1、PCR 擴增反應的操作第一節 PCR 擴增反應的基本原理一、聚合酶鏈式反應（ PCR ）的基本構成PCR 是聚合酶鏈式反應的簡稱， 指在引物指導下由酶催化的對特定模板 （克隆或基因組 DNA ） 的擴增反應，是模擬體內 DNA 復制過程，在體外特異性擴增 DNA 片段的一種技術，在分子生物 學中有廣泛的應用，包括用于 DNA 作圖、 DNA 測序、分子系統遺傳學等。PCR基本原理是以單鏈 DNA為模板，4種dNTP為底物，在模板3末端有引物存在的情況下， 用酶進行互補鏈的延伸， 多次反復的循環能使微量的模板 DNA 得到極大程度的擴增。 在微量離心 管中，加入與待擴增的 DNA 片段兩端已知序

2、列分別互補的兩個引物、 適量的緩沖液、 微量的 DNA 膜板、四種dNTP溶液、耐熱Taq DNA聚合酶、Mg2+等。反應時先將上述溶液加熱，使模板DNA在高溫下變性，雙鏈解開為單鏈狀態；然后降低溶液溫度，使合成引物在低溫下與其靶序列配對， 形成部分雙鏈，稱為退火；再將溫度升至合適溫度，在 Taq DNA 聚合酶的催化下，以 dNTP 為原 料，引物沿5 3方向延伸，形成新的 DNA片段，該片段又可作為下一輪反應的模板，如此重復 改變溫度，由高溫變性、低溫復性和適溫延伸組成一個周期，反復循環，使目的基因得以迅速擴 增。因此 PCR 循環過程為三部分構成：模板變性、引物退火、熱穩定DNA 聚合酶

3、在適當溫度下催化 DNA 鏈延伸合成（見 圖）。1模板 DNA 的變性模板DNA加熱到9095 C時，雙螺旋結構的氫鍵斷裂，雙鏈解開成為單鏈，稱為DNA的變性，以便它與引物結合， 為下輪反應作準備。變性溫度與 DNA 中 G-C 含量有關， G-C 間由三個氫 鍵連接， 而 A-T 間只有兩個氫鍵相連， 所以 G-C 含量較高的模板， 其解鏈溫度相對要高些。 故 PCR 中 DNA 變性需要的溫度和時間與模板 DNA 的二級結構的復雜性、 G-C 含量高低等均有關。對于 高 G-C 含量的模板 DNA 在實驗中需添加一定量二甲基亞砜 （DMSO ），并且在 PCR 循環中起始階 段熱變性溫度可

4、以采用 97C，時間適當延長，即所謂的熱啟動。2模板 DNA 與引物的退火將反應混合物溫度降低至 3765C時，寡核苷酸引物與單鏈模板雜交，形成DNA模板-引物復合物。退火所需要的溫度和時間取決于引物與靶序列的同源性程度及寡核苷酸的堿基組成。一般 要求引物的濃度大大高于模板 DNA 的濃度， 并由于引物的長度顯著短于模板的長度， 因此在退火 時，引物與模板中的互補序列的配對速度比模板之間重新配對成雙鏈的速度要快得多，退火時間 一般為12min。3引物的延伸DNA 模板 -引物復合物在 Taq DNA 聚合酶的作用下，以 dNTP 為反應原料，靶序列為模板， 按堿基配對與半保留復制原理，合成一條

5、與模板 DNA 鏈互補的新鏈。重復循環變性 -退火 -延伸三 過程，就可獲得更多的“半保留復制鏈”，而且這種新鏈又可成為下次循環的模板。延伸所需要 的時間取決于模板 DNA的長度。在72C條件下，Taq DNA聚合酶催化的合成速度大約為4060個堿基 /秒。經過一輪“變性 -退火 -延伸”循環，模板拷貝數增加了一倍。在以后的循環中，新合 成的 DNA 都可以起模板作用，因此每一輪循環以后， DNA 拷貝數就增加一倍。每完成一個循環 需24min, 次PCR經過3040次循環，約23h。擴增初期，擴增的量呈直線上升，但是當 引物、模板、聚合酶達到一定比值時，酶的催化反應趨于飽和，便出現所謂的“平

