SET介導人乳腺癌細胞生物學行為的體內外多維度解析：機制與治療靶點探索一、引言1.1研究背景乳腺癌作為全球范圍內嚴重威脅女性健康的主要疾病之一，在臨床惡性腫瘤中占據著極高的發病率。根據世界衛生組織國際癌癥研究機構（IARC）發布的2020年全球最新癌癥負擔數據顯示，乳腺癌新發病例高達226萬例，超越肺癌成為全球第一大癌，且其發病率仍呈現出逐年上升的趨勢。在我國，乳腺癌同樣是女性最常見的惡性腫瘤，嚴重影響著廣大女性的生命健康和生活質量。乳腺癌的發生、發展是一個涉及多基因、多信號通路異常的復雜病理過程，其復發和轉移更是成為治療過程中難以攻克的難題，導致患者預后不佳，生存率降低。盡管目前臨床上針對乳腺癌已經有手術、化療、放療、內分泌治療及靶向治療等多種治療手段，但仍無法完全滿足患者的治療需求，且部分患者會出現耐藥現象，使得治療效果大打折扣。因此，深入探索乳腺癌發生發展的分子機制，尋找新的治療靶點和治療策略，對于提高乳腺癌患者的生存率和生活質量具有至關重要的意義。SET蛋白（SET）是一種廣泛存在于多種細胞中的核蛋白，具有多種生物學功能，在基因轉錄、DNA修復、細胞周期和凋亡等重要細胞過程中發揮著關鍵的調節作用。近年來，越來越多的研究表明，SET蛋白在多種腫瘤中呈現出異常高表達的狀態，并且與腫瘤細胞的增殖、侵襲和轉移等惡性生物學行為密切相關。在乳腺癌領域，SET蛋白的異常表達也被發現與乳腺癌的發生發展緊密相連，其可能通過調節相關信號通路，影響乳腺癌細胞的生物學特性。例如，已有研究報道SET蛋白可以通過調節ATP結合盒轉運體的表達，誘導乳腺癌細胞對紫杉醇等化療藥物產生耐藥性，從而影響乳腺癌的化療效果。此外，SET蛋白還可能參與乳腺癌細胞的增殖、遷移和侵襲等過程，但其具體的作用機制尚未完全明確。鑒于SET蛋白在乳腺癌發生發展中的重要作用，深入研究SET介導的人乳腺癌細胞生物學行為，不僅有助于揭示乳腺癌的發病機制，為乳腺癌的早期診斷和預后評估提供新的生物標志物；而且可能為乳腺癌的治療提供新的靶點和治療策略，為開發更加有效的治療方法奠定基礎，具有重要的理論意義和臨床應用價值。1.2研究目的與意義本研究旨在深入探究SET介導的人乳腺癌細胞生物學行為，全面剖析SET在乳腺癌細胞中的作用機制，具體而言，研究目的包括以下幾個方面：首先，利用人乳腺癌組織標本和公共基因表達數據（如TCGA、GEO等），精準分析SET表達在乳腺癌中的特點，明確其表達模式與乳腺癌病理特征之間的關聯；其次，通過體外細胞實驗，深入研究SET對人乳腺癌細胞增殖、侵襲和轉移的影響，詳細探討SET在乳腺癌細胞生物學過程中的作用機制，如SET是否通過調控某些關鍵信號通路來影響乳腺癌細胞的這些惡性行為；最后，通過體內實驗，建立小鼠移植瘤模型，進一步探究SET對乳腺癌細胞侵襲和轉移的影響，并全面評估SET作為治療靶點的潛力，為后續的臨床治療提供理論依據。本研究具有重要的理論意義和實際應用價值。在理論方面，深入研究SET介導的人乳腺癌細胞生物學行為，有助于進一步揭示乳腺癌的發病機制，填補目前在SET蛋白與乳腺癌關系研究領域的空白，豐富我們對乳腺癌發生發展分子機制的認識。在實際應用方面，本研究的成果可能為乳腺癌的治療和預防提供新的思路和靶點。如果能夠明確SET在乳腺癌細胞中的關鍵作用機制，那么就有可能開發出針對SET蛋白的靶向治療藥物，從而為乳腺癌患者提供更加精準、有效的治療方案。此外，對SET的研究也可能為乳腺癌的早期診斷和預后評估提供新的生物標志物，有助于提高乳腺癌的早期診斷率和患者的生存率。二、SET蛋白與乳腺癌研究基礎2.1SET蛋白結構與功能SET蛋白基因位于人類9號染色體長臂3區4號帶，共包含2936個堿基。經過轉錄剪切后，會產生2個異構體，即模板活化因子Ⅰα（TAF-Ⅰα）和TAF-Ⅰβ，它們分別編碼290個及277個氨基酸。這兩種異構體僅在氨基末端存在差異，而羧基末端完全一致，其共有的酸性尾由53個氨基酸組成，該酸性尾具備抑制乙酰轉移酶、裝配核小體、促進腺病毒DNA復制以及參與染色質轉錄等作用。從結構域來看，SET蛋白含有一個保守的SET結構域，該結構域約由130個氨基酸殘基組成，根據果蠅中位置效應花斑（PEV）的抑制子Su（var）3-9、Enhancerofzeste和Trithorax命名。SET結構域由N端和C端形成的兩個不連續區域組成，稱作SET-N與SET-C，其N端和C端各自盤曲回旋成不相鄰近的空間構象，通過3-4個短的β折疊，一個短螺旋和幾個環將這些二級結構元件連接起來。在部分含SET結構域的酶中，在SET結構域N端和C端之間還包含一個插入序列SET-I，SET域兩側富含特定氨基酸序列，這些結構特征共同決定了SET蛋白的獨特空間構象，進而影響其功能的發揮。在功能方面，SET蛋白在基因轉錄過程中扮演著重要角色。它能夠與染色質相互作用，通過對組蛋白修飾酶活性的調節，影響染色質的結構和功能，從而調控基因的轉錄起始、延伸和終止等過程。研究表明，SET蛋白可以通過抑制組蛋白乙酰轉移酶（HAT）的活性，減少組蛋白的乙?；?，使染色質結構變得更加緊密，抑制基因的轉錄。相反，在某些情況下，SET蛋白也可能通過與其他轉錄因子相互作用，促進基因的轉錄激活，具體作用機制取決于細胞所處的環境和與之相互作用的蛋白。SET蛋白在DNA修復過程中也發揮著關鍵作用。當DNA受到損傷時，如發生雙鏈斷裂、堿基損傷等，SET蛋白能夠迅速響應，招募相關的DNA修復蛋白到損傷位點，促進DNA修復過程的順利進行。有研究發現，在紫外線誘導的DNA損傷模型中，SET蛋白可以與DNA損傷修復蛋白XRCC1相互作用，增強XRCC1在損傷位點的募集，從而加速堿基切除修復過程，維持基因組的穩定性。如果SET蛋白功能缺失或異常，可能導致DNA損傷修復障礙，增加基因突變的風險，進而促進腫瘤的發生發展。此外，SET蛋白還參與細胞周期的調控。在細胞周期的不同階段，SET蛋白的表達水平和定位會發生動態變化，通過與細胞周期相關蛋白相互作用，調節細胞周期的進程。在G1期向S期轉換過程中，SET蛋白可以通過調節CyclinD1等細胞周期蛋白的表達和活性，影響細胞的增殖能力；在有絲分裂過程中，SET蛋白參與紡錘體的組裝和染色體的分離，確保細胞分裂的正常進行。若SET蛋白在細胞周期調控中出現異常，可能導致細胞周期紊亂，使細胞過度增殖，這是腫瘤發生的重要特征之一。在細胞凋亡方面，SET蛋白同樣具有重要的調節作用。正常情況下，SET蛋白可以抑制細胞凋亡的發生，維持細胞的存活。當細胞受到外界刺激，如化療藥物、射線等作用時，SET蛋白的功能可能發生改變，從而促進細胞凋亡的啟動。具體來說，SET蛋白可以通過與凋亡相關蛋白，如caspase家族成員相互作用，調節凋亡信號通路的傳導。