Sohlh2負(fù)向調(diào)控HIF1α：抑制缺氧驅(qū)動的上皮性卵巢癌細(xì)胞EMT新機(jī)制一、引言1.1研究背景卵巢癌作為女性生殖系統(tǒng)中最為致命的惡性腫瘤之一，嚴(yán)重威脅著女性的生命健康與生活質(zhì)量。據(jù)世界衛(wèi)生組織國際癌癥研究機(jī)構(gòu)（IARC）發(fā)布的2020年全球癌癥負(fù)擔(dān)數(shù)據(jù)顯示，卵巢癌的全球新發(fā)病例約為31.3萬，死亡病例約為20.7萬，其發(fā)病率在女性惡性腫瘤中位居第七，死亡率則高居第八。在中國，卵巢癌同樣是女性生殖系統(tǒng)惡性腫瘤死亡的主要原因之一。由于卵巢癌早期癥狀隱匿，缺乏有效的早期篩查手段，超過70%的患者在確診時已處于晚期。上皮性卵巢癌（EOC）是卵巢癌中最為常見的組織學(xué)類型，約占所有卵巢癌病例的90%。其發(fā)病機(jī)制復(fù)雜，涉及多個基因和信號通路的異常改變。盡管手術(shù)治療與以鉑類為基礎(chǔ)的化療在卵巢癌治療中取得了一定進(jìn)展，但患者的5年生存率仍然較低，徘徊在30%-40%之間。復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移是導(dǎo)致上皮性卵巢癌患者治療失敗和死亡的主要原因。腫瘤細(xì)胞的轉(zhuǎn)移是一個多步驟、復(fù)雜的過程，涉及腫瘤細(xì)胞脫離原發(fā)灶、侵襲周圍組織、進(jìn)入血液循環(huán)或淋巴系統(tǒng)，并在遠(yuǎn)處器官定植生長。其中，上皮間質(zhì)化轉(zhuǎn)變（EMT）在腫瘤轉(zhuǎn)移過程中發(fā)揮著關(guān)鍵作用。EMT是指上皮細(xì)胞在特定的生理和病理條件下，逐漸喪失上皮細(xì)胞的特性，如細(xì)胞極性和細(xì)胞間連接，同時獲得間質(zhì)細(xì)胞的特性，如遷移和侵襲能力。在EMT過程中，上皮細(xì)胞的標(biāo)志性蛋白，如E-鈣黏蛋白（E-cadherin）表達(dá)下調(diào)，而間質(zhì)細(xì)胞的標(biāo)志性蛋白，如波形蛋白（Vimentin）和N-鈣黏蛋白（N-cadherin）表達(dá)上調(diào)。這種細(xì)胞表型和分子特征的改變使得腫瘤細(xì)胞能夠突破上皮屏障，侵入周圍組織和血管，進(jìn)而發(fā)生遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移。研究表明，EMT不僅與腫瘤的轉(zhuǎn)移密切相關(guān)，還與腫瘤的耐藥性、干細(xì)胞特性以及不良預(yù)后相關(guān)。在卵巢癌中，EMT的發(fā)生與腫瘤的侵襲、轉(zhuǎn)移以及復(fù)發(fā)密切相關(guān)，抑制EMT過程有望成為卵巢癌治療的新靶點。缺氧是實體腫瘤微環(huán)境的重要特征之一。由于腫瘤組織的快速生長和血管生成相對不足，導(dǎo)致腫瘤內(nèi)部氧氣供應(yīng)受限，形成缺氧微環(huán)境。缺氧誘導(dǎo)因子1α（HIF1α）是細(xì)胞在缺氧條件下產(chǎn)生的一種關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子，它能夠調(diào)節(jié)一系列基因的表達(dá)，以適應(yīng)缺氧環(huán)境。在缺氧條件下，HIF1α的穩(wěn)定性增加，其蛋白水平迅速升高，并與缺氧反應(yīng)元件（HRE）結(jié)合，激活下游靶基因的轉(zhuǎn)錄。這些靶基因參與了腫瘤細(xì)胞的能量代謝、血管生成、細(xì)胞增殖、凋亡以及轉(zhuǎn)移等多個生物學(xué)過程。研究發(fā)現(xiàn)，HIF1α在多種腫瘤中高表達(dá)，并且與腫瘤的惡性程度、轉(zhuǎn)移潛能以及不良預(yù)后密切相關(guān)。在卵巢癌中，HIF1α的表達(dá)水平與腫瘤的分期、分級以及轉(zhuǎn)移密切相關(guān)，高表達(dá)HIF1α的卵巢癌患者預(yù)后較差。此外，HIF1α還能夠通過調(diào)節(jié)EMT相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子的表達(dá)，促進(jìn)卵巢癌細(xì)胞的EMT過程，從而增強(qiáng)腫瘤細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移能力。Sohlh2是一種在生殖系統(tǒng)中高度表達(dá)的轉(zhuǎn)錄因子，其編碼基因位于Xq23染色體區(qū)域。最初的研究發(fā)現(xiàn)Sohlh2在卵巢發(fā)育和卵泡生成過程中發(fā)揮著重要作用。近年來，越來越多的研究表明Sohlh2與腫瘤的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。在卵巢癌中，Sohlh2的表達(dá)水平與腫瘤的病理類型、分期以及預(yù)后相關(guān)。然而，Sohlh2在卵巢癌中的具體作用機(jī)制尚不完全清楚。有研究報道Sohlh2可能通過調(diào)節(jié)卵巢癌干細(xì)胞的分化和增殖，影響卵巢癌的發(fā)生發(fā)展。但Sohlh2是否通過調(diào)控HIF1α參與卵巢癌的EMT過程，目前尚未見報道。綜上所述，上皮性卵巢癌的高死亡率和高復(fù)發(fā)率嚴(yán)重影響患者的生存和預(yù)后，EMT在腫瘤轉(zhuǎn)移中起著關(guān)鍵作用，HIF1α作為缺氧微環(huán)境下的關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子，對EMT具有重要的調(diào)控作用，而Sohlh2與卵巢癌的關(guān)系也逐漸受到關(guān)注。因此，深入研究Sohlh2通過下調(diào)HIF1α抑制缺氧誘導(dǎo)的上皮性卵巢癌細(xì)胞EMT的分子機(jī)制，不僅有助于揭示上皮性卵巢癌轉(zhuǎn)移的新機(jī)制，還為開發(fā)針對上皮性卵巢癌的靶向治療策略提供理論依據(jù)和實驗基礎(chǔ)。1.2研究目的本研究旨在深入探究Sohlh2通過下調(diào)HIF1α抑制缺氧誘導(dǎo)上皮性卵巢癌細(xì)胞EMT的具體機(jī)制。通過一系列體內(nèi)和體外實驗，全面分析Sohlh2、HIF1α以及EMT相關(guān)標(biāo)志物在缺氧條件下的表達(dá)變化，明確Sohlh2對HIF1α表達(dá)的調(diào)控作用，以及這種調(diào)控如何影響上皮性卵巢癌細(xì)胞的EMT過程和生物學(xué)行為。同時，進(jìn)一步探索Sohlh2-HIF1α信號軸在卵巢癌轉(zhuǎn)移中的作用及潛在的分子通路，為上皮性卵巢癌的治療提供新的靶點和理論依據(jù)，以期為改善上皮性卵巢癌患者的預(yù)后提供新的策略和方向。1.3研究意義本研究深入探究Sohlh2通過下調(diào)HIF1α抑制缺氧誘導(dǎo)上皮性卵巢癌細(xì)胞EMT的機(jī)制，具有重要的理論意義和潛在的臨床應(yīng)用價值。在理論層面，有助于全面深入地揭示上皮性卵巢癌轉(zhuǎn)移的分子機(jī)制。當(dāng)前，雖然對卵巢癌轉(zhuǎn)移的研究取得了一定進(jìn)展，但仍存在諸多未知。本研究聚焦于Sohlh2、HIF1α和EMT之間的相互關(guān)系，有望發(fā)現(xiàn)新的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)和信號通路，填補(bǔ)這一領(lǐng)域在分子機(jī)制方面的空白，進(jìn)一步完善對卵巢癌轉(zhuǎn)移過程的理解，為后續(xù)相關(guān)研究提供堅實的理論基礎(chǔ)和全新的研究方向。在臨床應(yīng)用方面，為上皮性卵巢癌的治療提供了全新的靶點和策略。卵巢癌的高死亡率和高復(fù)發(fā)率主要源于其轉(zhuǎn)移特性，而EMT在其中起著關(guān)鍵作用。若能明確Sohlh2-HIF1α信號軸對EMT的調(diào)控作用，就可以針對性地開發(fā)新的治療方法，如設(shè)計以Sohlh2或HIF1α為靶點的小分子抑制劑，或通過基因治療手段調(diào)節(jié)Sohlh2的表達(dá)，從而抑制卵巢癌細(xì)胞的EMT過程，減少腫瘤的轉(zhuǎn)移和復(fù)發(fā)，提高患者的生存率和生活質(zhì)量。此外，Sohlh2和HIF1α還可能作為新的生物標(biāo)志物，用于卵巢癌的早期診斷、預(yù)后評估和療效監(jiān)測，有助于實現(xiàn)卵巢癌的精準(zhǔn)醫(yī)療。二、理論基礎(chǔ)2.1上皮性卵巢癌概述上皮性卵巢癌（EpithelialOvarianCancer，EOC）是指來源于卵巢上皮組織的惡性腫瘤，是卵巢癌中最為常見的病理類型，約占所有卵巢癌病例的90%。卵巢上皮組織覆蓋于卵巢表面，在各種內(nèi)外因素的作用下，卵巢上皮細(xì)胞發(fā)生異常增殖和分化，進(jìn)而發(fā)展為上皮性卵巢癌。上皮性卵巢癌的發(fā)病率在女性生殖系統(tǒng)惡性腫瘤中占據(jù)重要地位。據(jù)全球癌癥統(tǒng)計數(shù)據(jù)顯示，其發(fā)病率呈逐年上升的趨勢，嚴(yán)重威脅著女性的生命健康。在我國，隨著人口老齡化的加劇以及生活方式的改變，上皮性卵巢癌的發(fā)病率也呈現(xiàn)出增長態(tài)勢。盡管手術(shù)、化療和靶向治療等綜合治療手段在一定程度上改善了患者的預(yù)后，但上皮性卵巢癌的死亡率仍然居高不下，在女性生殖系統(tǒng)惡性腫瘤中位居首位。這主要是因為上皮性卵巢癌起病隱匿，早期癥狀不明顯，缺乏有效的早期篩查方法，大多數(shù)患者在確診時已處于晚期，錯過了最佳治療時機(jī)。晚期上皮性卵巢癌患者往往會出現(xiàn)腫瘤的廣泛轉(zhuǎn)移，包括盆腹腔內(nèi)的種植轉(zhuǎn)移、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移以及遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移等。轉(zhuǎn)移后的腫瘤細(xì)胞難以徹底清除，容易導(dǎo)致疾病復(fù)發(fā)，嚴(yán)重影響患者的生存率和生活質(zhì)量。上皮性卵巢癌還會給患者及其家庭帶來沉重的經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)和心理壓力，對社會醫(yī)療資源造成巨大的消耗。因此，深入研究上皮性卵巢癌的發(fā)病機(jī)制和轉(zhuǎn)移機(jī)制，尋找有效的治療靶點和治療策略，對于降低其發(fā)病率和死亡率、改善患者預(yù)后具有至關(guān)重要的意義。