6、臺效應”，即靶DNA 產物的濃度不再增加。PCR 的三個反應步驟反復進行，使 DNA 擴增量呈指數上升。反應最終的 DNA 擴增量可用 Y =（1 + X） n計算。Y代表DNA片段擴增后的拷貝數， X表示平（Y）均每次的擴增效率，n代表 循環次數。平均擴增效率的理論值為 100%，但在實際反應中平均效率達不到理論值。反應初期，靶序列DNA片段的增加呈指數形式，隨著PCR產物的逐漸積累，被擴增的DNA片段不再呈指數增加，而進入線性增長期或靜止期，即出現“停滯效應”，這種效應稱平臺期數、PCR擴增效率及DNA聚合酶PCR的種類和活性及非特異性產物的竟爭等因素。大多數情況下，平臺期的到來 是不可避

7、免的。PCR擴增產物可分為長產物片段和短產物片段兩部分。短產物片段的長度嚴格地限定在兩個 引物鏈5端之間，是需要擴增的特定片段。短產物片段和長產物片段是由于引物所結合的模板不 一樣而形成的，以一個原始模板為例，在第一個反應周期中，以兩條互補的DNA為模板，引物是從3端開始延伸，其 5端是固定的，3端則沒有固定的止點，長短不一，這就是“長產物片段”。 進入第二周期后，引物除與原始模板結合外，還要同新合成的鏈（即“長產物片段”）結合。引 物在與新鏈結合時，由于新鏈模板的5端序列是固定的，這就等于這次延伸的片段 3端被固定了止 點，保證了新片段的起點和止點都限定于引物擴增序列以內、形成長短一致的“短

8、產物片段”。 不難看出“短產物片段”是按指數倍數增加，而“長產物片段”則以算術倍數增加，幾乎可以忽 略不計，這使得 PCR的反應產物不需要再純化，就能保證足夠純DNA片段供分析與檢測用。nnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnininnI 95C I II i, i i ：11 | r變性退火延伸圖 PCR的反應歷程二、PCR 反應的五個元素參與PCR反應的物質主要為五種：引物、酶、dNTP、模板和Mg2+。1引物引物是 PCR 特異性反應的關鍵， PCR 產物的特異性取決于引物與模板 DNA 互補的程度。理 論上，只要知道任何一段模板 DNA 序列，就能按其設計互補的寡核苷酸鏈做

9、引物，利用 PCR 就 可將模板 DNA 在體外大量擴增。引物設計有 3 條基本原則：首先引物與模板的序列要緊密互補， 其次引物與引物之間避免形成穩定的二聚體或發夾結構，再次引物不能在模板的非目的位點引發 DNA 聚合反應(即錯配) 。引物的選擇將決定 PCR 產物的大小、位置、以及擴增區域的 Tm 值這個和擴增物產量有關的 重要物理參數。好的引物設計可以避免背景和非特異產物的產生，甚至在RNA-PCR 中也能識別cDNA 或基因組模板。 引物設計也極大的影響擴增產量： 若使用設計粗糙的引物， 產物將很少甚至 沒有；而使用正確設計的引物得到的產物量可接近于反應指數期的產量理論值。當然，即使有了

10、 好的引物，依然需要進行反應條件的優化，比如調整Mg2+濃度，使用特殊的共溶劑如二甲基亞砜、甲酰胺和甘油。對引物的設計不可能有一種包羅萬象的規則確保PCR的成功，但遵循某些原則，則有助于引物的設計。(1) 引物長度PCR特異性一般通過引物長度和退火溫度來控制。引物的長度一般為 15-30bp，常用的是1827bp，但不應大于38bp。引物過短時會造成 Tm值過低，在酶反應溫度時不能與模板很好的配對； 引物過長時又會造成 Tm值過高，超過酶反應的最適溫度，還會導致其延伸溫度大于74 C，不適于 Taq DNA 聚合酶進行反應，而且合成長引物還會大大增加合成費用。( 2)引物堿基構成引物的 G+C