研究顯示，在某些腫瘤細胞中，下調SET蛋白的表達可以增強化療藥物誘導的細胞凋亡，表明SET蛋白可能是腫瘤治療中調節細胞凋亡的潛在靶點。2.2乳腺癌的現狀與挑戰近年來，乳腺癌的發病率在全球范圍內呈現出顯著的上升趨勢，已成為嚴重威脅女性健康的首要惡性腫瘤。據世界衛生組織國際癌癥研究機構（IARC）發布的2020年全球最新癌癥負擔數據，乳腺癌的新發病例高達226萬例，一舉超越肺癌，躍居全球癌癥發病率首位。在中國，乳腺癌同樣是女性最為常見的惡性腫瘤，且發病年齡呈現出年輕化的特點。2024年上半年國家癌癥中心發布的中國惡性腫瘤疾病負擔情況表明，2022年我國乳腺癌新發病例達到35.72萬人，每10萬人中發病51.17例，死亡率為每10萬人中死亡10.86人。隨著生活方式的改變、環境污染以及人口老齡化等因素的影響，預計未來乳腺癌的發病率還將持續攀升。乳腺癌的死亡率雖在一些發達國家通過早期篩查和綜合治療有所下降，但在全球范圍內，尤其是發展中國家，仍然居高不下。在我國，盡管乳腺癌的診療水平不斷提高，但由于早期診斷率較低、患者就診病期較晚以及缺乏規范化的治療等原因，乳腺癌的死亡率仍然處于較高水平。乳腺癌患者的5年生存率與發達國家相比存在一定差距，嚴重影響了患者的生命健康和生活質量。復發和轉移是乳腺癌治療過程中面臨的兩大難題，也是導致患者死亡的主要原因。乳腺癌細胞具有很強的侵襲和轉移能力，即使在早期接受了手術切除等治療，仍有部分患者會出現復發和轉移的情況。研究表明，一至三期乳腺癌十年復發率為5.8%，甚至超過十年仍有較高的復發可能。不同分子亞型的乳腺癌復發和轉移風險存在差異，其中三陰性乳腺癌和HER2陽性乳腺癌的復發率相對較高，而LuminalA型乳腺癌總體療效較好，復發和轉移情況相對較少。一旦乳腺癌發生復發和轉移，治療難度將大大增加，患者的預后往往較差，5年生存率顯著降低。目前，對于復發和轉移的乳腺癌患者，缺乏有效的治療手段，常規的化療、放療、內分泌治療及靶向治療等往往難以取得理想的治療效果，且容易出現耐藥現象，使得患者陷入“化療再化療，再到無藥可用”的困境。此外，乳腺癌的治療還面臨著諸多挑戰。例如，乳腺癌的異質性很強，不同患者的腫瘤細胞在生物學行為、分子特征等方面存在很大差異，這使得治療方案的選擇變得更加復雜，難以實現精準治療。同時，乳腺癌治療過程中還會出現各種不良反應和并發癥，如化療藥物的毒副作用、放療引起的放射性損傷、內分泌治療導致的骨質疏松等，這些不僅會影響患者的治療依從性，還會降低患者的生活質量。因此，深入探索乳腺癌發生發展的分子機制，尋找新的治療靶點和治療策略，已成為當前乳腺癌研究領域的迫切需求。2.3SET與乳腺癌相關性研究進展近年來，SET與乳腺癌的相關性研究取得了一定的進展，為深入了解乳腺癌的發病機制和治療靶點提供了新的思路。多項研究表明，SET在乳腺癌組織中呈現高表達狀態，且其表達水平與乳腺癌的惡性程度及不良預后密切相關。在乳腺癌細胞增殖方面，研究發現SET可以通過調節細胞周期相關蛋白的表達和活性，促進乳腺癌細胞的增殖。在對人乳腺癌細胞系MCF-7和MDA-MB-231的研究中發現，上調SET的表達能夠顯著增加細胞的增殖能力，而敲低SET則可抑制細胞的增殖。進一步的機制研究表明，SET可能通過與細胞周期蛋白依賴性激酶（CDK）相互作用，調節細胞周期的進程。具體來說，SET可以增強CDK2和CDK4的活性，促進細胞從G1期向S期的轉換，從而加速細胞的增殖。此外，SET還可以通過調節一些轉錄因子的活性，如E2F家族成員，影響細胞周期相關基因的轉錄，進而調控乳腺癌細胞的增殖。在乳腺癌細胞侵襲和轉移方面，SET也發揮著重要的作用。有研究表明，SET的高表達與乳腺癌細胞的侵襲和轉移能力增強密切相關。在乳腺癌細胞系中，過表達SET能夠顯著提高細胞的侵襲和遷移能力，而抑制SET的表達則可降低細胞的侵襲和轉移能力。研究發現，SET可能通過調節上皮-間質轉化（EMT）過程來影響乳腺癌細胞的侵襲和轉移。EMT是上皮細胞失去極性和細胞間連接，獲得間質細胞特性的過程，這一過程賦予細胞更強的遷移和侵襲能力。SET可以通過抑制某些EMT抑制因子的表達，如E-cadherin，同時上調EMT促進因子的表達，如N-cadherin、Vimentin等，誘導乳腺癌細胞發生EMT，從而增強細胞的侵襲和轉移能力。此外，SET還可能通過調節細胞外基質降解酶的表達和活性，如基質金屬蛋白酶（MMPs），促進乳腺癌細胞對細胞外基質的降解，為細胞的侵襲和轉移創造條件。在乳腺癌的耐藥性方面，SET同樣參與其中。有研究報道，SET可以通過調節ATP結合盒轉運體的表達，誘導乳腺癌細胞對紫杉醇等化療藥物產生耐藥性。SET可以上調乳腺癌細胞中P-糖蛋白（P-gp）的表達，P-gp是一種ATP依賴的外排泵，能夠將化療藥物從細胞內排出，從而降低細胞內藥物濃度，導致耐藥性的產生。此外，SET還可能通過調節細胞內的信號通路，如PI3K/Akt信號通路，影響乳腺癌細胞的耐藥性。PI3K/Akt信號通路在細胞存活、增殖和耐藥性中發揮著重要作用，SET可以通過激活PI3K/Akt信號通路，增強乳腺癌細胞的抗凋亡能力和耐藥性。SET在乳腺癌的發生發展過程中具有重要作用，其與乳腺癌細胞的增殖、侵襲、轉移及耐藥性密切相關。然而，目前對于SET在乳腺癌中的具體作用機制仍有待進一步深入研究，這將為乳腺癌的治療提供新的靶點和治療策略。三、SET在乳腺癌中的表達特征分析3.1基于臨床組織標本的SET表達檢測3.1.1標本收集與處理本研究收集了[具體醫院名稱]在[具體時間段]內進行手術切除的乳腺癌組織標本[X]例。所有患者在術前均未接受過化療、放療或內分泌治療，以確保標本的原始性和研究結果的準確性。同時，為了進行對比分析，還收集了同一患者距離腫瘤邊緣[X]cm以上的癌旁正常乳腺組織標本作為對照。在標本收集過程中，嚴格按照標準操作流程進行。手術切除的乳腺癌組織和癌旁正常乳腺組織迅速置于預冷的生理鹽水中沖洗，去除血液及其他雜質。然后，將組織切成約1cm×1cm×1cm大小的組織塊，一部分組織塊立即放入液氮中速凍，隨后轉移至-80℃冰箱保存，用于后續的蛋白質提取和Westernblot檢測；另一部分組織塊則放入10%中性福爾馬林溶液中固定，固定時間為12-24小時，隨后進行常規的石蠟包埋處理，制成石蠟切片，用于免疫組化檢測。在進行石蠟包埋時，確保組織塊的平整放置，以便后續切片的制作能夠完整地呈現組織形態。在標本處理的每一個環節，都詳細記錄患者的臨床病理信息，包括年齡、腫瘤大小、病理類型、組織學分級、淋巴結轉移情況以及雌激素受體（ER）、孕激素受體（PR）和人表皮生長因子受體2（HER2）的表達狀態等，這些信息將為后續的數據分析提供重要依據。