1、第十章 沉淀反應與凝集反應 第一部分 凝集反應 第二部分沉淀反應 第一部分 凝集反應 第一節 凝集反應的特點 第二節 直接凝集反應 第三節 間接凝集反應 第四節 自身紅細胞凝集試驗 第五節 抗球蛋白試驗 一、凝集反應定義 細菌、螺旋體、紅細胞或細胞性抗原等顆粒性抗 原，或可溶性抗原（或抗體）與載體顆粒結合成致敏 顆粒后，它們與相應抗體（或抗原）發生特異性反應， 在適當電解質存在下，形成肉眼可見的凝集現象。參 與凝集反應的抗體有IgM和IgG,IgM的凝集作用比IgG 大數百倍。 第一節 凝集反應的特點 二、反應階段 抗原抗體的特異性結合 出現肉眼可見的凝集現象 三、特點 該方法簡便、敏感度高，

2、應用廣泛。 四、類型 按抗原的性質和反應方式的不同分為： 直接凝集和間接凝集 直接凝集反應(direct agglutination)： 顆粒性抗原直接與抗體結合，在電解質的作 用下，出現肉眼可見的凝集現象。 第二節 直接凝集反應 （一） 玻片凝集試驗 （二） 試管凝集試驗 + （一）玻片凝集試驗 方法評價: 定性試驗，簡便和快速；敏感度低。 臨床應用: 菌種鑒定；血清學分型；血型鑒定。 在試管內顆粒性抗原直接與抗體結合，在電解質 的作用下，出現肉眼可見的凝集現象。 （二）試管凝集試驗 方法評價： 半定量試驗；簡便、快速；敏感度低；可有假陽性。 應用： 測定相應抗體的效價；可作臨床診斷或流行病

3、學調查。 試管凝集試驗 根據凝集程度記錄為：（100凝集）、 （75凝集）、（50凝集）、（25凝集）。以 出現50凝集以上的血清最大稀釋度為該血清的凝集效價。 間接凝集反應(indirect agglutination): 將可溶性抗原或抗體吸附于顆粒性載體表面， 然后與相應的抗體或抗原反應，在電解質的作用 下，出現肉眼可見的凝集現象。 第三節 間接凝集反應 1.正向間接凝集試驗 2.反向間接凝集試驗 3.間接凝集抑制試驗 4.協同凝集試驗 一、間接凝集反應的類型 用抗原致敏載體-檢測抗體 1.正向間接凝集試驗 2.反向間接凝集試驗 用抗體致敏載體-檢測抗原 3.間接凝集抑制試驗 用抗原致敏

4、載體-檢測抗原 4.協同凝集試驗 二、間接血凝試驗 1/2 1/4 1/8 1/16 1/32 1/64 1/128 1/256 1/512 1/1024 Pos. Neg. Titer 64 8 512 2 32 128 32 4 Patient 1 2 3 4 5 6 7 8 反向間接血凝試驗 血凝試驗強度 三、膠乳凝集試驗 孕婦尿中，絨毛膜促性腺激素（HCG）含量明顯增高。 反之，非孕婦尿中HCG含量甚微，不能消耗掉抗HCG抗體。 將待檢血清或抗原和致敏乳膠各滴一滴在玻片上，陽 性者510min即出現凝集。如妊娠免疫診： 四、明膠凝集試驗 將病毒抗原或重組抗原吸附于粉紅色 明膠顆粒上，當

5、致敏顆粒與樣品血清作用 時，若血清含有抗病毒抗體則可形成肉眼 可見的粉紅色凝集。 五、間接凝集反應的應用 一）抗原的檢測 反向間接凝集試驗可用于檢測病原體的可溶性抗 原，也可用于檢測各種蛋白質成分。 二）抗體的檢測 檢測細菌、病毒、寄生蟲等感染后產生的抗體。 未經致敏的受檢者新鮮紅細胞 試劑：抗人O型紅細胞的單克隆抗體 臨床應用：HIV檢測、HBV檢測 第四節 自身紅細胞凝集試驗 自身紅細胞凝集試驗 抗球蛋白試驗 又稱 Coombs試驗 第五節 抗球蛋白試驗 （一）直接Coombs試驗 檢測紅細胞上抗體或不完全抗體 單價抗體只能與一方抗原的抗原決定簇結合，不產生凝 集反應，當加入抗球蛋白抗體后

6、，可以將兩個各連接一方抗 原決定簇的單價抗體連接起來，出現凝集現象。 （二）間接Coombs試驗 檢測血清中的抗紅細胞抗體 臨床應用： 在輸血上的應用； 血型抗原抗體的檢查； 對新生兒溶血性貧血性疾病的診斷； 對溶血性貧血的研究； 對細菌或立克次體的不完全抗體檢查。 第一節第一節 沉淀反應的特點沉淀反應的特點 第二節液體內沉淀試驗第二節液體內沉淀試驗 第三節凝膠內沉淀試驗第三節凝膠內沉淀試驗 第四節第四節 免疫電泳技術免疫電泳技術 第二部分 沉 淀 反 應 1.沉淀反應（precipitation）: 是指可溶性抗原與相應抗體在適當條件下發 生特異性結合而出現的沉淀現象,其特性與經典的 抗原抗

7、體反應相同。 第一節 沉淀反應原理及特點 2.沉淀反應分兩個階段 第一階段： 抗原抗體特異性結合，快速但不可見。 第二階段： 形成肉眼可見的大的免疫復合物。 免疫濁 度測定 絮狀沉 淀試驗 單向擴 散試驗 雙向擴 散試驗 對流免疫電泳 火箭免疫電泳 免疫電泳 免疫固定電泳 液體內沉 淀試驗 凝膠內沉 淀試驗 凝膠免疫 電泳技術 3.沉淀反應的類型 l絮狀沉淀試驗是將抗原與相應抗體混合，在電解質 存在的條件下，抗原抗體結合形成肉眼可見的絮狀沉 淀物。 l方法受抗原抗體比例的影響非常明顯 l應用于測定抗原抗體反應的最適比例 l三種類型： 抗原稀釋法：抗原最適比例 抗體稀釋法：抗體最適比例 方陣滴定