11、 含量以 4060%為宜，過高或過低都不利于引發反應，上下游引物的GC 含量不能相差太大。 其 Tm 值是寡核苷酸的解鏈溫度，即在一定鹽濃度條件下，50%寡核苷酸雙鏈解鏈的溫度，有效啟動溫度，一般高于Tm值510C。若按公式Tm=4 (G+C) +2 (A+T )估計引物的Tm值，則有效引物的 Tm為5580C，其Tm值最好接近72 C以使復性條件最佳。引物中四種 堿基的分布最好是隨機的，不要有聚嘌呤或聚嘧啶的存在。尤其3端不應超過3個連續的G或C,因這樣會使引物在 G+C富集序列區錯誤引發。( 3)引物二級結構 引物二級結構包括引物自身二聚體、發卡結構、引物間二聚體等。這些因素會影響引物和模

12、 板的結合從而影響引物效率。對于引物的3末端形成的二聚體，應控制其AG大于-5.0 kcal/mol或少于三個連續的堿基互補，因為此種情形的引物二聚體有進一步形成更穩定結構的可能性，引物 中間或 5端的要求可適當放寬。引物自身形成的發卡結構，也以 3端或近 3端對引物 -模板結合影 響更大；影響發卡結構的穩定性的因素除了堿基互補配對的鍵能之外，與莖環結構形式亦有很大 的關系。應盡量避免 3末端有發卡結構的引物。( 4)引物 3端序列引物 3末端和模板的堿基完全配對對于獲得好的結果是非常重要的，而引物3末端最后 5 到6 個核苷酸的錯配應盡可能的少。如果 3末端的錯配過多， 通過降低反應的退火溫

13、度來補償這種錯配不會有什么效果，反應幾乎注定要失敗。引物 3末端的另一個問題是防止一對引物內的同源性。應特別注意引物不能互補， 尤其是在 3末端。引物間的互補將導致不想要的引物雙鏈體的出現，這樣獲得的PCR產物其實是引物自身的擴增。這將會在引物雙鏈體產物和天然模板之間產生競爭PCR狀態，從而影響擴增成功。引物3末端的穩定性由引物 3末端的堿基組成決定，一般考慮末端5個堿基的AG。?G值是指 DNA 雙鏈形成所需的自由能， 該值反映了雙鏈結構內部堿基對的相對穩定性， 此值的大小對擴增有較大的影響。應當選用3端?G值較低（絕對值不超過 9）,負值大，則3末端穩定性高，擴增效率更高。引物的 3端的？

14、 G值過高，容易在錯配位點形成雙鏈結構并引發DNA聚合反應。需要注意的是，如擴增編碼區域，引物3端不要終止于密碼子的第3位，因密碼子的第 3位易發生簡并，會影響擴增特異性與效率。另外末位堿基為A的錯配效率明顯高于其他 3個堿基，因此應當避免在引物的 3端使用堿基 A。（5）引物的5端弓I物的5端限定著PCR產物的長度，它對擴增特異性影響不大。因此，可以被修飾而不影響 擴增的特異性。引物 5端修飾包括：加酶切位點；標記生物素、熒光、地高辛、Eu3+等；弓I入蛋白質結合DNA序列；引入突變位點、插入與缺失突變序列和引入一啟動子序列等。對于引入一至兩 個酶切位點，應在后續方案設計完畢后確定，便于后期

15、的克隆實驗，特別是在用于表達研究的目 的基因的克隆工作中。（6）引物的特異性引物與非特異擴增序列的同源性不要超過70%或有連續8個互補堿基同源，特別是與待擴增的模板DNA之間要沒有明顯的相似序列。2 .酶及其濃度Taq DNA多聚酶是耐熱 DNA聚合酶，是從水生棲熱菌（Thermus aquaticus）中分離的。Taq DNA 聚合酶是一個單亞基，分子量為94 000 Da。具有5-3的聚合酶活力，5-3的外切核酸酶活力，無3-5的外切核酸酶活力，會在 3末端不依賴模板加入 1個脫氧核苷酸（通常為 A，故PCR產 物克隆中有與之匹配的 T載體），在體外實驗中，Taq DNA聚合酶的出錯率為1