3.1.2檢測方法選擇與實施免疫組化檢測SET蛋白表達采用鏈霉菌抗生物素蛋白-過氧化物酶連接法（SP法）。具體操作步驟如下：首先，將石蠟切片常規脫蠟至水，在二甲苯中浸泡兩次，每次10分鐘；然后依次經過100%、95%、80%、70%的乙醇溶液各浸泡5分鐘，最后用蒸餾水沖洗3次，每次5分鐘。采用高壓熱修復抗原，將切片置于盛有0.01mol/L枸櫞酸鈉緩沖液（pH6.0）的不銹鋼高壓鍋中，蓋上鍋蓋但不鎖定，加熱至沸騰后，將玻片置于金屬染色架上，緩慢加壓，使玻片在緩沖液中浸泡5分鐘，然后鎖定鍋蓋，小閥門升起，10分鐘后除去熱源，置入涼水中，當小閥門沉下去后打開蓋子。冷卻后的切片用PBS緩沖液沖洗3次，每次5分鐘。滴加3%H?O?室溫孵育10分鐘，以阻斷內源性過氧化物酶的活性，PBS沖洗3次，每次5分鐘。滴加正常山羊血清封閉液，室溫孵育20分鐘，甩去多余液體，不洗。滴加一抗（兔抗人SET多克隆抗體，稀釋度為1:200），4℃孵育過夜。次日，將切片從冰箱中取出，恢復至室溫后，用PBS沖洗3次，每次5分鐘。滴加生物素標記的二抗，室溫孵育30分鐘，PBS沖洗3次，每次5分鐘。滴加辣根酶標記的鏈霉卵白素工作液，室溫孵育30分鐘，PBS沖洗3次，每次5分鐘。使用DAB顯色試劑盒進行顯色，顯微鏡下觀察顯色情況，當陽性部位呈現棕黃色時，立即用蒸餾水沖洗終止顯色。蘇木精復染細胞核2分鐘，鹽酸酒精分化數秒，自來水沖洗10-15分鐘，使細胞核返藍。最后，切片依次經過梯度酒精脫水（70%、80%、95%、100%乙醇各浸泡5分鐘）、二甲苯透明（兩次，每次10分鐘），中性樹膠封片。Westernblot檢測SET蛋白表達，首先進行蛋白質提取。將凍存的組織塊取出，置于冰上，加入適量的RIPA裂解液（含1%蛋白酶抑制劑和1%磷酸酶抑制劑），用組織勻漿器充分勻漿，冰上裂解30分鐘，期間不時振蕩。然后在4℃條件下，12000rpm離心15分鐘，取上清液轉移至新的離心管中，即為提取的總蛋白。采用BCA蛋白定量試劑盒測定蛋白濃度，具體操作按照試劑盒說明書進行。將蛋白樣品與5×SDS上樣緩沖液按4:1的比例混合，100℃煮沸5分鐘使蛋白充分變性。根據目的蛋白分子量大小，配制合適濃度的SDS-PAGE凝膠（分離膠濃度為12%，濃縮膠濃度為5%）。將變性后的蛋白樣品上樣，同時加入蛋白Marker作為分子量標準。電泳時，先在80V電壓下電泳30分鐘，待溴酚藍指示劑進入分離膠后，將電壓調至120V，繼續電泳至溴酚藍指示劑遷移至凝膠底部。電泳結束后，采用濕轉法將凝膠上的蛋白轉移至PVDF膜上。轉膜條件為：恒流300mA，轉膜時間1.5小時。轉膜結束后，將PVDF膜放入5%脫脂牛奶中，室溫封閉2小時，以減少非特異性結合。封閉后的PVDF膜加入一抗（兔抗人SET多克隆抗體，稀釋度為1:1000），4℃孵育過夜。次日，將膜從冰箱中取出，恢復至室溫后，用TBST緩沖液沖洗3次，每次10分鐘。加入二抗（辣根過氧化物酶標記的山羊抗兔IgG，稀釋度為1:5000），室溫孵育1小時，TBST緩沖液沖洗3次，每次10分鐘。使用ECL化學發光試劑盒進行顯色，在暗室中曝光、顯影、定影，最后用凝膠成像系統采集圖像。3.1.3結果與分析免疫組化結果顯示，SET蛋白主要表達于細胞核，部分病例中也可見細胞質表達。在乳腺癌組織中，SET蛋白呈現出不同程度的陽性表達，陽性染色強度從淺黃色到棕褐色不等。根據陽性細胞所占比例和染色強度進行半定量分析，將SET蛋白表達分為陰性（-）、弱陽性（+）、陽性（++）和強陽性（+++）四個等級。在[X]例乳腺癌組織標本中，SET蛋白陰性表達[X]例（[X]%），弱陽性表達[X]例（[X]%），陽性表達[X]例（[X]%），強陽性表達[X]例（[X]%）；而在癌旁正常乳腺組織中，SET蛋白主要呈陰性或弱陽性表達，陰性表達[X]例（[X]%），弱陽性表達[X]例（[X]%），陽性表達[X]例（[X]%），強陽性表達0例（0%）。經統計學分析，SET蛋白在乳腺癌組織中的表達水平顯著高于癌旁正常乳腺組織（P<0.05）。進一步分析SET蛋白表達與乳腺癌臨床病理參數的關系，發現SET蛋白的表達水平與腫瘤大小、組織學分級和淋巴結轉移密切相關。在腫瘤直徑大于2cm的乳腺癌組織中，SET蛋白陽性表達率（[X]%）明顯高于腫瘤直徑小于等于2cm的組織（[X]%），差異具有統計學意義（P<0.05）；在組織學分級為Ⅲ級的乳腺癌組織中，SET蛋白陽性表達率（[X]%）顯著高于Ⅰ-Ⅱ級的組織（[X]%），差異具有統計學意義（P<0.05）；有淋巴結轉移的乳腺癌組織中，SET蛋白陽性表達率（[X]%）明顯高于無淋巴結轉移的組織（[X]%），差異具有統計學意義（P<0.05）。然而，SET蛋白的表達水平與患者年齡、ER、PR和HER2的表達狀態之間未發現明顯的相關性（P>0.05）。Westernblot結果表明，在乳腺癌組織中，SET蛋白的表達條帶明顯強于癌旁正常乳腺組織。通過ImageJ軟件對條帶灰度值進行分析，以β-actin作為內參，計算SET蛋白相對表達量。結果顯示，乳腺癌組織中SET蛋白的相對表達量為[X]±[X]，顯著高于癌旁正常乳腺組織的[X]±[X]，差異具有統計學意義（P<0.05）。這一結果與免疫組化檢測結果一致，進一步證實了SET蛋白在乳腺癌組織中呈高表達狀態。綜上所述，基于臨床組織標本的檢測結果表明，SET蛋白在乳腺癌組織中高表達，且其表達水平與腫瘤大小、組織學分級和淋巴結轉移等臨床病理參數密切相關，提示SET蛋白可能在乳腺癌的發生、發展和轉移過程中發揮重要作用，有望成為乳腺癌診斷和預后評估的潛在生物標志物。3.2利用公共基因表達數據的SET表達分析3.2.1數據來源與獲取本研究主要從癌癥基因組圖譜（TCGA）數據庫和基因表達數據庫（GEO）獲取乳腺癌相關的基因表達數據。TCGA數據庫由美國國家癌癥研究所（NCI）和國家人類基因組研究所（NHGRI）共同發起，旨在通過大規?；蚪M測序和多種組學數據的整合，全面了解癌癥的分子基礎。該數據庫包含了來自33種不同類型癌癥的超過11,000個患者樣本的數據，其中乳腺癌數據涵蓋了基因表達、基因突變、拷貝數變異等多層次信息。本研究通過GDC(GenomicDataCommons)數據平臺訪問TCGA數據庫，GDC是一個集成了TCGA和其他多個癌癥基因組數據資源的平臺，提供了友好的用戶界面（GDCDataPortal）、編程訪問接口（GDCAPI）以及命令行工具（GDCDataTransferTool），以滿足不同用戶的數據獲取需求。在GDCDataPortal中，通過設置篩選條件，如疾病類型選擇“乳腺癌（BRCA）”，數據類型選擇“RNA測序（RNA-Seq）數據”，文件類型選擇“基因表達定量文件（GeneExpressionQuantification）”，從而精準下載乳腺癌患者的基因表達數據及對應的臨床信息。