可用作流動相。檢測器噪聲一般由于電引起。（一） 檢測器分類1 按性質或應用范圍分類有總體性能檢測器和溶質性能檢測器。 總體性能檢測器，是響應值取決于流出物（含樣品與流動相 ）某些物理性質的總的變化的檢測器。屬于這類檢測器的有示差折光、電導等檢測器 ，GC 中的熱導檢測器也屬于這類檢測器。溶質性能檢測器是響應值取決于

54、流動相中溶質的物理或化學特性的檢測器。屬于這類檢測器較 多，有紫外檢測器、熒光檢測器、化學發光檢測器、安培檢測器、手性檢測器等。因為溶質性能檢測 器僅對被測定物質有較大響應，而流動相沒有響應或響應很小，所以檢測靈敏度高，受操作條件變化 和外界環境影響小，并且可用于梯度洗脫操作。但與總體性能檢測器相比，應用范圍受到限制。總體性能檢測器和溶質性能檢測器的劃分也不是絕對的，例如紫外-可見檢測器常用作溶質性能檢測器，但在間接光度離子色譜法中則成為總體性能檢測器。2 按測量信號性質分類有濃度型檢測器和質量型檢測器。 濃度型檢測器的響應值正比于溶質在流動相中的濃度，測量的是流動相中溶質濃度的瞬間變化， 大

55、部分液相色譜檢測器屬這一類檢測器。當樣品量一定時，檢測器瞬間響應，峰高響應值與流動相流 速無關；峰面積響應值與流動相流速成反比，峰面積與流速乘積為常數。 質量型檢測器的響應值正比于單位時間內通過檢測器的物質的質量，峰面積與流動相流速無關， 峰高響應值與流速成正比。例如庫侖檢測器就是質量型檢測器。3按測量原理分類 有熱學性質檢測器、光學性質檢測器、電學及電化學性質檢測器等。光學性質檢測器是根據被測 物質對光的吸收、發射和散射等性質進行檢測的。有較多的液相色譜檢測器屬這一類檢測器，例如紫 外 - 可見檢測器、示差折光檢測器、熒光檢測器、蒸發光散射檢測器、化學發光檢測器、手性檢測器 等。電學及電化學性質檢測器是根據被測物質的電化學性質進行檢測的，常用的有安培檢測器、電導 檢測器、庫侖檢測器、介電常數檢測器、極譜檢測器等。該類檢測器通