16、0-410-5。此酶的 發現使PCR廣泛的被應用。此酶具有以下特點：（1） 耐高溫，在70C下反應2小時后其殘留活性在 90%以上，在93C下反應2小時后其殘 留活性是仍能保持 60%，而在95C下反應2小時后為原來的40%。（2）在熱變性時不會被鈍化，故不必在擴增反應的每輪循環完成后再加新酶。3） 一般擴增的PCR產物長度可達2.0 kb，且特異性也較高。PCR的廣泛應用得益于此酶，目前各試劑公司中開發了多種類型的Taq酶，有用于長片段擴增的酶，擴增長度極端可達 40kb;有在常溫條件下即可應用的常溫 PCR聚合酶；還有針對不同實 驗對象的酶等。一典型的PCR反應約需的酶量為 2.5u （總

17、反應體積為504時），濃度過高可引起非特異性擴 增，濃度過低則合成產物量減少。3. dNTP的質量與濃度dNTP的質量與濃度和PCR擴增效率有密切關系，dNTP粉呈顆粒狀，如保存不當易變性失去 生物學活性。dNTP溶液呈酸性，使用時應配成高濃度后，以1M NaOH或1M Tris。HCl的緩沖液將其pH調節到7.07.5,小量分裝，-20 C冰凍保存。多次凍融會使 dNTP降解。在PCR反應中， dNTP應為50200心。1/1，尤其是注意4種dNTP的濃度要相等（等摩爾配制），如其中任何一種 濃度不同于其它幾種時 （偏高或偏低），就會引起錯配。濃度過低又會降低 PCR產物的產量。dNTP 能

18、與Mg2+結合，使游離的 Mg2+濃度降低。4 .模板（靶基因）核酸模板核酸的量與純化程度，是PCR成敗與否的關鍵環節之一，傳統的 DNA純化方法通常采用SDS和蛋白酶K來消化處理標本。SDS的主要功能是：溶解細胞膜上的脂類與蛋白質，因而溶 解膜蛋白而破壞細胞膜，并解離細胞中的核蛋白，SDS還能與蛋白質結合而沉淀；蛋白酶 K能水解消化蛋白質，特別是與 DNA結合的組蛋白，再用有機溶劑（酚與氯仿抽）抽提除去蛋白質和其 它細胞組份，用乙醇或異丙醇沉淀核酸，該核酸即可作為模板用于 PCR反應。一般臨床檢測標本， 可采用快速簡便的方法溶解細胞，裂解病原體，消化除去染色體的蛋白質使靶基因游離，直接用 于

19、PCR擴增。模板DNA投入量對于細菌基因組 DNA 般在110ng/川，實驗中模板濃度常常需要優化，般可選擇幾個濃度梯度（濃度差以10倍為一個梯度）。在PCR反應中，過高的模板投入量往往會導致PCR實驗的失敗。5. Mg2+濃度Mg2+對PCR擴增的特異性和產量有顯著的影響，在一般的PCR反應中，各種dNTP濃度為200mol/l時，Mg2+濃度為1.52.0mmol/l為宜。Mg2+濃度過高，反應特異性降低，出現非特異擴 增，濃度過低會降低 Taq DNA聚合酶的活性，使反應產物減少。 一般廠商提供的Taq DNA聚合酶 均有相應的緩沖液，而 Mg2+也已添加，如果特殊實驗應采用無Mg2+的

20、緩沖液，在PCR反應體系中添加一定量的 Mg 2+。三、PCR反應特點PCR反應具有以下特點：1 強特異性PCR反應的特異性決定因素為：（1）引物與模板 DNA特異性的結合；（2）堿基配對原則；（3）Taq DNA聚合酶合成反應的忠實性；（4）靶基因的特異性與保守性。其中引物與模板的正確結合是關鍵，引物與模板的結合及引物鏈的延伸是遵循堿基配對原則 的。聚合酶合成反應的忠實性及Taq DNA聚合酶耐高溫性，使反應中模板與引物的結合（復性）可以在較高的溫度下進行，結合的特異性大大增加，被擴增的靶基因片段也就能保持很高的正確度。 再通過選擇特異性和保守性高的靶基因區，其特異性程度就更高。2 高靈敏度