8、法：抗原抗體最適比例 一、 絮狀沉淀試驗 第二節液體內沉淀試驗 抗體抗體 稀釋度稀釋度 抗原稀釋度抗原稀釋度 1/101/101/201/201/401/401/801/801/1601/1601/3201/3201/6401/640對照對照 1/51/5+ + + + + + + + + + + + + + + 1/101/10+ + + + + + + + + + + + + + + 1/201/20+ + + + + + + + + + + + + + + 1/401/40+ + + + + + + + + + + 1/801/80+ + + + 最適比例方陣測定法 二、免疫濁度測定 1

9、.原理 當可溶性抗原與相應抗體特異結合，二者比例合適 時，在特殊的緩沖液中它們快速形成一定大小的抗原抗 體復合物，使反應液體出現濁度。利用現代光學測量儀 器對濁度進行測定從而檢測抗原含量。 2.影響因素 抗原抗體的比例： 反應體系中保持抗體過量 抗體的質量: 特異性強，效價高，親和力強。 抗原抗體反應液的最適PH: 為6.58.5 可溶性抗原可溶性抗原和相應抗體在凝膠中擴散，和相應抗體在凝膠中擴散，形成濃度形成濃度 梯度梯度，在抗原抗體相遇并且，在抗原抗體相遇并且濃度比例適當的位置濃度比例適當的位置形成形成 肉眼可見的沉淀線或沉淀環。肉眼可見的沉淀線或沉淀環。 常用的凝膠有瓊脂、瓊脂糖、葡聚糖

10、或聚丙烯酰常用的凝膠有瓊脂、瓊脂糖、葡聚糖或聚丙烯酰 胺凝膠。胺凝膠。 第三節凝膠內沉淀試驗 一、原理 二、方法 1、單向擴散試驗 （平板法） 原理： 抗體與待測的抗原,在兩者比例合適的部位結合形成沉 淀環。環的大小與抗原的濃度成正相關。可以定量。 技術要點： 將抗體混入0.9%瓊脂糖內（50），未凝固前傾注成平 板，凝固后打孔（直徑35mm ），孔中加入抗原溶液和不 同濃度的標準品，置濕盒內37,2448h 觀察孔周圍是否 出現沉淀環。 抗體+瓊脂 傾注平板打孔加樣 放置372448h觀察沉淀環 單向擴散試驗（平板法） 影響因素： 抗體質量 標準曲線 ，質控血清 結果與真實含量不符 雙環現象

11、（不同擴散率抗原性相同的兩個組分） 上排為5個不同濃度的參考品；下排為患者血清，下排 右2為異常病理血清 2、雙向擴散試驗 （平板法） 原理： 將抗原抗體分別加在瓊脂糖不同的對應孔中，兩者在 凝膠中自由擴散，在比例合適處形成白色沉淀線。鑒定抗 原抗體的最基本、最常見的方法之一 技術要點： 平板玻璃上傾注一層均勻的瓊脂糖薄層，凝固后打孔， 孔徑為3mm，孔間距在35 mm之間，在相對的孔中加入抗 原或抗體，放置濕盒371824h 后，觀察孔周圍是否出 現沉淀環。 應用 a.抗原或抗體的存在與否以及相對含量的估計； b.抗原或抗體相對分子量的估計; c.抗原性質的分析; d.抗體效價的滴定; e.

12、抗原或抗體純度的鑒定。 優點：優點： 1. 1.加快反應的速度。加快反應的速度。 2. 2.提高了靈敏度。提高了靈敏度。 3.3.增加了分辨率。增加了分辨率。 抗原抗體反應 的高度特異性 電泳技術的高 分辨率、快速、 微量 第四節免疫電泳技術 電泳分析 沉淀反應 原理：雙向擴散 + 電泳 比雙向擴散試驗靈 敏度提高8 16倍 技術要點：制備1.2%巴比妥 瓊脂凝膠板，在其上成對打 孔，孔徑3mm，孔距6 mm， 于陰極側孔內加待測血清， 陽性側孔加抗血清，電泳。 一、對流免疫電泳 蛋白質抗原常 帶較強的負電 荷，在電場中 向正極移動 抗體球蛋白 帶負電荷較少， 籍電滲作用向 負極泳動 對流免疫

13、電泳 通電 結果分析：結果分析： v無沉淀線出現則表明無相無沉淀線出現則表明無相 應的抗原。應的抗原。 v沉淀線位于抗原抗體孔中沉淀線位于抗原抗體孔中 間，說明兩者比例較適合。間，說明兩者比例較適合。 v沉淀線偏向抗原孔一方，沉淀線偏向抗原孔一方， 表示抗體濃度抗原，反表示抗體濃度抗原，反 之，則是抗體濃度抗原之，則是抗體濃度抗原 濃度。濃度。 對流免疫電泳 電泳時凝膠中抗體不移動，樣品孔中的抗原向正極 泳動，隨著抗原量的逐漸減少，抗原泳動的基底區越來 越窄，抗原抗體分子復合物形成的沉淀線逐漸變窄，形 成一個形狀如火箭的不溶性復合物沉淀峰，抗體濃度固 定時，峰的高度與抗原量呈正相關。 二、火箭免疫電泳 1.原理： 單向免疫擴散電泳，定量檢測技術 2. 技術要