65.020.30 B 47DB51四川省地方標準DB 51/T 11852011桑蠶微粒子病診斷技術規程2011 - 01-25發布2011 - 03-01實施四川省質量技術監督局發布DB51/T 11852011前言本標準按照GB/T1.1-2009給出的規則起草。本標準由四川省農業廳提出并歸口。本標準由四川省質量技術監督局發布。本標準起草單位：四川省蠶業管理總站、四川省農業科學院生物技術核技術研究所。本標準主要起草人：吳 鋼、蔡平鐘、朱洪順、謝忠良、張學清、馬露蕓。3桑蠶微粒子病診斷技術規程1 范圍本標準規定了四川省桑蠶微粒子病診斷技術要求。本標準適用于四川省桑蠶微粒子病的診斷。2 規范性引用文件下列文件對于本文件的應用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，僅所注日期的版本適用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改單）適用于本文件。GB/T6682 分析實驗室用水規格和試驗方法GB/T20395 桑蠶微粒子病病原鑒定方法DB51/T844 桑蠶微粒子病防治技術規程3 試劑3.1 濃鹽酸w(HCl)=30。3.2 氫氧化鉀溶液w(KOH)=2。3.3 過氧化氫溶液w(H2O2)=10。3.4 分析用水按GB/T6682規定執行。4 儀器、設備4.1 普通光學顯微鏡、相襯（相差）顯微鏡，放大倍數1540倍或1640倍；生化培養箱（溫控范圍10 50 ）、冰箱；天平（感量：0.1 g）、離心機。4.2 離心管、無紡布濾紙；載玻片、蓋玻片、測微尺；容量瓶、量筒、燒杯、二重皿；乳缽、乳棒；解剖剪、鑷子、橡皮吸管；樣品袋、凍存管（1.8 mL、5 mL）。5 診斷5.1 肉眼診斷5.1.1 外觀觀察通過肉眼觀察，蠶的不同發育階段是否具有下列癥狀：a) 小蠶期：收蟻后不疏毛、體色深暗、體軀瘦小、發育緩慢、重癥死亡；群體發育不齊。b) 大蠶期：表皮縮皺、體呈銹色；體壁出現微細不規則黑褐色病斑，以尾角末端、氣門周圍和胸腹足外側部位較多；蛻皮困難，嚴重死亡；群體發育不齊。c) 蛹蛾期：蛹表皮無光澤、反應遲鈍、腹部松弛，體壁出現微細不規則黑褐色病斑，感病嚴重的不化蛾、死亡；蛾羽化展翅不良、鱗毛脫落、腹部膨大、節間松弛，交配能力差，產卵少。d) 卵期：卵形不正，排列不齊、多重疊卵，卵產附差、易脫落，不受精卵和死卵多；催青期發育不整齊。5.1.2 解剖觀察將外觀觀察的具有上述大蠶期典型病癥的病蠶，用解剖剪從背中線剪開，肉眼觀察絲腺是否有乳白色膿皰狀斑塊。5.1.3 判定通過外觀觀察，蠶的不同發育階段出現5.1.1表述癥狀之一的，可疑似為蠶微粒子病；通過解剖觀察，大蠶期病蠶絲腺出現可見的乳白色膿皰狀斑塊時，可確診為蠶微粒子病。5.2 顯微鏡診斷5.2.1 樣品采集采集5.1.1描述的典型癥狀蠶、蛹、蛾、卵。采集的樣品置于樣品袋或凍存管中，做好記載。5.2.2 樣品處置5.2.2.1 樣品保存采集的樣品每份混合均勻后再分成2份，其中1份作為檢樣按照5.2.2.2制備檢驗，另1份作為備樣，保存于0 4 冰箱中，保存期30 d60 d。5.2.2.2 樣本制備5.2.2.2.1 不同發育時期的樣品，按照下列方法制樣：a) 蟻蠶樣品置生化培養箱于溫度29 0.5 、相對濕度85 %條件下，放置2 d3 d。b) 小蠶期、大蠶期、蛹期、蛾期樣品置生化培養箱于溫度29 32 、相對濕度85條件下，放置2 d5 d；大蠶期、蛹期經高溫處置的樣品，可用解剖剪沿背中線剪開，摘取其中腸，每1頭5頭蠶或1粒2粒蛹的中腸為1個樣。c) 卵期樣品解除滯育后，在生化培養箱溫度29 0.5 、相對濕度85的條件下催青；孵化后待其自然死亡。5.2.2.2.2 將上述制備的樣本每份分別置于1個乳缽孔中，每孔各放1個乳棒，磨碎；滴入4滴10滴氫氧化鉀溶液w(KOH)= 2，再次研細。5.2.2.2.3 按照乳缽序號，將磨碎液用乳棒點樣至載玻片，蓋上蓋玻片，制成鏡檢樣本。5.2.3 顯微鏡檢查5.2.3.1 直接觀察法將鏡檢樣本，置于顯微鏡（1540倍或1640倍）下觀察，每個樣本觀察不少于20個視野，觀察有無微粒子孢子。5.2.3.2 離心沉淀法將5.2.2.2.2制備的磨碎液，用無紡布濾紙過濾后，將濾液移入離心管中，經3000 r/min離心3 min，傾去上清夜，沉淀物振蕩制鏡檢樣本，置于顯微鏡（1540倍或1640倍）下觀察，每個樣本觀察不少于20個視野，觀察有無微粒子孢子。5.2.3.3 酸溶解法將檢出有微粒子孢子的磨碎液吸取2滴，分別滴于載玻片兩端，自然干燥后在其中1點加1滴濃鹽酸w(HCl)=30，另1點作對照，在30生化培養箱中放置10 min20 min后，蓋上蓋玻片鏡檢（1540倍或1640倍）。如果樣本已干，可加無菌水1滴。經過酸處理的樣本，微粒子孢子溶解消失，真菌孢子保持原狀。5.2.3.4 過氧化氫法將5.2.3.1、5.2.3.2鏡檢出有微粒子孢子原液吸取1滴，滴于載玻片上，再將過氧化氫溶液w(H2O2)=101滴2滴滴于孢子液中，蓋上蓋玻片，經過10 min30 min，相襯（相差）顯微鏡鏡檢（1540倍或1640倍），活微粒子孢子釋放出極絲。5.2.4 判定當鏡檢發現孢子呈長卵圓形，大小為3.6 m3.8 m2.0 m2.3 m，呈淡綠色，折光性強，中間隱約可見1根黑色線狀物，表面光滑，孢子活潑，多左右擺動，有時可見