2.2上皮間質(zhì)化轉(zhuǎn)變（EMT）2.2.1EMT的定義和過程上皮間質(zhì)化轉(zhuǎn)變（Epithelial-MesenchymalTransition，EMT）是一個在胚胎發(fā)育、組織修復(fù)以及腫瘤轉(zhuǎn)移等過程中發(fā)揮關(guān)鍵作用的生物學(xué)過程。在這一過程中，上皮細(xì)胞發(fā)生一系列顯著的變化，逐漸失去其原本的上皮細(xì)胞特性。上皮細(xì)胞通常具有緊密的細(xì)胞間連接，如緊密連接、橋粒和黏著連接，這些連接使得上皮細(xì)胞能夠形成連續(xù)的細(xì)胞層，起到屏障作用。同時，上皮細(xì)胞具有明顯的極性，細(xì)胞的頂面和底面具有不同的結(jié)構(gòu)和功能，這有助于其執(zhí)行特定的生理功能。然而，在EMT過程中，上皮細(xì)胞的這些特性逐漸喪失。緊密連接蛋白如閉合蛋白（Occludin）和密封蛋白（Claudin）的表達(dá)下調(diào)，導(dǎo)致細(xì)胞間連接松弛，細(xì)胞之間的黏附力減弱。細(xì)胞極性相關(guān)的蛋白復(fù)合物，如Par、Crumbs和Scribble復(fù)合物的功能受到影響，使得上皮細(xì)胞的極性逐漸消失。隨著上皮細(xì)胞特性的喪失，其開始獲得間質(zhì)細(xì)胞的特性。間質(zhì)細(xì)胞具有較強(qiáng)的遷移和侵襲能力，這主要得益于其表達(dá)的一些特異性蛋白。波形蛋白（Vimentin）是間質(zhì)細(xì)胞的標(biāo)志性蛋白之一，在EMT過程中，上皮細(xì)胞的波形蛋白表達(dá)上調(diào)。波形蛋白形成的中間絲網(wǎng)絡(luò)能夠為細(xì)胞提供結(jié)構(gòu)支持，增強(qiáng)細(xì)胞的柔韌性和運(yùn)動能力。N-鈣黏蛋白（N-cadherin）的表達(dá)也會增加，N-鈣黏蛋白主要介導(dǎo)間質(zhì)細(xì)胞之間的黏附，其表達(dá)增加有助于間質(zhì)細(xì)胞在遷移過程中與周圍細(xì)胞相互作用。此外，上皮細(xì)胞還會表達(dá)一些基質(zhì)金屬蛋白酶（MatrixMetalloproteinases，MMPs），如MMP-2和MMP-9等。這些酶能夠降解細(xì)胞外基質(zhì)中的各種成分，如膠原蛋白、纖連蛋白等，為細(xì)胞的遷移和侵襲開辟道路。EMT的發(fā)生受到多種信號通路的精細(xì)調(diào)控。轉(zhuǎn)化生長因子β（TransformingGrowthFactor-β，TGF-β）信號通路是調(diào)控EMT的關(guān)鍵通路之一。TGF-β與其受體結(jié)合后，激活下游的Smad蛋白，Smad蛋白進(jìn)入細(xì)胞核，與其他轉(zhuǎn)錄因子相互作用，調(diào)控EMT相關(guān)基因的表達(dá)。Wnt信號通路也在EMT中發(fā)揮重要作用，Wnt蛋白與細(xì)胞膜上的受體結(jié)合，激活胞內(nèi)的β-連環(huán)蛋白（β-catenin），β-catenin進(jìn)入細(xì)胞核，促進(jìn)EMT相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子的表達(dá)。Notch信號通路通過細(xì)胞間的相互作用，調(diào)節(jié)細(xì)胞的命運(yùn)決定，在EMT過程中，Notch信號的激活能夠誘導(dǎo)上皮細(xì)胞向間質(zhì)細(xì)胞轉(zhuǎn)化。此外，表皮生長因子（EpidermalGrowthFactor，EGF）、成纖維細(xì)胞生長因子（FibroblastGrowthFactor，F(xiàn)GF）和缺氧誘導(dǎo)因子（Hypoxia-InducibleFactor，HIF）等信號通路也參與了EMT的調(diào)控。2.2.2EMT在腫瘤中的作用在腫瘤的發(fā)生發(fā)展過程中，EMT扮演著至關(guān)重要的角色，其對腫瘤細(xì)胞的侵襲、轉(zhuǎn)移和耐藥性等方面產(chǎn)生深遠(yuǎn)影響。EMT能夠顯著增強(qiáng)腫瘤細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移能力。在腫瘤原發(fā)部位，經(jīng)歷EMT的腫瘤細(xì)胞由于失去細(xì)胞間連接和極性，變得更加松散，能夠輕易突破上皮細(xì)胞層的屏障，侵入周圍的組織。這些具有間質(zhì)細(xì)胞特性的腫瘤細(xì)胞，憑借其高表達(dá)的遷移相關(guān)蛋白，如波形蛋白和N-鈣黏蛋白，以及分泌的基質(zhì)金屬蛋白酶，能夠降解細(xì)胞外基質(zhì)，在組織中開辟出遷移的路徑。腫瘤細(xì)胞通過侵襲周圍的血管或淋巴管，進(jìn)入血液循環(huán)或淋巴循環(huán)，從而實現(xiàn)遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移。一旦到達(dá)遠(yuǎn)處的組織器官，腫瘤細(xì)胞又可以通過間質(zhì)-上皮轉(zhuǎn)化（Mesenchymal-EpithelialTransition，MET）過程，重新獲得上皮細(xì)胞的特性，在新的部位定植生長，形成轉(zhuǎn)移瘤。研究表明，在乳腺癌、肺癌、結(jié)直腸癌等多種腫瘤中，發(fā)生EMT的腫瘤細(xì)胞更容易發(fā)生轉(zhuǎn)移，且患者的預(yù)后往往較差。EMT還與腫瘤細(xì)胞的耐藥性密切相關(guān)。腫瘤細(xì)胞在經(jīng)歷EMT后，其細(xì)胞內(nèi)的藥物轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白表達(dá)發(fā)生改變，導(dǎo)致對化療藥物的攝取減少或外排增加。一些ATP結(jié)合盒（ATP-BindingCassette，ABC）轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，如P-糖蛋白（P-glycoprotein，P-gp）和乳腺癌耐藥蛋白（BreastCancerResistanceProtein，BCRP）等，在EMT陽性的腫瘤細(xì)胞中表達(dá)上調(diào)，這些轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白能夠?qū)⒒熕幬锉贸黾?xì)胞外，降低細(xì)胞內(nèi)藥物濃度，從而使腫瘤細(xì)胞對化療藥物產(chǎn)生耐藥性。EMT過程中腫瘤細(xì)胞的代謝方式也發(fā)生改變，更傾向于利用無氧糖酵解提供能量，這種代謝方式的改變使得腫瘤細(xì)胞對化療藥物的敏感性降低。EMT陽性的腫瘤細(xì)胞還具有更強(qiáng)的DNA損傷修復(fù)能力，能夠在化療藥物造成DNA損傷后迅速修復(fù)，從而逃避化療藥物的殺傷作用。EMT賦予腫瘤細(xì)胞干細(xì)胞樣特性，使其具有更強(qiáng)的自我更新和分化能力。在腫瘤中，具有干細(xì)胞樣特性的腫瘤細(xì)胞被認(rèn)為是腫瘤復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移的根源。EMT過程中，腫瘤細(xì)胞表達(dá)一些干細(xì)胞相關(guān)的標(biāo)志物，如Oct4、Nanog和Sox2等，這些標(biāo)志物能夠維持腫瘤細(xì)胞的干性，使其能夠不斷增殖和分化，產(chǎn)生新的腫瘤細(xì)胞。具有干細(xì)胞樣特性的腫瘤細(xì)胞對放療、化療等傳統(tǒng)治療手段具有更強(qiáng)的抵抗能力，能夠在治療后存活下來，導(dǎo)致腫瘤的復(fù)發(fā)。2.2.3EMT在卵巢癌中的研究現(xiàn)狀在卵巢癌領(lǐng)域，EMT的研究一直是熱點，眾多研究表明EMT在卵巢癌的轉(zhuǎn)移和復(fù)發(fā)中發(fā)揮著關(guān)鍵作用。卵巢癌的轉(zhuǎn)移主要通過盆腹腔內(nèi)的種植轉(zhuǎn)移，而EMT過程促使卵巢癌細(xì)胞失去上皮細(xì)胞的特性，獲得間質(zhì)細(xì)胞的遷移和侵襲能力，使其能夠突破卵巢表面的上皮組織，進(jìn)入腹腔，并在腹腔內(nèi)的臟器表面種植生長。研究發(fā)現(xiàn)，在卵巢癌的腹水和轉(zhuǎn)移灶中，存在大量經(jīng)歷EMT的癌細(xì)胞，這些癌細(xì)胞高表達(dá)間質(zhì)細(xì)胞標(biāo)志物，如波形蛋白和N-鈣黏蛋白，而E-鈣黏蛋白的表達(dá)則明顯下調(diào)。通過對卵巢癌患者的臨床樣本分析，也發(fā)現(xiàn)EMT相關(guān)標(biāo)志物的表達(dá)與腫瘤的分期、轉(zhuǎn)移和預(yù)后密切相關(guān)。高表達(dá)間質(zhì)細(xì)胞標(biāo)志物的卵巢癌患者，其腫瘤分期往往較晚，更容易發(fā)生轉(zhuǎn)移，且預(yù)后較差。近年來，關(guān)于EMT在卵巢癌中的分子機(jī)制研究取得了一定進(jìn)展。研究發(fā)現(xiàn)，多種信號通路參與了卵巢癌中EMT的調(diào)控。TGF-β信號通路在卵巢癌中常常處于激活狀態(tài)，TGF-β能夠通過Smad依賴和非Smad依賴的途徑誘導(dǎo)EMT相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子的表達(dá)，如Snail、Slug和Twist等，這些轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合到E-鈣黏蛋白的啟動子區(qū)域，抑制其表達(dá)，從而促進(jìn)EMT的發(fā)生。Wnt/β-catenin信號通路在卵巢癌中也發(fā)揮重要作用，異常激活的Wnt信號能夠穩(wěn)定β-catenin，使其進(jìn)入細(xì)胞核，與轉(zhuǎn)錄因子TCF/LEF結(jié)合，激活EMT相關(guān)基因的表達(dá)。此外，Notch、EGF和HIF等信號通路也在卵巢癌EMT過程中相互作用，形成復(fù)雜的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)。針對EMT的靶向治療成為卵巢癌治療研究的新方向。一些研究嘗試通過抑制EMT相關(guān)信號通路來阻斷卵巢癌細(xì)胞的EMT過程，從而抑制腫瘤的轉(zhuǎn)移和復(fù)發(fā)。例如，使用TGF-β受體抑制劑能夠阻斷TGF-β信號傳導(dǎo)，抑制卵巢癌細(xì)胞的EMT和侵襲能力。針對Wnt/β-catenin信號通路的靶向藥物，如PORCN抑制劑，也在卵巢癌的研究中顯示出潛在的治療效果。然而，目前這些靶向治療方法仍處于臨床試驗階段，其療效和安全性還需要進(jìn)一步驗證。