21、PCR產物的生成量是以指數方式增加的，能將皮克（pg=10-12g）量級的起始待測模板擴增到6微克（乜=10- g）水平。能從100萬個細胞中檢出一個靶細胞；在病毒的檢測中，PCR的靈敏度可達3個RFU （空斑形成單位）；在細菌學中最小檢出率為 3個細菌。3 快速簡便PCR反應用耐高溫的Taq DNA聚合酶，一次性地將反應液加好后，即在PCR儀上進行變性-退火-延伸反應，反應一般在24小時完成。擴增產物常用電泳分析，操作簡單易推廣，如采用特殊PCR儀（熒光時時定量 PCR儀）則可全程監測 PCR反應的結果，故耗時將更短。4 .低純度模板不需要分離病毒或細菌及培養細胞，DNA粗制品及總RNA等均

22、可作為擴增模板。可直接用臨床標本如血液、體腔液、洗嗽液、毛發、細胞、活組織等粗制的DNA擴增檢測。第二節 PCR擴增反應的實施一、PCR反應的條件PCR反應條件為溫度、時間和循環次數。1 溫度與時間的設置基于PCR原理三步驟而設置變性-退火-延伸三個溫度點。在標準反應中采用三溫度點法，雙 鏈DNA在9095C變性，再迅速冷卻至 4060C,引物退火并結合到靶序列上，然后快速升溫 至7075C，在Taq DNA聚合酶的作用下，使引物鏈沿模板延伸。 對于較短靶基因（長度為100 300bp時）可采用二溫度點法，除變性溫度外、退火與延伸溫度可合二為一，一般采用94C變性,65 C左右退火與延伸（此溫

23、度 Taq DNA酶仍有較高的催化活性）。( 1)變性溫度與時間：變性溫度低，解鏈不完全是導致PCR 失敗的最主要原因。一般情況下，93 C94C lmin足以使模板DNA變性，若低于93C則需延長時間，但溫度不能過高，因為 高溫環境對酶的活性有影響。 此步若不能使靶基因模板或 PCR 產物完全變性， 就會導致 PCR 失敗。(2) 退火(復性)溫度與時間：退火溫度是影響PCR 特異性的較重要因素。變性后溫度快速冷卻至40C60C，可使引物和模板發生結合。由于模板DNA比引物復雜得多，引物和模板之間的碰撞結合機會遠遠高于模板互補鏈之間的碰撞。退火溫度與時間，取決于引物的長度、堿 基組成及其濃度

24、，還有靶基序列的長度。對于20個核苷酸，G+C含量約50%的引物，55C為選擇最適退火溫度的起點較為理想。引物的復性溫度可通過以下公式幫助選擇合適的溫度：Tm 值(解鏈溫度) =4(G+C) 2(A+T)復性溫度=Tm值-(510 C )在 Tm 值允許范圍內， 選擇較高的復性溫度可大大減少引物和模板間的非特異性結合，提高 PCR反應的特異性。復性時間一般為3060sec,足以使引物與模板之間完全結合。(3) 延伸溫度與時間：Taq DNA聚合酶的生物學活性： 7080 C, 150核苷酸/S/酶分子；7 0C, 60核苷酸/S/酶分子；55C, 24核苷酸/S/酶分子；高于90C時，DNA合

25、成幾乎不能進行。(4) PCR反應的延伸溫度一般選擇在7075C之間，常用溫度為 72C,過高的延伸溫度不利于引物和模板的結合。PCR延伸反應的時間，可根據待擴增片段的長度而定，一般1kb以內的DNA片段，延伸時間1min是足夠的。34kb的靶序列需34min ;擴增10kb需延伸至15min。 延伸進間過長會導致非特異性擴增帶的出現。對低濃度模板的擴增，延伸時間要稍長些。2循環次數循環次數決定 PCR 擴增程度。 PCR 循環次數主要取決于模板 DNA 的濃度，一般的循環次數 選在 30 40 次之間，循環次數越多，非特異性產物的量亦隨之增多。二、PCR 擴增產物分析PCR 產物是否為特異性

26、擴增，其結果是否準確可靠，必須對其進行嚴格的分析與鑒定，才能 得出正確的結論。 PCR 產物的分析，可依據研究對象和目的不同而采用不同的分析方法。1 凝膠電泳分析： PCR 產物電泳， EB 溴乙錠染色紫外儀下觀察，初步判斷產物的特異性。 P CR產物片段的大小應與預計的一致，特別是多重PCR,應用多對引物，其產物片斷都應符合預訐的大小，這是起碼條件。( 1)瓊脂糖凝膠電泳：通常應用1 2%的瓊脂糖凝膠，供檢測用。( 2)聚丙烯酰胺凝膠電泳： 610%聚丙烯酰胺凝膠電泳分離效果比瓊脂糖好，條帶比較集中，可用于科研及檢測分析。2酶切分析：根據 PCR 產物中限制性內切酶的位點，用相應的酶切、電泳