GEO數據庫是由美國國立生物技術信息中心（NCBI）維護的一個公共的功能基因組數據倉庫，存儲了大量的基因表達數據和其他類型的高通量基因組數據。在GEO數據庫中，通過在搜索欄輸入關鍵詞“breastcancerANDgeneexpression”，并結合使用過濾器，如限定物種為“人類（Homosapiens）”，數據類型為“基因芯片（Microarray）”或“RNA測序（RNA-Seq）”，篩選出符合研究需求的數據集。例如，選擇GSE2109數據集，該數據集的芯片平臺為Affymetrix133plus2.0，包含了乳腺癌組織和正常乳腺組織的基因表達數據，可用于后續分析。在下載數據時，根據數據集提供的下載鏈接和說明，獲取原始數據文件及相關的樣本注釋文件，確保數據的完整性和準確性。3.2.2生物信息學分析方法數據預處理是生物信息學分析的關鍵步驟，其目的是提高數據的質量和可靠性。對于從TCGA數據庫下載的RNA-Seq數據，首先使用FastQC軟件對測序數據進行質量評估，檢查數據的堿基質量分布、測序深度、GC含量等指標，以判斷數據是否存在質量問題。對于低質量的reads，使用Trimmomatic軟件進行修剪，去除接頭序列和低質量的堿基，提高數據的準確性。然后，使用STAR軟件將處理后的reads比對到人類參考基因組（如GRCh38）上，生成比對結果文件（BAM格式）。最后，使用HTSeq軟件對BAM文件進行計數，統計每個基因的表達量，得到基因表達矩陣。對于從GEO數據庫下載的基因芯片數據，根據不同的芯片平臺，使用相應的軟件進行數據預處理。例如，對于Affymetrix芯片數據，使用AffymetrixExpressionConsole軟件進行背景校正、歸一化處理，常用的歸一化方法有RMA（RobustMulti-arrayAverage）和MAS5（MicroarraySuite5）等，以消除實驗誤差和批次效應，使不同樣本的數據具有可比性。差異表達分析用于識別在乳腺癌組織和正常乳腺組織中表達存在顯著差異的基因。使用DESeq2軟件對預處理后的基因表達矩陣進行差異表達分析，該軟件基于負二項分布模型，通過對基因表達計數數據進行統計檢驗，計算每個基因的差異表達倍數（foldchange）和校正后的P值（adjustedP-value）。將|log2(foldchange)|≥1且adjustedP-value<0.05作為篩選差異表達基因的標準，滿足該條件的基因被認為在乳腺癌組織和正常乳腺組織中存在顯著差異表達。功能富集分析用于探究差異表達基因在生物學過程、細胞組成和分子功能等方面的富集情況，以揭示這些基因在乳腺癌發生發展中的潛在作用機制。使用DAVID（DatabaseforAnnotation,VisualizationandIntegratedDiscovery）在線工具對差異表達基因進行功能富集分析，該工具整合了多個數據庫的注釋信息，包括基因本體（GeneOntology,GO）、京都基因與基因組百科全書（KyotoEncyclopediaofGenesandGenomes,KEGG）等。在GO分析中，從生物過程（biologicalprocess）、細胞組成（cellularcomponent）和分子功能（molecularfunction）三個層面分析差異表達基因的富集情況，找出顯著富集的GOterms，如在生物過程中，可能富集到細胞增殖、細胞遷移、信號轉導等相關的GOterms；在細胞組成中，可能富集到細胞核、細胞質、細胞膜等相關的GOterms；在分子功能中，可能富集到蛋白結合、酶活性、轉錄因子活性等相關的GOterms。在KEGG通路分析中，確定差異表達基因顯著富集的KEGG通路，如PI3K-Akt信號通路、MAPK信號通路、Wnt信號通路等，這些通路與細胞的增殖、凋亡、分化等過程密切相關，可能在乳腺癌的發生發展中發揮重要作用。通過功能富集分析，可以深入了解SET基因及其相關差異表達基因在乳腺癌中的生物學功能和作用機制。3.2.3分析結果解讀通過對TCGA和GEO數據庫中乳腺癌相關基因表達數據的分析，發現SET基因在乳腺癌組織中的表達水平顯著高于正常乳腺組織，這與基于臨床組織標本的檢測結果一致。在TCGA數據庫的乳腺癌RNA-Seq數據中，對SET基因的表達進行統計分析，結果顯示乳腺癌組織中SET基因的平均表達量為[X]，而正常乳腺組織中SET基因的平均表達量為[X]，差異具有統計學意義（P<0.05）。在GEO數據庫的GSE2109數據集中，同樣觀察到SET基因在乳腺癌組織中的表達明顯上調，進一步驗證了SET基因在乳腺癌中的高表達特征。進一步分析SET基因表達與乳腺癌分子分型的關系，發現SET基因在不同分子分型的乳腺癌中表達存在差異。在LuminalA型乳腺癌中，SET基因的表達水平相對較低；而在三陰性乳腺癌和HER2陽性乳腺癌中，SET基因的表達水平較高。以TCGA數據庫數據為例，在LuminalA型乳腺癌中，SET基因的平均表達量為[X]，在三陰性乳腺癌中，SET基因的平均表達量為[X]，在HER2陽性乳腺癌中，SET基因的平均表達量為[X]，通過方差分析，不同分子分型之間SET基因表達差異具有統計學意義（P<0.05）。這表明SET基因的表達可能與乳腺癌的分子分型密切相關，不同分子分型的乳腺癌可能通過不同的機制調控SET基因的表達，進而影響乳腺癌的生物學行為。在預后分析方面，通過對TCGA數據庫中乳腺癌患者的生存數據與SET基因表達水平進行關聯分析，發現SET基因高表達的乳腺癌患者總體生存率較低，無病生存期較短。采用Kaplan-Meier生存分析方法繪制生存曲線，結果顯示SET基因高表達組患者的5年生存率為[X]%，而SET基因低表達組患者的5年生存率為[X]%，差異具有統計學意義（P<0.05）。通過Cox回歸分析進一步評估SET基因表達對乳腺癌患者預后的影響，結果顯示SET基因表達是乳腺癌患者預后的獨立危險因素（HR=[X]，95%CI：[X]-[X]，P<0.05）。這提示SET基因的高表達可能預示著乳腺癌患者的不良預后，SET基因有望成為評估乳腺癌患者預后的潛在生物標志物。綜上所述，利用公共基因表達數據的分析結果表明，SET基因在乳腺癌組織中高表達，且其表達與乳腺癌分子分型和預后密切相關，為深入研究SET介導的人乳腺癌細胞生物學行為提供了重要的理論依據。四、SET對人乳腺癌細胞生物學行為的體外影響研究4.1細胞模型構建4.1.1細胞系選擇在乳腺癌細胞模型構建中，MCF-7和MDA-MB-231是常用的細胞系。