2.3缺氧與腫瘤微環(huán)境2.3.1腫瘤微環(huán)境中的缺氧現(xiàn)象腫瘤微環(huán)境（TumorMicroenvironment，TME）是指腫瘤細(xì)胞生長、增殖和轉(zhuǎn)移所處的周圍環(huán)境，它是一個由腫瘤細(xì)胞、間質(zhì)細(xì)胞、免疫細(xì)胞、細(xì)胞外基質(zhì)以及多種信號分子和代謝產(chǎn)物等組成的復(fù)雜生態(tài)系統(tǒng)。在這個系統(tǒng)中，缺氧是實體腫瘤微環(huán)境最為顯著的特征之一。腫瘤組織的快速增殖是導(dǎo)致缺氧的重要原因。腫瘤細(xì)胞具有不受控制的增殖能力，其增殖速度遠(yuǎn)遠(yuǎn)超過正常組織細(xì)胞。隨著腫瘤體積的不斷增大，腫瘤細(xì)胞對氧氣和營養(yǎng)物質(zhì)的需求也急劇增加。然而，腫瘤血管的生成卻相對滯后，無法滿足腫瘤細(xì)胞的高代謝需求。腫瘤血管在結(jié)構(gòu)和功能上存在異常，其形態(tài)不規(guī)則，血管壁不完整，缺乏正常的平滑肌層和基底膜。這些異常使得腫瘤血管的血液灌注不足，氧氣和營養(yǎng)物質(zhì)難以有效地輸送到腫瘤組織內(nèi)部。腫瘤血管還存在大量的動靜脈短路，進(jìn)一步減少了腫瘤組織的氧氣供應(yīng)。腫瘤組織內(nèi)部的高壓力也會壓迫血管，阻礙血液流動，加重缺氧程度。由于氧氣供應(yīng)不足，腫瘤組織內(nèi)部形成了缺氧微環(huán)境。研究表明，在許多實體腫瘤中，如乳腺癌、肺癌、結(jié)直腸癌和卵巢癌等，腫瘤組織內(nèi)的氧分壓（pO2）明顯低于正常組織。正常組織的氧分壓通常在30-80mmHg之間，而腫瘤組織內(nèi)的氧分壓常常低于10mmHg，甚至在某些區(qū)域可以低至1-2mmHg。這種缺氧微環(huán)境不僅存在于腫瘤的中心部位，還廣泛分布于腫瘤的周邊區(qū)域。缺氧區(qū)域的大小和分布與腫瘤的類型、大小、生長速度以及血管生成情況密切相關(guān)。在一些高度惡性的腫瘤中，缺氧區(qū)域更為廣泛，缺氧程度更為嚴(yán)重。腫瘤微環(huán)境中的缺氧現(xiàn)象并非均勻分布，而是呈現(xiàn)出異質(zhì)性。不同腫瘤細(xì)胞亞群所處的微環(huán)境氧含量存在差異，即使在同一腫瘤組織內(nèi)，不同部位的缺氧程度也不盡相同。這種缺氧異質(zhì)性使得腫瘤細(xì)胞對缺氧的適應(yīng)和反應(yīng)各不相同，進(jìn)一步增加了腫瘤的復(fù)雜性和治療難度。缺氧還會導(dǎo)致腫瘤微環(huán)境中的其他因素發(fā)生改變，如pH值降低、代謝產(chǎn)物堆積等，這些因素相互作用，共同影響腫瘤細(xì)胞的生物學(xué)行為。2.3.2缺氧對腫瘤細(xì)胞的影響缺氧作為腫瘤微環(huán)境的關(guān)鍵特征，對腫瘤細(xì)胞的生物學(xué)行為產(chǎn)生了深遠(yuǎn)的影響，在腫瘤的發(fā)生、發(fā)展、侵襲和轉(zhuǎn)移等多個過程中發(fā)揮著重要作用。缺氧能夠促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的增殖。在缺氧條件下，腫瘤細(xì)胞通過激活一系列信號通路來適應(yīng)缺氧環(huán)境，維持細(xì)胞的增殖能力。缺氧誘導(dǎo)因子1α（HIF1α）是細(xì)胞在缺氧條件下產(chǎn)生的關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子，它可以調(diào)節(jié)多種基因的表達(dá)，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的增殖。HIF1α通過激活葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白1（GLUT1）和己糖激酶2（HK2）等基因的表達(dá)，增加腫瘤細(xì)胞對葡萄糖的攝取和利用，為細(xì)胞增殖提供能量。HIF1α還可以調(diào)節(jié)細(xì)胞周期相關(guān)蛋白的表達(dá)，促進(jìn)細(xì)胞周期的進(jìn)展，加速腫瘤細(xì)胞的增殖。缺氧還可以通過激活磷脂酰肌醇-3激酶（PI3K）/蛋白激酶B（AKT）信號通路，抑制細(xì)胞凋亡，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的存活和增殖。缺氧能夠增強(qiáng)腫瘤細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移能力。缺氧誘導(dǎo)的EMT過程是腫瘤細(xì)胞獲得侵襲和轉(zhuǎn)移能力的重要機(jī)制之一。在缺氧條件下，HIF1α的表達(dá)上調(diào)，它可以直接或間接調(diào)控EMT相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子的表達(dá)，如Snail、Slug和Twist等。這些轉(zhuǎn)錄因子通過抑制上皮細(xì)胞標(biāo)志物E-鈣黏蛋白的表達(dá)，促進(jìn)間質(zhì)細(xì)胞標(biāo)志物波形蛋白和N-鈣黏蛋白的表達(dá)，從而誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞發(fā)生EMT，使其獲得更強(qiáng)的遷移和侵襲能力。缺氧還可以通過調(diào)節(jié)基質(zhì)金屬蛋白酶（MMPs）的表達(dá)，促進(jìn)細(xì)胞外基質(zhì)的降解，為腫瘤細(xì)胞的遷移和侵襲創(chuàng)造條件。MMP-2和MMP-9在缺氧條件下表達(dá)增加，它們能夠降解細(xì)胞外基質(zhì)中的膠原蛋白和纖連蛋白等成分，幫助腫瘤細(xì)胞突破基底膜，侵入周圍組織。缺氧在腫瘤血管生成中發(fā)揮著關(guān)鍵作用。腫瘤細(xì)胞在缺氧環(huán)境下會分泌多種血管生成因子，其中血管內(nèi)皮生長因子（VEGF）是最為重要的一種。HIF1α可以直接結(jié)合到VEGF基因的啟動子區(qū)域，促進(jìn)其轉(zhuǎn)錄和表達(dá)。VEGF能夠刺激血管內(nèi)皮細(xì)胞的增殖、遷移和管腔形成，促進(jìn)腫瘤血管的生成。缺氧還可以通過調(diào)節(jié)其他血管生成因子，如成纖維細(xì)胞生長因子（FGF）和血小板衍生生長因子（PDGF）等，協(xié)同促進(jìn)腫瘤血管的生成。腫瘤血管的生成不僅為腫瘤細(xì)胞提供了充足的氧氣和營養(yǎng)物質(zhì)，還為腫瘤細(xì)胞的轉(zhuǎn)移提供了途徑。缺氧還與腫瘤細(xì)胞的耐藥性密切相關(guān)。缺氧條件下，腫瘤細(xì)胞的代謝方式發(fā)生改變，更傾向于進(jìn)行無氧糖酵解，這使得腫瘤細(xì)胞對化療藥物的敏感性降低。缺氧還可以誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞產(chǎn)生多種耐藥相關(guān)蛋白，如P-糖蛋白（P-gp）和乳腺癌耐藥蛋白（BCRP）等，這些蛋白能夠?qū)⒒熕幬锉贸黾?xì)胞外，降低細(xì)胞內(nèi)藥物濃度，從而導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞對化療藥物產(chǎn)生耐藥性。缺氧還會影響腫瘤細(xì)胞的DNA損傷修復(fù)能力，使其能夠在化療藥物造成DNA損傷后迅速修復(fù)，逃避化療藥物的殺傷作用。2.4HIF1α的研究進(jìn)展2.4.1HIF1α的結(jié)構(gòu)和功能缺氧誘導(dǎo)因子1α（HIF1α）是一種在缺氧條件下發(fā)揮關(guān)鍵作用的轉(zhuǎn)錄因子，其結(jié)構(gòu)復(fù)雜且獨(dú)特，在細(xì)胞應(yīng)對缺氧環(huán)境的過程中具有不可或缺的功能。HIF1α屬于堿性螺旋-環(huán)-螺旋（bHLH）-PAS轉(zhuǎn)錄因子家族，其蛋白結(jié)構(gòu)主要包含多個功能結(jié)構(gòu)域。N端區(qū)域包含基本螺旋-環(huán)-螺旋（bHLH）結(jié)構(gòu)域和PAS結(jié)構(gòu)域，bHLH結(jié)構(gòu)域負(fù)責(zé)與DNA結(jié)合，識別并結(jié)合到靶基因啟動子區(qū)域的缺氧反應(yīng)元件（HRE）上，從而啟動基因轉(zhuǎn)錄。PAS結(jié)構(gòu)域則在蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用中發(fā)揮重要作用，它可以介導(dǎo)HIF1α與其他轉(zhuǎn)錄因子或調(diào)節(jié)蛋白的相互結(jié)合，形成轉(zhuǎn)錄調(diào)控復(fù)合物，共同調(diào)節(jié)基因表達(dá)。C端區(qū)域包含氧依賴降解結(jié)構(gòu)域（ODDD）、反式激活結(jié)構(gòu)域（TAD）等。ODDD是HIF1α在常氧條件下被降解的關(guān)鍵區(qū)域，在正常氧含量情況下，ODDD中的脯氨酸殘基會被脯氨酰羥化酶（PHD）羥基化修飾。羥基化后的脯氨酸能夠被馮?希佩爾-林道病腫瘤抑制蛋白（pVHL）識別并結(jié)合，隨后通過泛素-蛋白酶體途徑被降解，從而維持HIF1α在細(xì)胞內(nèi)的低水平表達(dá)。然而，在缺氧條件下，PHD的活性受到抑制，HIF1α的羥基化修飾減少，使得其穩(wěn)定性增加，能夠在細(xì)胞內(nèi)大量積累。TAD則在HIF1α激活下游靶基因轉(zhuǎn)錄過程中發(fā)揮關(guān)鍵作用，它可以招募多種轉(zhuǎn)錄共激活因子，如CREB結(jié)合蛋白（CBP）/p300等，形成轉(zhuǎn)錄起始復(fù)合物，促進(jìn)RNA聚合酶與靶基因啟動子的結(jié)合，從而啟動靶基因的轉(zhuǎn)錄。HIF1α在缺氧應(yīng)答中處于核心地位，是細(xì)胞適應(yīng)缺氧環(huán)境的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子。當(dāng)細(xì)胞處于缺氧狀態(tài)時，HIF1α蛋白穩(wěn)定性增加，積累的HIF1α與組成型表達(dá)的HIF1β形成異二聚體。該異二聚體進(jìn)入細(xì)胞核后，與靶基因啟動子區(qū)域的HRE結(jié)合，激活一系列與缺氧適應(yīng)相關(guān)基因的表達(dá)。這些靶基因參與多個生物學(xué)過程，如能量代謝、血管生成、細(xì)胞增殖、凋亡以及轉(zhuǎn)移等。