27、分離后，獲得符 合理論的片段，此法既能進行產物的鑒定，又能對靶基因分型，還能進行變異性研究。3分子雜交：分子雜交是檢測 PCR 產物特異性的有力證據，也是檢測 PCR 產物堿基突變的 有效方法。4Southern 印跡雜交： 在兩引物之間另合成一條寡核苷酸鏈 (內部寡核苷酸)標記后做探針， 與 PCR 產物雜交。 此法既可作特異性鑒定， 又可以提高檢測 PCR 產物的靈敏度， 還可知其分子量 及條帶形狀，主要用于科研。5斑點雜交：將 PCR 產物點在硝酸纖維素膜或尼膜薄膜上，再用內部寡核苷酸探針雜交， 觀察有無著色斑點，主要用于 PCR 產物特異性鑒定及變異分析。6核酸序列分析：是檢測 PCR

28、 產物特異性的最可靠方法。三、PCR 結果異常分析PCR產物的電泳檢測時間一般為48h以內，有些最好于當日電泳檢測，大于48h后帶型不規則甚致消失。1 假陰性，不出現擴增條帶PCR反應的關鍵環節有： 模板核酸的制備；引物的質量與特異性； 酶的質量及活性； PCR循環條件。尋找原因亦應針對上述環節進行分析研究。(1) 模板： 模板中含有雜蛋白質； 模板中含有Taq酶抑制劑； 模板中蛋白質沒有消化除凈，特別是染色體中的組蛋白；在提取制備模板時丟失過多，或吸入酚；模板核酸變性不徹底。在酶和引物質量好時，不出現擴增帶，極有可能是標本的消化處理，模板核酸提取過程出了毛病，因而要配制有效而穩定的消化處理液

29、，其程序亦應固定不宜隨意更改。(2) 酶失活：需更換新酶，或新舊兩種酶同時使用，以分析是否因酶的活性喪失或不夠而導致假陰性。需注意的是有時忘加Taq酶或溴乙錠。(3) 引物：引物質量、引物的濃度、兩條引物的濃度是否對稱，是PCR失敗或擴增條帶不 理想、容易彌散的常見原因。有些批號的引物合成質量有問題，兩條引物一條濃度高，一條濃度低，造成低效率的不對稱擴增，對策為： 選定一個好的引物合成單位。 引物的濃度不僅要看 0D值，更要注重引物原液做瓊脂糖凝膠電泳，一定要有引物條帶出現，而且兩引物帶的亮度應大體一致，如一條引物有條帶，一條引物無條帶，此時做PCR有可能失敗，應和引物合成單位協商解決。如一條

30、引物亮度高，一條亮度低，在稀釋引物時要平衡其濃 度。 引物應高濃度小量分裝保存，防止多次凍融或長期放冰箱冷藏部分，導致引物變質降解失 效。引物設計不合理，如引物長度不夠，引物之間形成二聚體等。(4) Mg 2+濃度：Mg2+離子濃度對PCR擴增效率影響很大，濃度過高可降低PCR擴增的特異 性，濃度過低則影響 PCR擴增產量甚至使PCR擴增失敗而不出擴增條帶。(5) 反應體積的改變：通常進行 PCR擴增采用的體積為 20川、30川、50山或100出,用多大體 積進行PCR擴增，是根據科研和臨床檢測不同目的而設定， 在做小體積如20川后，再做大體積時， 一定要模索條件，否則容易失敗。(6) 物理原因：變性對 PCR擴增來說相當重要，如變性溫度低，變性時間短，極有可能出 現假陰性；退火溫度過低，可致非特異性擴增而降低特異性擴增效率退火溫度過高影響引物與模板 的結合而降低PCR擴增效率。有時還有必要用標準的溫度計，檢測一下擴增儀或水溶鍋內的變性、 退火和延伸溫度，這也是 PCR失敗的原因之一。(7) 靶序列變異：如