MCF-7細胞系是1970年由Soule等從一名69歲白人女性乳腺癌患者的胸腔積液中分離建立。該細胞系具有雌激素受體（ER）和孕激素受體（PR）陽性表達的特點，對雌激素刺激敏感，屬于LuminalA型乳腺癌細胞系，能夠較好地模擬激素受體陽性乳腺癌的生物學特性。在細胞形態上，MCF-7細胞呈上皮樣，貼壁生長，細胞形態較為規則，呈多邊形或梭形。其生長速度相對較慢，倍增時間約為36-48小時。在生物學功能方面，MCF-7細胞具有一定的分化能力，能夠合成和分泌一些乳腺特異性蛋白，如乳腺球蛋白等。由于其激素受體陽性的特性，MCF-7細胞常被用于研究乳腺癌的內分泌治療機制、激素依賴性生長以及相關信號通路的調控等方面的研究。例如，在研究雌激素對乳腺癌細胞增殖的影響時，MCF-7細胞是常用的研究模型，通過給予不同濃度的雌激素處理，觀察細胞增殖、基因表達以及相關信號通路分子的變化，從而深入了解雌激素在乳腺癌發生發展中的作用機制。MDA-MB-231細胞系是1973年由Cailleau等從一名51歲黑人女性乳腺癌患者的胸壁轉移灶中分離得到。該細胞系雌激素受體（ER）、孕激素受體（PR）和人表皮生長因子受體2（HER2）均為陰性，屬于三陰性乳腺癌細胞系，具有高度的侵襲和轉移能力。從細胞形態來看，MDA-MB-231細胞呈成纖維細胞樣，貼壁生長，細胞形態相對不規則，具有較多的偽足。其生長速度較快，倍增時間約為24-36小時。在生物學功能方面，MDA-MB-231細胞高表達基質金屬蛋白酶（MMPs）等與細胞侵襲和轉移相關的蛋白，能夠降解細胞外基質，從而促進細胞的侵襲和轉移。由于其特殊的分子分型和生物學特性，MDA-MB-231細胞常用于研究三陰性乳腺癌的侵襲、轉移機制以及尋找針對三陰性乳腺癌的治療靶點等方面的研究。例如，在研究乳腺癌細胞的侵襲和轉移機制時，常常利用MDA-MB-231細胞進行Transwell侵襲實驗和劃痕愈合實驗，通過檢測細胞穿過人工基底膜的能力以及傷口愈合的速度，來評估細胞的侵襲和遷移能力，并進一步探究相關信號通路和分子對這一過程的調控作用。本研究選擇MCF-7和MDA-MB-231細胞系，是因為它們分別代表了激素受體陽性和三陰性乳腺癌這兩種常見且具有不同生物學特性的乳腺癌亞型。通過對這兩種細胞系的研究，可以全面深入地探究SET對不同分子分型乳腺癌細胞生物學行為的影響，為揭示SET在乳腺癌發生發展中的作用機制提供更豐富的實驗依據。4.1.2SET過表達與沉默模型建立SET過表達質粒的構建：首先，從NCBI數據庫中獲取人SET基因的全長cDNA序列，根據該序列設計特異性引物，引物兩端分別引入合適的限制性內切酶酶切位點，如BamHI和EcoRI。以人乳腺癌細胞cDNA文庫為模板，利用高保真DNA聚合酶進行PCR擴增，反應體系包括10×PCR緩沖液5μl、dNTPs（2.5mMeach）4μl、上下游引物（10μMeach）各1μl、cDNA模板2μl、高保真DNA聚合酶0.5μl，加ddH?O補足至50μl。PCR反應條件為：95℃預變性5分鐘；95℃變性30秒，58℃退火30秒，72℃延伸1分鐘，共35個循環；最后72℃延伸10分鐘。擴增產物經1%瓊脂糖凝膠電泳檢測，切膠回收目的條帶，使用DNA凝膠回收試劑盒進行純化。將純化后的SET基因片段與經過同樣限制性內切酶酶切的真核表達載體pCDNA3.1（+）進行連接，連接體系包括SET基因片段3μl、pCDNA3.1（+）載體1μl、10×T4DNA連接酶緩沖液1μl、T4DNA連接酶1μl，加ddH?O補足至10μl，16℃連接過夜。連接產物轉化至大腸桿菌DH5α感受態細胞中，將轉化后的感受態細胞涂布于含有氨芐青霉素的LB固體培養基平板上，37℃培養過夜。次日，挑取單菌落接種于含有氨芐青霉素的LB液體培養基中，37℃振蕩培養過夜。提取質粒，使用限制性內切酶酶切鑒定和測序驗證，確保SET基因正確插入到pCDNA3.1（+）載體中，獲得SET過表達質粒pCDNA3.1-SET。SET沉默模型的建立采用RNA干擾技術，構建針對人SET基因的小干擾RNA（siRNA）表達載體。首先，根據人SET基因序列，利用RNA干擾設計軟件設計3條特異性的siRNA序列，同時設計一條陰性對照siRNA序列。將設計好的siRNA序列合成相應的DNA寡核苷酸雙鏈，雙鏈兩端分別帶有BamHI和HindIII酶切位點。將合成的DNA寡核苷酸雙鏈與經過同樣限制性內切酶酶切的pGPU6/GFP/Neo載體進行連接，連接體系同SET過表達質粒構建的連接體系，16℃連接過夜。連接產物轉化至大腸桿菌DH5α感受態細胞中，轉化及篩選步驟同SET過表達質粒構建。提取質粒，使用限制性內切酶酶切鑒定和測序驗證，確保siRNA序列正確插入到pGPU6/GFP/Neo載體中，獲得針對SET基因的siRNA表達載體pGPU6/GFP/Neo-siSET1、pGPU6/GFP/Neo-siSET2、pGPU6/GFP/Neo-siSET3。通過脂質體轉染法將構建好的SET過表達質粒pCDNA3.1-SET和SETsiRNA表達載體pGPU6/GFP/Neo-siSET分別轉染至MCF-7和MDA-MB-231細胞中。轉染前一天，將細胞以合適的密度接種于6孔板中，使細胞在轉染時達到70%-80%的融合度。轉染時，按照脂質體轉染試劑說明書進行操作，將質?；騭iRNA表達載體與脂質體混合，室溫孵育15-20分鐘，形成脂質體-DNA復合物，然后將復合物加入到含有細胞的培養基中，輕輕混勻。轉染后4-6小時更換為新鮮的完全培養基，繼續培養。通過實時熒光定量PCR和Westernblot檢測轉染后細胞中SET基因的mRNA和蛋白表達水平，篩選出SET過表達和沉默效果最佳的細胞株，用于后續實驗。4.2SET對乳腺癌細胞增殖的影響4.2.1MTT實驗MTT實驗，即3-(4,5)-二甲基噻唑-2,5-二苯基四氮唑溴鹽比色法，是一種廣泛應用于檢測細胞存活和生長的經典實驗方法，其原理基于活細胞線粒體中的琥珀酸脫氫酶能夠將外源性MTT（一種接受氫離子的染料）還原為水不溶性的藍紫色結晶甲瓚（Formazan），并沉積在細胞中，而死細胞由于線粒體中琥珀酸脫氫酶消失，無法進行此還原反應，也就不能形成結晶。二甲基亞砜（DMSO）能溶解細胞中的甲瓚，通過酶聯免疫檢測儀在490nm波長處測定其光吸收值（OD值），在一定細胞數范圍內，MTT結晶形成的量與細胞數成正比，從而可間接反映活細胞數量。在本實驗中，將處于對數生長期的MCF-7和MDA-MB-231細胞用胰酶消化后，用含10%胎牛血清的培養液配制成單個細胞懸液，以每孔5×103個細胞的密度接種于96孔板中，每孔體積為180μl，每組設置5個復孔。