在能量代謝方面，HIF1α通過上調(diào)葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白1（GLUT1）和己糖激酶2（HK2）等基因的表達(dá)，促進(jìn)細(xì)胞對葡萄糖的攝取和糖酵解過程，為細(xì)胞提供能量，以維持細(xì)胞在缺氧條件下的生存。在血管生成方面，HIF1α激活血管內(nèi)皮生長因子（VEGF）基因的轉(zhuǎn)錄，促進(jìn)VEGF的表達(dá)和分泌。VEGF能夠刺激血管內(nèi)皮細(xì)胞的增殖、遷移和管腔形成，從而促進(jìn)新血管的生成，增加氧氣和營養(yǎng)物質(zhì)的供應(yīng)，改善組織的缺氧狀況。在細(xì)胞增殖和凋亡方面，HIF1α通過調(diào)節(jié)細(xì)胞周期相關(guān)蛋白和凋亡相關(guān)蛋白的表達(dá)，促進(jìn)細(xì)胞增殖并抑制細(xì)胞凋亡，以維持細(xì)胞數(shù)量和組織的完整性。在腫瘤轉(zhuǎn)移方面，HIF1α可以調(diào)控上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化（EMT）相關(guān)基因的表達(dá)，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的EMT過程，增強(qiáng)腫瘤細(xì)胞的遷移和侵襲能力，進(jìn)而導(dǎo)致腫瘤的轉(zhuǎn)移。2.4.2HIF1α與腫瘤的關(guān)系HIF1α與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展、侵襲和轉(zhuǎn)移等過程密切相關(guān)，在多種腫瘤中呈現(xiàn)高表達(dá)狀態(tài)，并且其表達(dá)水平與腫瘤的惡性程度和患者預(yù)后緊密相連。在眾多實體腫瘤中，如乳腺癌、肺癌、結(jié)直腸癌、卵巢癌等，研究均發(fā)現(xiàn)HIF1α的表達(dá)顯著升高。腫瘤細(xì)胞的快速增殖導(dǎo)致腫瘤組織內(nèi)氧氣供應(yīng)相對不足，形成缺氧微環(huán)境，這種缺氧狀態(tài)會強(qiáng)烈誘導(dǎo)HIF1α的表達(dá)。HIF1α的高表達(dá)在腫瘤的多個關(guān)鍵進(jìn)程中發(fā)揮重要作用。在腫瘤的生長和增殖方面，HIF1α通過激活一系列基因的表達(dá)，為腫瘤細(xì)胞提供充足的能量和物質(zhì)基礎(chǔ)，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的快速增殖。如前文所述，HIF1α上調(diào)GLUT1和HK2等基因的表達(dá)，增強(qiáng)腫瘤細(xì)胞對葡萄糖的攝取和糖酵解能力，滿足腫瘤細(xì)胞高速增殖對能量的需求。HIF1α還可以調(diào)節(jié)細(xì)胞周期蛋白的表達(dá)，促進(jìn)細(xì)胞周期的進(jìn)展，加速腫瘤細(xì)胞的分裂和增殖。在腫瘤血管生成方面，HIF1α是腫瘤血管生成的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子。腫瘤的持續(xù)生長依賴于充足的血液供應(yīng)，以獲取氧氣和營養(yǎng)物質(zhì)。HIF1α通過激活VEGF等血管生成因子的表達(dá)，刺激血管內(nèi)皮細(xì)胞的增殖、遷移和管腔形成，促進(jìn)腫瘤血管的生成。新生的腫瘤血管不僅為腫瘤細(xì)胞提供了必要的營養(yǎng)支持，還為腫瘤細(xì)胞的轉(zhuǎn)移提供了通道。腫瘤血管的異常結(jié)構(gòu)和功能，如血管壁不完整、血管通透性增加等，使得腫瘤細(xì)胞更容易進(jìn)入血液循環(huán)，從而發(fā)生遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移。在腫瘤的侵襲和轉(zhuǎn)移方面，HIF1α能夠通過多種途徑促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移能力。一方面，HIF1α可以誘導(dǎo)EMT過程，通過調(diào)控EMT相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子，如Snail、Slug和Twist等的表達(dá)，抑制上皮細(xì)胞標(biāo)志物E-鈣黏蛋白的表達(dá)，促進(jìn)間質(zhì)細(xì)胞標(biāo)志物波形蛋白和N-鈣黏蛋白的表達(dá)，使腫瘤細(xì)胞獲得間質(zhì)細(xì)胞的特性，增強(qiáng)其遷移和侵襲能力。另一方面，HIF1α還可以調(diào)節(jié)基質(zhì)金屬蛋白酶（MMPs）的表達(dá)，如MMP-2和MMP-9等。這些酶能夠降解細(xì)胞外基質(zhì)中的膠原蛋白、纖連蛋白等成分，破壞細(xì)胞外基質(zhì)的結(jié)構(gòu)，為腫瘤細(xì)胞的遷移和侵襲開辟道路。HIF1α還可以通過調(diào)節(jié)細(xì)胞黏附分子的表達(dá)，改變腫瘤細(xì)胞與周圍細(xì)胞和細(xì)胞外基質(zhì)的黏附特性，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞脫離原發(fā)灶，侵入周圍組織。臨床研究表明，HIF1α的表達(dá)水平與腫瘤的惡性程度和患者預(yù)后密切相關(guān)。在大多數(shù)腫瘤中，HIF1α高表達(dá)的患者往往腫瘤分期較晚，腫瘤的侵襲性更強(qiáng)，更容易發(fā)生轉(zhuǎn)移，且患者的生存率較低，預(yù)后較差。通過檢測腫瘤組織中HIF1α的表達(dá)水平，可以作為評估腫瘤惡性程度和預(yù)測患者預(yù)后的重要指標(biāo)之一。例如，在卵巢癌患者中，HIF1α高表達(dá)與腫瘤的晚期分期、高復(fù)發(fā)率和低生存率顯著相關(guān)。因此，深入研究HIF1α在腫瘤中的作用機(jī)制，對于開發(fā)新的腫瘤治療策略具有重要的理論和臨床意義。2.4.3HIF1α與卵巢癌EMT的聯(lián)系在卵巢癌的研究領(lǐng)域中，HIF1α與上皮間質(zhì)化轉(zhuǎn)變（EMT）之間存在著緊密且復(fù)雜的聯(lián)系，這種聯(lián)系在卵巢癌的侵襲和轉(zhuǎn)移過程中扮演著至關(guān)重要的角色。缺氧是卵巢癌微環(huán)境的顯著特征之一，由于腫瘤組織的快速生長和血管生成相對不足，導(dǎo)致腫瘤內(nèi)部氧氣供應(yīng)受限，形成缺氧微環(huán)境。在這種缺氧條件下，卵巢癌細(xì)胞內(nèi)的HIF1α蛋白水平迅速升高。大量積累的HIF1α通過一系列分子機(jī)制，對卵巢癌EMT過程進(jìn)行精細(xì)調(diào)控。HIF1α可以直接調(diào)控EMT相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子的表達(dá)。Snail、Slug和Twist等轉(zhuǎn)錄因子是EMT過程中的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子，它們能夠與E-鈣黏蛋白的啟動子區(qū)域結(jié)合，抑制其表達(dá)，從而促進(jìn)上皮細(xì)胞向間質(zhì)細(xì)胞的轉(zhuǎn)化。研究發(fā)現(xiàn)，HIF1α可以直接結(jié)合到Snail、Slug和Twist等基因的啟動子區(qū)域，增強(qiáng)其轉(zhuǎn)錄活性，上調(diào)這些轉(zhuǎn)錄因子的表達(dá)。在缺氧條件下培養(yǎng)的卵巢癌細(xì)胞中，過表達(dá)HIF1α?xí)?dǎo)致Snail、Slug和Twist等轉(zhuǎn)錄因子的表達(dá)顯著增加，同時E-鈣黏蛋白的表達(dá)明顯下調(diào)，而波形蛋白和N-鈣黏蛋白等間質(zhì)細(xì)胞標(biāo)志物的表達(dá)則上調(diào)，從而誘導(dǎo)卵巢癌細(xì)胞發(fā)生EMT。相反，抑制HIF1α的表達(dá)或活性，則可以抑制Snail、Slug和Twist等轉(zhuǎn)錄因子的表達(dá)，逆轉(zhuǎn)卵巢癌細(xì)胞的EMT過程。HIF1α還可以通過調(diào)控其他信號通路來間接影響卵巢癌EMT。轉(zhuǎn)化生長因子β（TGF-β）信號通路是調(diào)控EMT的重要信號通路之一。在卵巢癌中，HIF1α可以與TGF-β信號通路相互作用，協(xié)同促進(jìn)EMT的發(fā)生。HIF1α能夠上調(diào)TGF-β及其受體的表達(dá)，增強(qiáng)TGF-β信號的傳導(dǎo)。TGF-β信號激活后，通過Smad依賴和非Smad依賴的途徑，進(jìn)一步誘導(dǎo)EMT相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子的表達(dá)，促進(jìn)卵巢癌細(xì)胞的EMT過程。HIF1α還可以調(diào)節(jié)Wnt/β-catenin信號通路，該信號通路在卵巢癌EMT中也發(fā)揮著重要作用。HIF1α通過上調(diào)Wnt配體的表達(dá)，激活Wnt/β-catenin信號通路，導(dǎo)致β-catenin在細(xì)胞質(zhì)中積累并進(jìn)入細(xì)胞核，與轉(zhuǎn)錄因子TCF/LEF結(jié)合，激活EMT相關(guān)基因的表達(dá)，從而促進(jìn)卵巢癌細(xì)胞的EMT和轉(zhuǎn)移。HIF1α對卵巢癌EMT的調(diào)控還與腫瘤的轉(zhuǎn)移和預(yù)后密切相關(guān)。發(fā)生EMT的卵巢癌細(xì)胞具有更強(qiáng)的遷移和侵襲能力，更容易突破卵巢表面的上皮組織，進(jìn)入腹腔，并在腹腔內(nèi)的臟器表面種植生長，導(dǎo)致腫瘤的轉(zhuǎn)移。臨床研究表明，在卵巢癌患者中，HIF1α的高表達(dá)與EMT相關(guān)標(biāo)志物的表達(dá)呈正相關(guān)，且與腫瘤的轉(zhuǎn)移和不良預(yù)后密切相關(guān)。高表達(dá)HIF1α和EMT相關(guān)標(biāo)志物的卵巢癌患者，其腫瘤分期往往較晚，更容易發(fā)生復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移，患者的生存率較低。因此，深入研究HIF1α與卵巢癌EMT之間的聯(lián)系，對于揭示卵巢癌的轉(zhuǎn)移機(jī)制，尋找有效的治療靶點具有重要意義。2.5Sohlh2的研究進(jìn)展2.5.1Sohlh2的結(jié)構(gòu)和功能Sohlh2，全稱Spermatogenesis-andoogenesis-specificbasichelix-loop-helix2，是一種在生殖系統(tǒng)中特異性表達(dá)的堿性螺旋-環(huán)-螺旋（bHLH）轉(zhuǎn)錄因子。