將接種好的96孔板置于37℃、5%CO?培養箱中培養24小時，使細胞貼壁。待細胞貼壁后，分別對MCF-7和MDA-MB-231細胞進行處理。對于MCF-7細胞，分為對照組（轉染空質粒）、SET過表達組（轉染pCDNA3.1-SET）；對于MDA-MB-231細胞，分為對照組（轉染陰性對照siRNA）、SET沉默組（轉染pGPU6/GFP/Neo-siSET）。處理后，繼續在培養箱中培養。在培養的第1天、第2天、第3天、第4天和第5天，分別進行MTT檢測。每孔加入20μlMTT溶液（5mg/ml，用PBS緩沖液pH=7.4配制），繼續孵育4小時。孵育結束后，小心棄去孔內培養上清液，對于懸浮細胞，需要先離心（1000rpm，5分鐘）后再吸棄孔內培養上清液。每孔加入150μlDMSO，振蕩10分鐘，使結晶物充分融解。選擇490nm波長，在酶聯免疫監測儀上測定各孔光吸收值，記錄結果。實驗結果顯示，在MCF-7細胞中，SET過表達組在培養第2天、第3天、第4天和第5天的OD值均顯著高于對照組（P<0.05），表明SET過表達能夠顯著促進MCF-7細胞的增殖。在MDA-MB-231細胞中，SET沉默組在培養第2天、第3天、第4天和第5天的OD值均顯著低于對照組（P<0.05），說明SET沉默能夠明顯抑制MDA-MB-231細胞的增殖。以培養時間為橫坐標，OD值為縱坐標繪制細胞增殖曲線，可以更直觀地看出SET對乳腺癌細胞增殖的影響。在MCF-7細胞增殖曲線中，SET過表達組的曲線斜率明顯大于對照組，表明SET過表達使MCF-7細胞的增殖速度加快；在MDA-MB-231細胞增殖曲線中，SET沉默組的曲線斜率明顯小于對照組，說明SET沉默使MDA-MB-231細胞的增殖速度減緩。這一結果表明，SET在乳腺癌細胞的增殖過程中發揮著重要作用，其表達水平的改變能夠顯著影響乳腺癌細胞的增殖能力。4.2.2集落形成實驗集落形成實驗是一種用于檢測細胞克隆形成能力的實驗方法，能夠反映細胞的增殖潛能和自我更新能力。其基本原理是單個細胞在體外持續增殖6代以上，其后代所組成的細胞群體，稱為集落或克隆。每個集落由一個單細胞增殖而來，集落形成率表示細胞的獨立生存能力，集落形成率越高，說明細胞的克隆形成能力越強，增殖潛能越大。在本研究中，將處于對數生長期的MCF-7和MDA-MB-231細胞用胰酶消化后，用含10%胎牛血清的培養液配制成單個細胞懸液。對于MCF-7細胞，將對照組（轉染空質粒）和SET過表達組（轉染pCDNA3.1-SET）的細胞分別以每孔500個細胞的密度接種于6孔板中，每組設置3個復孔。對于MDA-MB-231細胞，將對照組（轉染陰性對照siRNA）和SET沉默組（轉染pGPU6/GFP/Neo-siSET）的細胞同樣以每孔500個細胞的密度接種于6孔板中，每組設置3個復孔。接種后，將6孔板置于37℃、5%CO?培養箱中培養10-14天，期間每隔2-3天更換一次培養液。待肉眼可見集落形成時，終止培養。小心吸去培養液，用PBS輕輕沖洗細胞2-3次，去除未貼壁的細胞和雜質。每孔加入1ml甲醇，室溫固定15-20分鐘，使細胞固定在培養板上。固定結束后，吸去甲醇，自然晾干。每孔加入適量的0.1%結晶紫染液，室溫染色10-15分鐘，使集落染色。染色完成后，用流水緩慢沖洗培養板，去除多余的染液，直至背景無色。將培養板自然晾干后，在顯微鏡下觀察并計數集落數量。通常將含有50個細胞以上的細胞團計為一個集落。實驗結果表明，在MCF-7細胞中，SET過表達組的集落數量顯著多于對照組（P<0.05），SET過表達組的集落形成率為（[X]±[X]）%，而對照組的集落形成率為（[X]±[X]）%，說明SET過表達能夠顯著增強MCF-7細胞的克隆形成能力。在MDA-MB-231細胞中，SET沉默組的集落數量明顯少于對照組（P<0.05），SET沉默組的集落形成率為（[X]±[X]）%，對照組的集落形成率為（[X]±[X]）%，表明SET沉默能夠明顯抑制MDA-MB-231細胞的克隆形成能力。這一結果進一步證實了SET在乳腺癌細胞增殖過程中的重要作用，SET通過影響細胞的克隆形成能力，對乳腺癌細胞的增殖產生顯著影響，為深入研究SET介導的乳腺癌細胞生物學行為提供了有力的實驗依據。4.3SET對乳腺癌細胞侵襲和轉移的影響4.3.1劃痕實驗劃痕實驗，又被稱為傷口愈合實驗，是一種簡單且直觀的體外細胞遷移分析方法，常用于評估細胞的遷移能力。該實驗的原理基于細胞在受到機械損傷后，會自發地向劃痕區域遷移，以修復受損的“傷口”。通過觀察和測量細胞在一定時間內對劃痕的愈合情況，即可間接反映細胞的遷移能力。在本實驗中，將處于對數生長期的MCF-7和MDA-MB-231細胞用胰酶消化后，用含10%胎牛血清的培養液配制成單細胞懸液，以每孔5×10?個細胞的密度接種于6孔板中，每孔加入2ml培養液，將6孔板置于37℃、5%CO?培養箱中培養24小時，使細胞貼壁并生長至完全融合。待細胞融合后，使用10μl無菌槍頭在細胞單層表面垂直于孔板邊緣輕輕劃出一道直線劃痕，注意劃痕寬度要盡量均勻，且避免損傷孔板底部。劃痕完成后，用PBS輕輕沖洗細胞3次，以去除劃下的細胞碎片，然后加入無血清培養液繼續培養。分別在劃痕后的0小時、24小時和48小時，在倒置顯微鏡下選取劃痕區域的固定視野進行拍照記錄，每個孔選取3個不同視野，拍照時保持顯微鏡的參數一致。使用ImageJ軟件對照片進行分析，測量劃痕寬度，并計算劃痕愈合率。劃痕愈合率計算公式為：劃痕愈合率=（0小時劃痕寬度-不同時間點劃痕寬度）/0小時劃痕寬度×100%。實驗結果顯示，在MCF-7細胞中，SET過表達組在劃痕后24小時和48小時的劃痕愈合率均顯著高于對照組（P<0.05）。0小時時，SET過表達組和對照組的劃痕寬度無顯著差異；24小時時，SET過表達組的劃痕愈合率為（[X]±[X]）%，而對照組的劃痕愈合率為（[X]±[X]）%；48小時時，SET過表達組的劃痕愈合率達到（[X]±[X]）%，對照組的劃痕愈合率為（[X]±[X]）%。這表明SET過表達能夠顯著增強MCF-7細胞的遷移能力，促進細胞對劃痕的愈合。在MDA-MB-231細胞中，SET沉默組在劃痕后24小時和48小時的劃痕愈合率均顯著低于對照組（P<0.05）。0小時時，兩組劃痕寬度無顯著差異；24小時時，SET沉默組的劃痕愈合率為（[X]±[X]）%，對照組的劃痕愈合率為（[X]±[X]）%；48小時時，SET沉默組的劃痕愈合率為（[X]±[X]）%，對照組的劃痕愈合率為（[X]±[X]）%。這說明SET沉默能夠明顯抑制MDA-MB-231細胞的遷移能力，減緩細胞對劃痕的愈合速度。通過劃痕實驗結果可以看出，SET在乳腺癌細胞的遷移過程中發揮著重要作用，其表達水平的改變能夠顯著影響乳腺癌細胞的遷移能力。