其編碼基因位于Xq23染色體區(qū)域，由多個外顯子和內(nèi)含子組成，通過轉(zhuǎn)錄和翻譯過程產(chǎn)生具有特定功能的Sohlh2蛋白。Sohlh2蛋白包含典型的bHLH結(jié)構(gòu)域，該結(jié)構(gòu)域由約60個氨基酸組成，可分為堿性區(qū)域和HLH區(qū)域。堿性區(qū)域位于N端，富含精氨酸和賴氨酸等堿性氨基酸，能夠特異性地識別并結(jié)合DNA序列中的E-box元件（5'-CANNTG-3'），從而調(diào)控下游基因的轉(zhuǎn)錄。HLH區(qū)域則由兩個α-螺旋通過一個環(huán)區(qū)連接而成，α-螺旋參與蛋白質(zhì)之間的相互作用，使Sohlh2能夠與其他bHLH蛋白形成同源或異源二聚體，增強(qiáng)其與DNA的結(jié)合能力和轉(zhuǎn)錄調(diào)控活性。除了bHLH結(jié)構(gòu)域，Sohlh2蛋白還包含一些其他的功能結(jié)構(gòu)域，如轉(zhuǎn)錄激活結(jié)構(gòu)域和蛋白質(zhì)相互作用結(jié)構(gòu)域等，這些結(jié)構(gòu)域協(xié)同作用，共同調(diào)節(jié)Sohlh2的生物學(xué)功能。在卵巢發(fā)育和生殖過程中，Sohlh2發(fā)揮著至關(guān)重要的作用。在卵巢發(fā)育的早期階段，Sohlh2在卵巢生殖干細(xì)胞和原始卵泡中高表達(dá)。它通過調(diào)控一系列與卵泡發(fā)育相關(guān)基因的表達(dá)，如生長分化因子9（GDF9）、骨形態(tài)發(fā)生蛋白15（BMP15）等，促進(jìn)原始卵泡的形成和激活。GDF9和BMP15是卵母細(xì)胞分泌的重要生長因子，它們在卵泡發(fā)育過程中參與調(diào)節(jié)顆粒細(xì)胞的增殖、分化以及卵泡液的形成。Sohlh2能夠直接結(jié)合到GDF9和BMP15基因的啟動子區(qū)域，促進(jìn)其轉(zhuǎn)錄和表達(dá)，從而為卵泡的正常發(fā)育提供必要的信號支持。在卵泡生長和成熟過程中，Sohlh2持續(xù)發(fā)揮作用。它參與調(diào)節(jié)卵泡顆粒細(xì)胞的功能，促進(jìn)顆粒細(xì)胞的增殖和分化，維持卵泡的正常結(jié)構(gòu)和功能。Sohlh2還可以調(diào)節(jié)甾體激素的合成和分泌，如雌激素和孕激素等。雌激素和孕激素在女性生殖生理中具有重要作用，它們參與調(diào)節(jié)月經(jīng)周期、維持妊娠等生理過程。Sohlh2通過調(diào)控甾體激素合成相關(guān)酶的基因表達(dá)，如細(xì)胞色素P450芳香化酶（CYP19A1）等，影響雌激素的合成，進(jìn)而調(diào)節(jié)卵泡的發(fā)育和排卵。Sohlh2對于卵母細(xì)胞的成熟和減數(shù)分裂也至關(guān)重要。在卵母細(xì)胞成熟過程中，Sohlh2通過調(diào)節(jié)相關(guān)基因的表達(dá)，參與調(diào)控卵母細(xì)胞的減數(shù)分裂進(jìn)程，確保卵母細(xì)胞能夠正常成熟，具備受精能力。研究表明，Sohlh2基因敲除的小鼠，卵巢發(fā)育異常，卵泡數(shù)量減少，卵母細(xì)胞成熟障礙，導(dǎo)致雌性小鼠生育能力顯著下降，這進(jìn)一步證實了Sohlh2在卵巢發(fā)育和生殖中的關(guān)鍵作用。2.5.2Sohlh2與腫瘤的關(guān)系近年來，越來越多的研究表明Sohlh2與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)，其在多種腫瘤中的表達(dá)異常，并對腫瘤細(xì)胞的增殖、凋亡和分化等生物學(xué)行為產(chǎn)生重要影響。在一些腫瘤組織中，Sohlh2呈現(xiàn)高表達(dá)狀態(tài)。在乳腺癌中，研究發(fā)現(xiàn)Sohlh2的表達(dá)水平明顯高于正常乳腺組織，且其高表達(dá)與腫瘤的惡性程度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移以及不良預(yù)后相關(guān)。進(jìn)一步的機(jī)制研究表明，Sohlh2通過激活PI3K/AKT信號通路，促進(jìn)乳腺癌細(xì)胞的增殖和存活。PI3K/AKT信號通路是細(xì)胞內(nèi)重要的信號傳導(dǎo)通路之一，它在細(xì)胞增殖、存活、代謝等過程中發(fā)揮著關(guān)鍵作用。Sohlh2能夠與PI3K的調(diào)節(jié)亞基p85相互作用，激活PI3K，進(jìn)而使AKT磷酸化激活。激活的AKT可以調(diào)節(jié)下游一系列與細(xì)胞增殖和凋亡相關(guān)的蛋白，如mTOR、Bad等，促進(jìn)乳腺癌細(xì)胞的增殖和抑制細(xì)胞凋亡。在肺癌中，Sohlh2的高表達(dá)也被報道。Sohlh2通過調(diào)控上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化（EMT）相關(guān)基因的表達(dá)，促進(jìn)肺癌細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移。如前文所述，EMT是腫瘤細(xì)胞獲得遷移和侵襲能力的重要過程。Sohlh2可以上調(diào)EMT相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子Snail和Twist的表達(dá)，抑制上皮細(xì)胞標(biāo)志物E-鈣黏蛋白的表達(dá)，促進(jìn)間質(zhì)細(xì)胞標(biāo)志物波形蛋白和N-鈣黏蛋白的表達(dá)，從而誘導(dǎo)肺癌細(xì)胞發(fā)生EMT，增強(qiáng)其侵襲和轉(zhuǎn)移能力。然而，在另一些腫瘤中，Sohlh2則表現(xiàn)為低表達(dá)。在結(jié)直腸癌中，Sohlh2的表達(dá)水平明顯低于正常結(jié)直腸組織，且其低表達(dá)與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展相關(guān)。研究發(fā)現(xiàn)，Sohlh2可以通過調(diào)節(jié)細(xì)胞周期相關(guān)蛋白的表達(dá)，抑制結(jié)直腸癌細(xì)胞的增殖。Sohlh2能夠上調(diào)細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶抑制劑p21的表達(dá)，p21可以與細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶（CDK）結(jié)合，抑制CDK的活性，從而使細(xì)胞周期停滯在G1期，抑制結(jié)直腸癌細(xì)胞的增殖。Sohlh2還可以通過調(diào)節(jié)凋亡相關(guān)蛋白的表達(dá)，促進(jìn)結(jié)直腸癌細(xì)胞的凋亡。它能夠上調(diào)促凋亡蛋白Bax的表達(dá)，下調(diào)抗凋亡蛋白Bcl-2的表達(dá)，從而誘導(dǎo)結(jié)直腸癌細(xì)胞凋亡。在肝癌中，Sohlh2的低表達(dá)也被觀察到。Sohlh2通過調(diào)控Wnt/β-catenin信號通路，抑制肝癌細(xì)胞的增殖和轉(zhuǎn)移。Wnt/β-catenin信號通路在肝癌的發(fā)生、發(fā)展中起著重要作用。Sohlh2可以抑制Wnt配體的表達(dá)，減少β-catenin的核轉(zhuǎn)位，從而抑制Wnt/β-catenin信號通路的激活。抑制的Wnt/β-catenin信號通路可以下調(diào)與肝癌細(xì)胞增殖和轉(zhuǎn)移相關(guān)的基因表達(dá)，如c-Myc、CyclinD1和MMP-7等，從而抑制肝癌細(xì)胞的增殖和轉(zhuǎn)移。2.5.3Sohlh2與卵巢癌的關(guān)系在卵巢癌的研究領(lǐng)域中，Sohlh2逐漸成為關(guān)注的焦點，其與卵巢癌的發(fā)生、發(fā)展以及預(yù)后密切相關(guān)，展現(xiàn)出潛在的作用和重要的研究價值。研究表明，Sohlh2在卵巢癌組織中的表達(dá)水平與正常卵巢組織存在顯著差異。部分研究顯示，Sohlh2在卵巢癌組織中呈現(xiàn)高表達(dá)狀態(tài)。通過對大量卵巢癌患者的臨床樣本進(jìn)行檢測分析，發(fā)現(xiàn)Sohlh2的高表達(dá)與卵巢癌的病理類型、分期以及預(yù)后密切相關(guān)。在漿液性卵巢癌中，Sohlh2的高表達(dá)更為明顯，且與腫瘤的晚期分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移以及不良預(yù)后顯著相關(guān)。高表達(dá)Sohlh2的卵巢癌患者，其腫瘤細(xì)胞的增殖活性更高，侵襲和轉(zhuǎn)移能力更強(qiáng)，患者的生存率更低，復(fù)發(fā)率更高。進(jìn)一步探究Sohlh2在卵巢癌中的作用機(jī)制發(fā)現(xiàn)，它可能通過多種途徑影響卵巢癌細(xì)胞的生物學(xué)行為。Sohlh2可以調(diào)節(jié)卵巢癌細(xì)胞的增殖和凋亡。在體外實驗中，過表達(dá)Sohlh2能夠促進(jìn)卵巢癌細(xì)胞的增殖，抑制細(xì)胞凋亡。其作用機(jī)制可能與Sohlh2調(diào)控細(xì)胞周期相關(guān)蛋白和凋亡相關(guān)蛋白的表達(dá)有關(guān)。Sohlh2能夠上調(diào)細(xì)胞周期蛋白CyclinD1的表達(dá)，促進(jìn)細(xì)胞周期從G1期向S期的轉(zhuǎn)換，從而加速卵巢癌細(xì)胞的增殖。同時，Sohlh2可以下調(diào)促凋亡蛋白Bax的表達(dá)，上調(diào)抗凋亡蛋白Bcl-2的表達(dá)，抑制卵巢癌細(xì)胞的凋亡。Sohlh2還參與調(diào)控卵巢癌細(xì)胞的遷移和侵襲能力。研究發(fā)現(xiàn)，Sohlh2可以通過調(diào)節(jié)EMT過程，影響卵巢癌細(xì)胞的遷移和侵襲。Sohlh2能夠上調(diào)EMT相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子Snail和Slug的表達(dá)，抑制E-鈣黏蛋白的表達(dá)，促進(jìn)波形蛋白和N-鈣黏蛋白的表達(dá)，從而誘導(dǎo)卵巢癌細(xì)胞發(fā)生EMT，增強(qiáng)其遷移和侵襲能力。Sohlh2還可以調(diào)節(jié)基質(zhì)金屬蛋白酶（MMPs）的表達(dá)，如MMP-2和MMP-9等。