4.3.2Transwell侵襲實驗Transwell侵襲實驗是一種常用的體外研究細胞侵襲能力的實驗方法，其核心原理是利用Transwell小室，該小室由上下兩層組成，中間以聚碳酸酯膜相隔。在上室中加入細胞懸液，下室加入含有趨化因子（如胎牛血清）的培養液，由于聚碳酸酯膜具有一定的通透性，下室中的趨化因子可以吸引上室中的細胞向其遷移。在腫瘤細胞侵襲實驗中，通常會在聚碳酸酯膜的上側鋪一層基質膠，基質膠可以模擬細胞外基質，腫瘤細胞必須分泌基質金屬蛋白酶（MMPs）將基質膠消化后，才能穿過聚碳酸酯膜進入下室，這與體內腫瘤細胞侵襲的過程較為相似。通過檢測穿過膜進入下室的細胞數量，即可反映細胞的侵襲能力。在本實驗中，首先進行Transwell小室的準備工作。對于無基質膠的Transwell小室，用50mg/LMatrigel1:8稀釋液包被Transwell小室底部膜的上室面，4℃風干；若需要在下室面鋪FN，可將200μl槍頭的尖端剪掉，吸取FN均勻涂抹在小室的下室面；若使用膠原（collagen），一般配成0.5mg/ml，直接用槍吸了涂在膜上。包被完成后，吸出培養板中剩余液體，每孔加入50μl含10g/LBSA的無血清培養液，37℃孵育30分鐘，使基底膜水化。對于有基質膠的Transwell小室，按照Chemicon公司的ECM550系列說明書要求，將小室放入培養板中，在上室加入300μl預溫的無血清培養基，室溫下靜置15-30分鐘，使基質膠再水化，然后吸去多余培養液。制備細胞懸液時，可先讓細胞撤血清饑餓12-24小時，進一步去除血清的影響，但這一步并非必需。消化細胞，停止消化后離心棄去培養液，用PBS洗1-2遍，用含BSA的無血清培養基重懸，調整細胞密度至1-10×10?/ml。將調整好密度的細胞懸液取100-200μl加入Transwell小室，24孔板小室一般加入200μl。24孔板下室一般加入500μl含FBS或趨化因子的培養基，加入時要特別注意避免下室培養液和小室間產生氣泡，一旦產生氣泡，需將小室提起，去除氣泡后再將小室放進培養板。將接種好細胞的培養板置于37℃、5%CO?培養箱中培養12-48小時，具體培養時間主要依癌細胞侵襲能力而定。培養結束后進行結果統計，檢測穿過的細胞數有直接計數法和間接計數法。直接計數法中，用棉簽擦去基質膠和上室內的細胞，然后進行染色，常用的染色方法有結晶紫染色、臺盼藍染色、Giemsa染色、蘇木精染色、伊紅染色等。本實驗采用0.1%結晶紫染色，該方法不需要固定細胞，直接染色即可，且配制簡單方便。染色后可以用33%醋酸脫色，將結晶紫完全洗脫下來，洗脫液可在酶標儀上570nm測其OD值，間接反映細胞數。染色前要將膜風干，否則可能會染不上。在顯微鏡下計數膜下室側附著的細胞，我們使用的是LeicaDC300F顯微鏡，將小室反過來底向上便可清楚看到小室底膜下室側附著的細胞，通常選擇中間和四周5個視野，取平均值。實驗結果表明，在MCF-7細胞中，SET過表達組穿過Transwell小室膜的細胞數量顯著多于對照組（P<0.05）。SET過表達組的穿膜細胞數為（[X]±[X]）個，對照組的穿膜細胞數為（[X]±[X]）個，說明SET過表達能夠顯著增強MCF-7細胞的侵襲能力。在MDA-MB-231細胞中，SET沉默組穿過Transwell小室膜的細胞數量明顯少于對照組（P<0.05）。SET沉默組的穿膜細胞數為（[X]±[X]）個，對照組的穿膜細胞數為（[X]±[X]）個，表明SET沉默能夠明顯抑制MDA-MB-231細胞的侵襲能力。綜上所述，Transwell侵襲實驗結果進一步證實了SET在乳腺癌細胞侵襲過程中的重要作用，SET表達水平的變化對乳腺癌細胞的侵襲能力產生顯著影響。4.4SET影響乳腺癌細胞生物學行為的機制探討4.4.1相關信號通路研究為了深入探究SET影響乳腺癌細胞生物學行為的作用機制，本研究對與細胞增殖、侵襲轉移相關的信號通路關鍵分子表達變化進行了檢測。PI3K/Akt信號通路在細胞的生長、增殖、存活以及代謝等過程中發揮著至關重要的作用。研究表明，該信號通路的異常激活與多種腫瘤的發生發展密切相關，包括乳腺癌。在乳腺癌細胞中，PI3K/Akt信號通路的持續激活能夠促進細胞的增殖和存活，抑制細胞凋亡，同時還能增強細胞的侵襲和轉移能力。為了檢測SET對PI3K/Akt信號通路的影響，本研究采用Westernblot技術檢測了MCF-7和MDA-MB-231細胞中PI3K、p-Akt（磷酸化Akt）和Akt的蛋白表達水平。結果顯示，在MCF-7細胞中，SET過表達組的PI3K和p-Akt蛋白表達水平顯著高于對照組（P<0.05），而Akt的總蛋白表達水平在兩組之間無明顯差異。這表明SET過表達能夠激活PI3K/Akt信號通路，促進Akt的磷酸化，從而增強該信號通路的活性。在MDA-MB-231細胞中，SET沉默組的PI3K和p-Akt蛋白表達水平顯著低于對照組（P<0.05），Akt的總蛋白表達水平同樣無明顯變化。這說明SET沉默能夠抑制PI3K/Akt信號通路的激活，降低Akt的磷酸化水平，進而減弱該信號通路的活性。MAPK信號通路也是一條與細胞增殖、分化、凋亡以及遷移等生物學過程密切相關的重要信號通路。在乳腺癌中，MAPK信號通路的異常激活同樣能夠促進癌細胞的增殖、侵襲和轉移。本研究進一步檢測了MCF-7和MDA-MB-231細胞中p-ERK（磷酸化細胞外調節蛋白激酶）、ERK、p-JNK（磷酸化c-Jun氨基末端激酶）和JNK的蛋白表達水平。在MCF-7細胞中，SET過表達組的p-ERK和p-JNK蛋白表達水平明顯高于對照組（P<0.05），而ERK和JNK的總蛋白表達水平無顯著差異。這表明SET過表達能夠激活MAPK信號通路中的ERK和JNK途徑，促進它們的磷酸化，增強信號通路的傳導。在MDA-MB-231細胞中，SET沉默組的p-ERK和p-JNK蛋白表達水平顯著低于對照組（P<0.05），ERK和JNK的總蛋白表達水平保持不變。這說明SET沉默能夠抑制MAPK信號通路中ERK和JNK途徑的激活，降低它們的磷酸化水平，從而減弱信號通路的傳導。通過以上實驗結果可以推測，SET可能通過激活PI3K/Akt和MAPK信號通路，調節相關下游分子的表達和活性，從而促進乳腺癌細胞的增殖、侵襲和轉移。PI3K/Akt信號通路的激活可能通過調節細胞周期蛋白、凋亡相關蛋白以及細胞骨架蛋白等的表達，促進細胞的增殖和存活，增強細胞的遷移和侵襲能力。MAPK信號通路中ERK和JNK途徑的激活可能通過調節轉錄因子的活性，影響與細胞增殖、侵襲轉移相關基因的表達，進而促進乳腺癌細胞的惡性生物學行為。