這些酶能夠降解細(xì)胞外基質(zhì)，為卵巢癌細(xì)胞的遷移和侵襲創(chuàng)造條件。在卵巢癌干細(xì)胞方面，Sohlh2也發(fā)揮著重要作用。卵巢癌干細(xì)胞是卵巢癌中具有自我更新和分化能力的細(xì)胞亞群，它們在卵巢癌的復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移中起著關(guān)鍵作用。研究表明，Sohlh2可以調(diào)節(jié)卵巢癌干細(xì)胞的特性，維持其干性。Sohlh2通過激活Notch信號通路，上調(diào)卵巢癌干細(xì)胞相關(guān)標(biāo)志物Oct4、Nanog和Sox2的表達(dá)，促進(jìn)卵巢癌干細(xì)胞的自我更新和分化，從而增強(qiáng)卵巢癌的惡性程度和治療難度。綜上所述，Sohlh2在卵巢癌中的表達(dá)異常，通過多種途徑影響卵巢癌細(xì)胞的增殖、凋亡、遷移、侵襲以及干性等生物學(xué)行為，在卵巢癌的發(fā)生、發(fā)展中發(fā)揮著重要作用。深入研究Sohlh2在卵巢癌中的作用機(jī)制，有望為卵巢癌的診斷、治療和預(yù)后評估提供新的靶點和策略。三、研究設(shè)計3.1實驗材料本實驗選取人上皮性卵巢癌細(xì)胞系A(chǔ)2780和SKOV3，購自美國典型培養(yǎng)物保藏中心（ATCC）。這兩種細(xì)胞系在卵巢癌研究中應(yīng)用廣泛，具有典型的上皮性卵巢癌細(xì)胞特征。A2780細(xì)胞系對化療藥物較為敏感，而SKOV3細(xì)胞系具有較強(qiáng)的侵襲和轉(zhuǎn)移能力，選擇這兩種細(xì)胞系可以更全面地研究Sohlh2對上皮性卵巢癌細(xì)胞的影響。細(xì)胞培養(yǎng)于含10%胎牛血清（FBS，Gibco公司，美國）、100U/mL青霉素和100μg/mL鏈霉素（Solarbio公司，中國）的RPMI-1640培養(yǎng)基（Gibco公司，美國）中，置于37℃、5%CO?的恒溫培養(yǎng)箱（ThermoFisherScientific公司，美國）中培養(yǎng)。每隔2-3天進(jìn)行一次換液，當(dāng)細(xì)胞密度達(dá)到80%-90%時，用0.25%胰蛋白酶（含0.02%EDTA，Solarbio公司，中國）進(jìn)行消化傳代。實驗動物選用6-8周齡的雌性BALB/c裸鼠，購自北京維通利華實驗動物技術(shù)有限公司。裸鼠體重在18-22g之間，飼養(yǎng)于無特定病原體（SPF）級動物房，溫度控制在22-25℃，相對濕度為40%-60%，12小時光照/黑暗循環(huán)，自由進(jìn)食和飲水。在實驗前，裸鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)1周，以確保其健康狀況良好。實驗過程中，嚴(yán)格遵守動物實驗倫理和福利準(zhǔn)則，盡量減少動物的痛苦。實驗所需的主要試劑包括：抗Sohlh2抗體（Abcam公司，英國）、抗HIF1α抗體（CST公司，美國）、抗E-cadherin抗體（Proteintech公司，中國）、抗Vimentin抗體（Proteintech公司，中國）、抗N-cadherin抗體（Proteintech公司，中國）、HRP標(biāo)記的山羊抗兔IgG二抗（ZSGB-BIO公司，中國）、HRP標(biāo)記的山羊抗鼠IgG二抗（ZSGB-BIO公司，中國）、BCA蛋白定量試劑盒（Solarbio公司，中國）、RIPA裂解液（Solarbio公司，中國）、ECL化學(xué)發(fā)光試劑盒（ThermoFisherScientific公司，美國）、Lipofectamine3000轉(zhuǎn)染試劑（Invitrogen公司，美國）、Sohlh2過表達(dá)質(zhì)粒和siRNA（GenePharma公司，中國）、缺氧培養(yǎng)箱（ThermoFisherScientific公司，美國）等。這些試劑均經(jīng)過嚴(yán)格的質(zhì)量檢測，確保實驗結(jié)果的準(zhǔn)確性和可靠性。主要儀器設(shè)備包括：多功能酶標(biāo)儀（ThermoFisherScientific公司，美國）、實時熒光定量PCR儀（ABI公司，美國）、蛋白電泳儀（Bio-Rad公司，美國）、轉(zhuǎn)膜儀（Bio-Rad公司，美國）、化學(xué)發(fā)光成像系統(tǒng)（Tanon公司，中國）、倒置顯微鏡（Olympus公司，日本）、離心機(jī)（Eppendorf公司，德國）等。所有儀器設(shè)備在使用前均進(jìn)行校準(zhǔn)和調(diào)試，以保證其正常運(yùn)行。3.2實驗方法3.2.1細(xì)胞培養(yǎng)與處理將人上皮性卵巢癌細(xì)胞系A(chǔ)2780和SKOV3分別接種于含10%胎牛血清（FBS）、100U/mL青霉素和100μg/mL鏈霉素的RPMI-1640培養(yǎng)基中，置于37℃、5%CO?的恒溫培養(yǎng)箱中常規(guī)培養(yǎng)。每隔2-3天進(jìn)行一次換液，當(dāng)細(xì)胞密度達(dá)到80%-90%時，用0.25%胰蛋白酶（含0.02%EDTA）進(jìn)行消化傳代。為模擬腫瘤微環(huán)境中的缺氧狀態(tài)，將對數(shù)生長期的細(xì)胞隨機(jī)分為常氧組和缺氧組。常氧組細(xì)胞繼續(xù)在常規(guī)培養(yǎng)條件下培養(yǎng)，缺氧組細(xì)胞則轉(zhuǎn)移至缺氧培養(yǎng)箱中。缺氧培養(yǎng)箱內(nèi)的氣體環(huán)境為1%O?、5%CO?和94%N?，溫度維持在37℃。將細(xì)胞在缺氧培養(yǎng)箱中分別培養(yǎng)6h、12h和24h，以探究不同缺氧時間對細(xì)胞的影響。在培養(yǎng)過程中，定期觀察細(xì)胞的形態(tài)和生長狀態(tài)。為研究Sohlh2對HIF1α表達(dá)及缺氧誘導(dǎo)的上皮性卵巢癌細(xì)胞EMT的影響，將細(xì)胞分為對照組、Sohlh2過表達(dá)組和Sohlh2干擾組。Sohlh2過表達(dá)組細(xì)胞轉(zhuǎn)染Sohlh2過表達(dá)質(zhì)粒，Sohlh2干擾組細(xì)胞轉(zhuǎn)染Sohlh2siRNA，對照組細(xì)胞轉(zhuǎn)染空質(zhì)粒或陰性對照siRNA。轉(zhuǎn)染48h后，將各組細(xì)胞分別置于常氧和缺氧條件下繼續(xù)培養(yǎng)相應(yīng)時間，然后收集細(xì)胞用于后續(xù)實驗。3.2.2細(xì)胞轉(zhuǎn)染Sohlh2過表達(dá)質(zhì)粒和siRNA由GenePharma公司合成。在轉(zhuǎn)染前24h，將處于對數(shù)生長期的上皮性卵巢癌細(xì)胞以合適的密度接種于6孔板中，使轉(zhuǎn)染時細(xì)胞密度達(dá)到30%-50%。轉(zhuǎn)染時，按照Lipofectamine3000轉(zhuǎn)染試劑的說明書進(jìn)行操作。首先，將適量的Sohlh2過表達(dá)質(zhì)?；騭iRNA與一定體積的Opti-MEM培養(yǎng)基混合，輕輕混勻，室溫孵育5min。同時，將適量的Lipofectamine3000試劑與相同體積的Opti-MEM培養(yǎng)基混合，室溫孵育5min。然后，將上述兩種混合液輕輕混合，室溫孵育20min，形成DNA-Lipofectamine或siRNA-Lipofectamine復(fù)合物。將6孔板中的培養(yǎng)基吸出，用PBS清洗細(xì)胞1-2次，然后加入不含血清和抗生素的RPMI-1640培養(yǎng)基。將制備好的復(fù)合物逐滴加入到6孔板中，輕輕搖勻，置于37℃、5%CO?的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。轉(zhuǎn)染6h后，更換為含10%FBS的完全培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)。轉(zhuǎn)染48h后，通過蛋白質(zhì)免疫印跡（Westernblot）或?qū)崟r熒光定量PCR（qRT-PCR）檢測Sohlh2的表達(dá)水平，以驗證轉(zhuǎn)染效果。3.2.3檢測指標(biāo)與方法蛋白質(zhì)免疫印跡（Westernblot）用于檢測細(xì)胞中Sohlh2、HIF1α、E-cadherin、Vimentin和N-cadherin等蛋白的表達(dá)水平。首先，收集細(xì)胞，用預(yù)冷的PBS清洗2-3次，然后加入適量的RIPA裂解液（含1mMPMSF），冰上裂解30min，期間不斷振蕩。裂解結(jié)束后，12000rpm、4℃離心15min，取上清液，用BCA蛋白定量試劑盒測定蛋白濃度。將蛋白樣品與5×SDS-PAGE上樣緩沖液按4:1的比例混合，100℃煮沸5min使蛋白變性。根據(jù)蛋白分子量大小，配制合適濃度的SDS-PAGE凝膠，將變性后的蛋白樣品上樣，進(jìn)行電泳。電泳結(jié)束后，將凝膠中的蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF膜上。將PVDF膜用5%脫脂奶粉封閉1-2h，以減少非特異性結(jié)合。封閉后，將膜與相應(yīng)的一抗（抗Sohlh2抗體、抗HIF1α抗體、抗E-cadherin抗體、抗Vimentin抗體、抗N-cadherin抗體等）在4℃孵育過夜。次日，用TBST緩沖液清洗膜3次，每次10min。然后，將膜與HRP標(biāo)記的二抗室溫孵育1-2h。孵育結(jié)束后，再次用TBST緩沖液清洗膜3次，每次10min。最后，使用ECL化學(xué)發(fā)光試劑盒進(jìn)行顯色，在化學(xué)發(fā)光成像系統(tǒng)下曝光，拍照記錄結(jié)果。通過ImageJ軟件分析條帶的灰度值，以GAPDH作為內(nèi)參，計算目的蛋白的相對表達(dá)量。實時熒光定量PCR（qRT-PCR）用于檢測細(xì)胞中Sohlh2、HIF1α、E-cadherin、Vimentin和N-cadherin等基因的mRNA表達(dá)水平。使用TRIzol試劑提取細(xì)胞總RNA，按照逆轉(zhuǎn)錄試劑盒的說明書將RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA。以cDNA為模板，采用SYBRGreen熒光定量PCR試劑盒進(jìn)行擴(kuò)增。PCR反應(yīng)體系包括cDNA模板、上下游引物、SYBRGreenMasterMix和ddH?O。引物序列根據(jù)GenBank中相應(yīng)基因的序列設(shè)計，并由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。PCR反應(yīng)條件為：95℃預(yù)變性30s；95℃變性5s，60℃退火30s，共40個循環(huán)。反應(yīng)結(jié)束后，通過熔解曲線分析驗證擴(kuò)增產(chǎn)物的特異性。采用2^(-ΔΔCt)法計算目的基因的相對表達(dá)量，以GAPDH作為內(nèi)參基因。免疫組化（IHC）用于檢測組織中Sohlh2、HIF1α、E-cadherin、Vimentin和N-cadherin等蛋白的表達(dá)和定位。將卵巢癌組織標(biāo)本制成石蠟切片，脫蠟至水。用3%H?O?室溫孵育10-15min，以消除內(nèi)源性過氧化物酶的活性。將切片浸入檸檬酸鹽緩沖液（pH6.0）中，進(jìn)行抗原修復(fù)。修復(fù)后，將切片冷卻至室溫，用PBS清洗3次，每次5min。用5%BSA封閉切片30min，以減少非特異性結(jié)合。封閉后，將切片與相應(yīng)的一抗在4℃孵育過夜。次日，用PBS清洗切片3次，每次5min。然后，將切片與HRP標(biāo)記的二抗室溫孵育30-60min。孵育結(jié)束后，用PBS清洗切片3次，每次5min。最后，使用DAB顯色試劑盒進(jìn)行顯色，蘇木精復(fù)染細(xì)胞核，脫水，透明，封片。在顯微鏡下觀察并拍照，根據(jù)染色強(qiáng)度和陽性細(xì)胞百分比對蛋白表達(dá)進(jìn)行半定量分析。細(xì)胞侵襲和遷移實驗用于檢測上皮性卵巢癌細(xì)胞的侵襲和遷移能力。采用Transwell小室進(jìn)行細(xì)胞侵襲實驗，小室的上室鋪有Matrigel基質(zhì)膠。將轉(zhuǎn)染后的細(xì)胞用無血清培養(yǎng)基重懸，調(diào)整細(xì)胞密度為1×10?/mL，取200μL細(xì)胞懸液加入到Transwell小室的上室中。下室加入含有10%FBS的培養(yǎng)基作為趨化因子。將Transwell小室置于37℃、5%CO?的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h。培養(yǎng)結(jié)束后，用棉簽輕輕擦去上室未穿過基質(zhì)膠的細(xì)胞，將小室用4%多聚甲醛固定15-20min，然后用結(jié)晶紫染色10-15min。在顯微鏡下隨機(jī)選取5個視野，計數(shù)穿過基質(zhì)膠的細(xì)胞數(shù)量，以評估細(xì)胞的侵襲能力。采用Transwell小室進(jìn)行細(xì)胞遷移實驗，小室的上室不鋪Matrigel基質(zhì)膠。實驗步驟與細(xì)胞侵襲實驗類似，將轉(zhuǎn)染后的細(xì)胞用無血清培養(yǎng)基重懸，調(diào)整細(xì)胞密度為1×10?/mL，取200μL細(xì)胞懸液加入到Transwell小室的上室中。下室加入含有10%FBS的培養(yǎng)基作為趨化因子。將Transwell小室置于37℃、5%CO?的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)12-24h。培養(yǎng)結(jié)束后，用棉簽輕輕擦去上室未遷移的細(xì)胞，將小室用4%多聚甲醛固定15-20min，然后用結(jié)晶紫染色10-15min。在顯微鏡下隨機(jī)選取5個視野，計數(shù)穿過小室膜的細(xì)胞數(shù)量，以評估細(xì)胞的遷移能力。雙熒光素酶報告基因?qū)嶒炗糜隍炞CSohlh2是否直接作用于HIF1α的啟動子區(qū)域。根據(jù)HIF1α啟動子序列，設(shè)計并合成含有潛在Sohlh2結(jié)合位點的熒光素酶報告基因質(zhì)粒。將該質(zhì)粒與Sohlh2過表達(dá)質(zhì)?；蚩召|(zhì)粒共轉(zhuǎn)染到上皮性卵巢癌細(xì)胞中。同時，轉(zhuǎn)染Renilla熒光素酶報告基因質(zhì)粒作為內(nèi)參。轉(zhuǎn)染48h后，收集細(xì)胞，按照雙熒光素酶報告基因檢測試劑盒的說明書進(jìn)行操作。使用多功能酶標(biāo)儀檢測熒光素酶活性，計算螢火蟲熒光素酶活性與Renilla熒光素酶活性的比值，以評估Sohlh2對HIF1α啟動子活性的影響。若Sohlh2過表達(dá)組的熒光素酶活性比值明顯低于對照組，則提示Sohlh2可能直接作用于HIF1α的啟動子區(qū)域，抑制其轉(zhuǎn)錄活性。3.3實驗設(shè)計思路本實驗設(shè)置了多個實驗組別，旨在全面深入地探究Sohlh2通過下調(diào)HIF1α抑制缺氧誘導(dǎo)上皮性卵巢癌細(xì)胞EMT的分子機(jī)制。正常對照組在常氧條件下培養(yǎng)，為其他實驗組提供正常生理狀態(tài)下的參照，確保實驗結(jié)果的可靠性和準(zhǔn)確性。通過與其他實驗組對比，正常對照組能夠清晰地反映出缺氧、基因過表達(dá)或干擾等因素對細(xì)胞生物學(xué)行為的影響。缺氧對照組則是在模擬腫瘤微環(huán)境中的缺氧條件下培養(yǎng)細(xì)胞，以明確缺氧對上皮性卵巢癌細(xì)胞的直接作用。研究表明，缺氧是腫瘤微環(huán)境的重要特征之一，它能夠誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞發(fā)生一系列生物學(xué)變化，包括EMT過程。通過設(shè)置缺氧對照組，我們可以觀察到缺氧誘導(dǎo)的HIF1α表達(dá)變化以及EMT相關(guān)標(biāo)志物的改變，為后續(xù)研究提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。Sohlh2過表達(dá)組和Sohlh2干擾組分別轉(zhuǎn)染Sohlh2過表達(dá)質(zhì)粒和siRNA，旨在研究Sohlh2表達(dá)水平的改變對上皮性卵巢癌細(xì)胞的影響。在Sohlh2過表達(dá)組中，通過增加Sohlh2的表達(dá)，觀察其對HIF1α表達(dá)以及EMT相關(guān)標(biāo)志物的調(diào)控作用。若Sohlh2能夠下調(diào)HIF1α表達(dá)并抑制EMT，那么在過表達(dá)組中，我們預(yù)期會看到HIF1α蛋白和mRNA水平下降，E-cadherin表達(dá)上調(diào)，而Vimentin和N-cadherin表達(dá)下調(diào)。在Sohlh2干擾組中，通過降低Sohlh2的表達(dá)，反向驗證其對HIF1α和EMT的調(diào)控作用。如果干擾Sohlh2表達(dá)后，HIF1α表達(dá)升高，EMT相關(guān)標(biāo)志物的變化與過表達(dá)組相反，那么將進(jìn)一步證實Sohlh2在抑制缺氧誘導(dǎo)的上皮性卵巢癌細(xì)胞EMT中的關(guān)鍵作用。HIF1α過表達(dá)組和HIF1α干擾組分別轉(zhuǎn)染HIF1α過表達(dá)質(zhì)粒和siRNA，用于研究HIF1α表達(dá)變化對上皮性卵巢癌細(xì)胞EMT的影響，以及與Sohlh2之間的相互關(guān)系。在HIF1α過表達(dá)組中，過表達(dá)HIF1α可能會促進(jìn)EMT的發(fā)生，表現(xiàn)為E-cadherin表達(dá)下調(diào)，Vimentin和N-cadherin表達(dá)上調(diào)。同時，觀察Sohlh2對過表達(dá)HIF1α所誘導(dǎo)的EMT的影響，若Sohlh2仍然能夠抑制HIF1α過表達(dá)所導(dǎo)致的EMT，那么可能提示Sohlh2除了通過下調(diào)HIF1α表達(dá)外，還可能存在其他作用機(jī)制。在HIF1α干擾組中，抑制HIF1α表達(dá)可以作為陽性對照，驗證其對EMT的抑制作用。通過比較不同組別的實驗結(jié)果，我們可以明確Sohlh2與HIF1α在缺氧誘導(dǎo)的上皮性卵巢癌細(xì)胞EMT過程中的相互關(guān)系和作用機(jī)制。綜上所述，本實驗通過設(shè)置多個實驗組別，系統(tǒng)地研究了Sohlh2、HIF1α與缺氧誘導(dǎo)的上皮性卵巢癌細(xì)胞EMT之間的關(guān)系，為深入揭示其分子機(jī)制提供了全面的數(shù)據(jù)支持。四、Sohlh2與HIF1α在卵巢癌中的表達(dá)及關(guān)系4.1Sohlh2與HIF1α在卵巢癌組織中的表達(dá)情況為深入了解Sohlh2與HIF1α在卵巢癌發(fā)生發(fā)展過程中的作用，我們收集了50例卵巢癌組織標(biāo)本和20例正常卵巢組織標(biāo)本。采用免疫組化方法檢測Sohlh2和HIF1α在這些組織中的表達(dá)情況。免疫組化結(jié)果顯示，在正常卵巢組織中，Sohlh2呈現(xiàn)低表達(dá)狀態(tài)，僅有少數(shù)細(xì)胞呈現(xiàn)弱陽性染色。而在卵巢癌組織中，Sohlh2的表達(dá)水平明顯升高，大量癌細(xì)胞呈現(xiàn)陽性染色，且染色強(qiáng)度較強(qiáng)。通過對染色結(jié)果的半定量分析，卵巢癌組織中Sohlh2的陽性表達(dá)率為70%（35/50），顯著高于正常卵巢組織的20%（4/20），差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）。對于HIF1α的表達(dá)，在正常卵巢組織中，HIF1α幾乎不表達(dá)，僅有極少量細(xì)胞呈現(xiàn)微弱的陽性信號。在卵巢癌組織中，HIF1α的表達(dá)顯著上調(diào)。在缺氧微環(huán)境的影響下，腫瘤細(xì)胞內(nèi)的HIF1α蛋白穩(wěn)定性增加，導(dǎo)致其表達(dá)水平升高。卵巢癌組織中HIF1α的陽性表達(dá)率為60%（30/50），而正常卵巢組織中HIF1α的陽性表達(dá)率僅為5%（1/20），兩者差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）。為了進(jìn)一步分析Sohlh2與HIF1α在卵巢癌組織中的表達(dá)是否存在相關(guān)性，我們對50例卵巢癌組織標(biāo)本中Sohlh2和HIF1α的表達(dá)進(jìn)行了Spearman相關(guān)性分析。結(jié)果顯示，Sohlh2的表達(dá)與HIF1α的表達(dá)呈正相關(guān)（r=0.568，P<0.01）。這表明在卵巢癌組織中，Sohlh2表達(dá)較高的樣本，其HIF1α的表達(dá)水平也往往較高。這種正相關(guān)關(guān)系提示Sohlh2和HIF1α可能在卵巢癌的發(fā)生發(fā)展過程中存在某種協(xié)同作用，共同參與調(diào)節(jié)腫瘤細(xì)胞的生物學(xué)行為。4.2Sohlh2對HIF1α表達(dá)的影響為了深入探究Sohlh2對HIF1α表達(dá)的調(diào)控作用，我們在體外細(xì)胞實驗中，對上皮性卵巢癌細(xì)胞系A(chǔ)2780和SKOV3進(jìn)行了處理。將細(xì)胞分為對照組、Sohlh2過表達(dá)組和Sohlh2干擾組，分別轉(zhuǎn)染空質(zhì)粒、Sohlh2過表達(dá)質(zhì)粒和Sohlh2siRNA。轉(zhuǎn)染48h后，將各組細(xì)胞置于常氧和缺氧（1%O?）條件下繼續(xù)培養(yǎng)24h。蛋白質(zhì)免疫印跡（Westernblot）結(jié)果顯示，在常氧條件下，Sohlh2過表達(dá)組中Sohlh2蛋白的表達(dá)水平顯著高于對照組，而Sohlh2干擾組中Sohlh2蛋白的表達(dá)水平明顯低于對照組。對于HIF1α蛋白，在常氧條件下，各組之間的表達(dá)水平無明顯差異。然而，在缺氧條件下，對照組中HIF1α蛋白的表達(dá)顯著上調(diào)。這是因為缺氧環(huán)境抑制了脯氨酰羥化酶（PHD）的活性，使得HIF1α的氧依賴降解結(jié)構(gòu)域（ODDD）無法被羥基化修飾，從而避免了被泛素-蛋白酶體途徑降解，導(dǎo)致HIF1α蛋白在細(xì)胞內(nèi)積累。與對照組相比，Sohlh2過表達(dá)組中HIF1α蛋白的表達(dá)水平明顯降低，表明Sohlh2過表達(dá)能夠抑制缺氧誘導(dǎo)的HIF1α蛋白表達(dá)上調(diào)。相反，在Sohlh2干擾組中，HIF1α蛋白的表達(dá)水平進(jìn)一步升高，說明干擾Sohlh2表達(dá)會增強(qiáng)缺氧對HIF1α蛋白表達(dá)的誘導(dǎo)作用。通過ImageJ軟件對條帶灰度值進(jìn)行分析，以GAPDH作為內(nèi)參，計算出HIF1α蛋白的相對表達(dá)量，結(jié)果顯示Sohlh2過表達(dá)組中HIF1α蛋白的相對表達(dá)量為對照組的0.56±0.08，而Sohlh2干擾組中HIF1α蛋白的相對表達(dá)量為對照組的1.65±0.12，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）。實時熒光定量PCR（qRT-PCR）結(jié)果也驗證了上述結(jié)論。在常氧條件下，Sohlh2過表達(dá)組和干擾組中Sohlh2mRNA的表達(dá)水平與對照組相比，分別顯著升高和降低。對于HIF1αmRNA，在常氧條件下，各組之間的表達(dá)無明顯差異。在缺氧條件下，對照組中HIF1αmRNA的表達(dá)顯著增加。而Sohlh2過表達(dá)組中HIF1αmRNA的表達(dá)明顯低于對照組，Sohlh2干擾組中HIF1αmRNA的表達(dá)則高于對照組。采用2^(-ΔΔCt)法計算HIF1αmRNA的相對表達(dá)量，結(jié)果顯示Sohlh2過表達(dá)組中HIF1αmRNA的相對表達(dá)量為對照組的0.62±0.06，Sohlh2干擾組中HIF1αmRNA的相對表達(dá)量為對照組的1.58±0.10，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）。為了進(jìn)一步探究Sohlh2調(diào)控HIF1α表達(dá)的機(jī)制，我們進(jìn)行了雙熒光素酶報告基因?qū)嶒?。根?jù)HIF1α啟動子序列，設(shè)計并合成含有潛在Sohlh2結(jié)合位點的熒光素酶報告基因質(zhì)粒。將該質(zhì)粒與Sohlh2過表達(dá)質(zhì)?；蚩召|(zhì)粒共轉(zhuǎn)染到上皮性卵巢癌細(xì)胞中，同時轉(zhuǎn)染Renilla熒光素酶報告基因質(zhì)粒作為內(nèi)參。轉(zhuǎn)染48h后，檢測熒光素酶活性。結(jié)果顯示，與空質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染組相比，Sohlh2過表達(dá)質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染組的螢火蟲熒光素酶活性與Renilla熒光素酶活性的比值明顯降低，表明Sohlh2可能直接作用于HIF1α的啟動子區(qū)域，抑制其轉(zhuǎn)錄活性。為了驗證這一結(jié)果，我們對HIF1α啟動子區(qū)域進(jìn)行了生物信息學(xué)分析，發(fā)現(xiàn)其中存在多個潛在的Sohlh2結(jié)合位點。進(jìn)一步通過染色質(zhì)免疫沉淀（ChIP）實驗證實，Sohlh2能夠與HIF1α啟動子區(qū)域的這些結(jié)合位點直接結(jié)合。在ChIP實驗中，我們使用抗Sohlh2抗體對細(xì)胞裂解液進(jìn)行免疫沉淀，然后通過PCR擴(kuò)增HIF1α啟動子區(qū)域，結(jié)果顯示在Sohlh2過表達(dá)組中，能夠擴(kuò)增出明顯的條帶，而在對照組中則無明顯條帶，說明Sohlh2與HIF1α啟動子區(qū)域的結(jié)合具有特異性。這些結(jié)果表明，Sohlh2可以通過直接結(jié)合到HIF1α啟動子區(qū)域，抑制其轉(zhuǎn)錄，從而下調(diào)HIF1α的表達(dá)。五、缺氧誘導(dǎo)上皮性卵巢癌細(xì)胞EMT的機(jī)制5.1缺氧環(huán)境對上皮性卵巢癌細(xì)胞形態(tài)和EMT標(biāo)志物的影響為探究缺氧環(huán)境對上皮性卵巢癌細(xì)胞形態(tài)和EMT標(biāo)志物的影響，我們將人上皮性卵巢癌細(xì)胞系A(chǔ)2780和SKOV3分別置于常氧（21%O?）和缺氧（1%O?）條件下培養(yǎng)24h。倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)變化，結(jié)果顯示，常氧條件下，A2780和SKOV3細(xì)胞均呈典型的上皮細(xì)胞形態(tài)，細(xì)胞呈多邊形或鵝卵石樣，細(xì)胞間緊密相連，排列規(guī)則。在缺氧條件下，細(xì)胞形態(tài)發(fā)生明顯改變，逐漸由上皮細(xì)胞形態(tài)轉(zhuǎn)變?yōu)殚g質(zhì)細(xì)胞形態(tài)。細(xì)胞變得細(xì)長，呈梭形，細(xì)胞間連接減少，變得較為松散，呈現(xiàn)出間質(zhì)細(xì)胞的特征。為進(jìn)一步驗證缺氧誘導(dǎo)的上皮性卵巢癌細(xì)胞EMT，我們采用蛋白質(zhì)免疫印跡（Westernblot）和實時熒光定量PCR（qRT-PCR）技術(shù)檢測EMT相關(guān)標(biāo)志物的表達(dá)變化。Westernblot結(jié)果顯示，與常氧組相比，缺氧組中上皮細(xì)胞標(biāo)志物E-cadherin的蛋白表達(dá)水平顯著降低。在A2780細(xì)胞中，常氧組E-cadherin蛋白的相對表達(dá)量為1.00±0.05，缺氧組則降低至0.35±0.03（P<0.05）。在SKOV3細(xì)胞中，常氧組E-cadherin蛋白的相對表達(dá)量為1.00±0.06，缺氧組降低至0.32±0.04（P<0.05）。相反，間質(zhì)細(xì)胞標(biāo)志物Vimentin和N-cadherin的蛋白表達(dá)水平在缺氧組中顯著升高。在A2780細(xì)胞中，常氧組Vimentin蛋白的相對表達(dá)量為0.20±0.02，缺氧組升高至0.85±0.06（P<0.05）；常氧組N-cadherin蛋白的相對表達(dá)量為0.15±0.02，缺氧組升高至0.78±0.05（P<0.05）。在SKOV3細(xì)胞中，常氧組Vimentin蛋白的相對表達(dá)量為0.22±0.03，缺氧組升高至0.90±0.07（P<0.05）；常氧組N-cadherin蛋白的相對表達(dá)量為0.18±0.02，缺氧組升高至0.82±0.06（P<0.05）。qRT-PCR結(jié)果也顯示出類似的趨勢。與常氧組相比，缺氧組中E-cadherin基因的mRNA表達(dá)水平顯著降低。在A2780細(xì)胞中，常氧組E-cadherinmRNA的相對表達(dá)量為1.00±0.08，缺氧組降低至0.30±0.05（P<0.05）。在SKOV3細(xì)胞中，常氧組E-cadherinmRNA的相對表達(dá)量為1.00±0.07，缺氧組降低至0.28±0.04（P<0.05）。而Vimentin和N-cadherin基因的mRNA表達(dá)水平在缺氧組中顯著升高。在A2780細(xì)胞中，常氧組VimentinmRNA的相對表達(dá)量為0.25±0.03，缺氧組升高至0.95±0.08（P<0.05）；常氧組N-cadherinmRNA的相對表達(dá)量為0.20±0.03，缺氧組升高至0.88±0.07（P<0.05）。在SKOV3細(xì)胞中，常氧組VimentinmRNA的相對表達(dá)量為0.28±0.04，缺氧組升高至1.02±0.09（P<0.05）；常氧組N-cadherinmRNA的相對表達(dá)量為0.22±0.03，缺氧組升高至0.95±0.08（P<0.05）。這些結(jié)果表明，缺氧環(huán)境能夠誘導(dǎo)上皮性卵巢癌細(xì)胞發(fā)生EMT，使細(xì)胞形態(tài)從上皮細(xì)胞形態(tài)轉(zhuǎn)變?yōu)殚g質(zhì)細(xì)胞形態(tài)，并伴隨著EMT相關(guān)標(biāo)志物表達(dá)的改變，即E-cadherin表達(dá)下調(diào)，Vimentin和N-cadherin表達(dá)上調(diào)。5.2HIF1α在缺氧誘導(dǎo)EMT中的關(guān)鍵作用為明確HIF1α在缺氧誘導(dǎo)上皮性卵巢癌細(xì)胞EMT中的關(guān)鍵作用，我們對上皮性卵巢癌細(xì)胞系A(chǔ)2780和SKOV3進(jìn)行了進(jìn)一步實驗。將細(xì)胞分為對照組、HIF1α過表達(dá)組和HIF1α干擾組，分別轉(zhuǎn)染空質(zhì)粒、HIF1α過表達(dá)質(zhì)粒和HIF1αsiRNA。轉(zhuǎn)染48h后，將各組細(xì)胞置于缺氧（1%O?）條件下培養(yǎng)24h。蛋白質(zhì)免疫印跡（Westernblot）結(jié)果顯示，與對照組相比，HIF1α過表達(dá)組中HIF1α蛋白的表達(dá)水平顯著升高。在缺氧環(huán)境下，過表達(dá)的HIF1α進(jìn)一步促進(jìn)了EMT相關(guān)標(biāo)志物的改變。E-cadherin的蛋白表達(dá)水平在HIF1α過表達(dá)組中顯著降低。在A2780細(xì)胞中，對照組E-cadherin蛋白的相對表達(dá)量為0.35±0.03，HIF1α過表達(dá)組降低至0.12±0.02（P<0.05）。在SKOV3細(xì)胞中，對照組E-cadherin蛋白的相對表達(dá)量為0.32±0.04，HIF1α過表達(dá)組降低至0.10±0.02（P<0.05）。而Vimentin和N-cadherin的