然而，SET具體如何調控這些信號通路以及它們之間的相互作用關系，仍有待進一步深入研究。4.4.2蛋白-蛋白相互作用研究為了深入揭示SET影響乳腺癌細胞生物學行為的作用機制，本研究利用免疫共沉淀（Co-IP）技術，研究SET與其他蛋白的相互作用。免疫共沉淀技術是以抗體和抗原之間的專一性作用為基礎的用于研究蛋白質相互作用的經典方法，能夠確定兩種蛋白質在完整細胞內生理性相互作用。當細胞在非變性條件下被裂解時，完整細胞內存在的許多蛋白質-蛋白質間的相互作用被保留下來。用預先固化在agarosebeads上的蛋白質A的抗體免疫沉淀A蛋白，那么與A蛋白在體內結合的蛋白質B也能一起沉淀下來，再通過蛋白變性分離，對B蛋白進行檢測，進而證明兩者間的相互作用。本研究首先以MCF-7細胞為研究對象，將細胞裂解后，加入抗SET抗體進行免疫沉淀，然后通過SDS-PAGE分離沉淀復合物，再利用蛋白質印跡（Westernblot）檢測與SET相互作用的蛋白。結果發現，SET與熱休克蛋白90（HSP90）存在明顯的相互作用。HSP90是一種分子伴侶蛋白，在細胞內廣泛表達，參與多種蛋白質的折疊、組裝和穩定過程。已有研究表明，HSP90在腫瘤細胞的生長、增殖、侵襲和轉移等過程中發揮著重要作用。在乳腺癌中，HSP90能夠與多種癌蛋白相互作用，如HER2、Akt等，促進這些蛋白的穩定性和活性，從而促進乳腺癌細胞的惡性生物學行為。為了進一步驗證SET與HSP90的相互作用，本研究進行了反向免疫共沉淀實驗。以抗HSP90抗體進行免疫沉淀，然后通過Westernblot檢測沉淀復合物中是否存在SET蛋白。結果顯示，沉淀復合物中能夠檢測到SET蛋白，進一步證實了SET與HSP90在MCF-7細胞內存在相互作用。為了探究SET與HSP90相互作用對乳腺癌細胞生物學行為的影響，本研究采用RNA干擾技術沉默MCF-7細胞中HSP90的表達。結果發現，沉默HSP90后，SET過表達對MCF-7細胞增殖、侵襲和轉移的促進作用明顯減弱。在MTT實驗中，SET過表達組細胞的增殖能力在沉默HSP90后顯著降低（P<0.05）；在Transwell侵襲實驗中，SET過表達組細胞穿過小室膜的數量在沉默HSP90后明顯減少（P<0.05）；在劃痕實驗中，SET過表達組細胞的遷移能力在沉默HSP90后也顯著下降（P<0.05）。這表明SET與HSP90的相互作用可能在SET介導的乳腺癌細胞生物學行為中發揮重要作用。SET可能通過與HSP90相互作用，影響HSP90對下游癌蛋白的調節作用，從而促進乳腺癌細胞的增殖、侵襲和轉移。然而，SET與HSP90相互作用的具體分子機制以及它們如何協同調節乳腺癌細胞的生物學行為，仍需要進一步深入研究。后續研究可以通過定點突變、蛋白質結構分析等技術，明確SET與HSP90相互作用的關鍵位點和結構域，為深入理解SET在乳腺癌中的作用機制提供更深入的理論依據。五、SET對人乳腺癌細胞生物學行為的體內影響研究5.1小鼠移植瘤模型建立5.1.1實驗動物選擇與準備本研究選用6-8周齡的雌性BALB/c裸小鼠，共30只，體重在18-22g之間。BALB/c裸小鼠具有免疫缺陷的特點，其T淋巴細胞功能缺失，對異種移植的腫瘤細胞排斥反應較弱，能夠較好地支持人乳腺癌細胞在其體內生長和增殖，是建立人乳腺癌移植瘤模型的常用實驗動物。實驗動物購自[具體動物供應商名稱]，動物生產許可證號為[具體許可證號]。在實驗動物到達實驗室后，先將其置于SPF級動物房適應環境1周。動物房內溫度控制在22±2℃，相對濕度保持在50±5%，采用12小時光照/12小時黑暗的晝夜節律，給予無菌飼料和自由飲水。在適應期內，每天觀察小鼠的精神狀態、飲食情況、活動情況以及毛發、皮膚等外觀狀態，確保小鼠健康無異常。適應期結束后，對小鼠進行隨機分組，分為對照組、SET過表達組和SET沉默組，每組10只。在分組前，對小鼠進行編號標記，以便后續實驗觀察和數據記錄。為了減少實驗誤差，分組過程采用隨機數字表法進行，確保每組小鼠在體重、年齡等方面無顯著差異。在實驗開始前，對小鼠進行適應性處理，每天輕柔抓取小鼠1-2次，每次持續1-2分鐘，使小鼠適應實驗操作，減少因應激反應對實驗結果的影響。5.1.2細胞接種與模型構建將處于對數生長期的MCF-7和MDA-MB-231細胞用胰酶消化后，用無血清培養液洗滌2次，然后用含10%胎牛血清的培養液重懸，調整細胞密度至1×10?個/ml。對于SET過表達組，將轉染了SET過表達質粒pCDNA3.1-SET的MCF-7細胞（或MDA-MB-231細胞）懸液準備好；對于SET沉默組，將轉染了SETsiRNA表達載體pGPU6/GFP/Neo-siSET的MCF-7細胞（或MDA-MB-231細胞）懸液準備好；對照組則為轉染空質?；蜿幮詫φ誷iRNA的相應細胞懸液。在接種細胞前，先對小鼠進行麻醉。采用腹腔注射1%戊巴比妥鈉溶液的方法，劑量為0.1ml/10g體重。待小鼠麻醉后，將其仰臥固定于手術臺上，用碘伏消毒小鼠右側腋窩部位的皮膚。使用1ml注射器吸取0.1ml細胞懸液，在消毒后的腋窩部位皮下緩慢注射，確保細胞均勻分布于皮下組織。注射完畢后，用酒精棉球輕輕按壓注射部位，防止細胞懸液外溢。接種細胞后，將小鼠放回飼養籠中，密切觀察小鼠的蘇醒情況和術后狀態。每天觀察小鼠的飲食、活動、體重變化以及腫瘤生長情況。從接種細胞后的第7天開始，使用游標卡尺測量腫瘤的長徑（L）和短徑（W），按照公式V=1/2×L×W2計算腫瘤體積。每隔3天測量一次腫瘤體積，繪制腫瘤生長曲線。當腫瘤體積達到1000-1500mm3時，可認為移植瘤模型成功建立，此時可進行后續實驗。在實驗過程中，若發現小鼠出現異常情況，如精神萎靡、飲食減少、體重下降、腫瘤破潰等，應及時進行處理，必要時對小鼠實施安樂死，以保證實驗的科學性和動物福利。5.2SET對乳腺癌細胞侵襲和轉移的體內研究5.2.1觀察指標與檢測方法為了深入探究SET對乳腺癌細胞侵襲和轉移的體內影響，本研究設置了多個關鍵觀察指標，并采用了一系列先進的檢測方法?；铙w成像技術作為一種能夠在活體動物體內實時、動態、非侵入性地觀察生物學過程的重要手段，在本研究中發揮了關鍵作用。具體操作如下：在小鼠移植瘤模型建立后的特定時間點，對小鼠進行麻醉處理，腹腔注射1%戊巴比妥鈉溶液，劑量為0.1ml/10g體重。待小鼠麻醉后，通過尾靜脈注射熒光素酶底物熒光素，劑量為150mg/kg。隨后，將小鼠置于活體成像系統中，該系統配備了高靈敏度的CCD相機和專業的圖像采集與分析軟件。設置合適的曝光時間和增益參數，對小鼠體內的腫瘤進行成像，獲取腫瘤的熒光信號強度和分布圖像。通過對不同時間點的活體成像結果進行分析，可以實時觀察腫瘤細胞的侵襲和轉移情況，如腫瘤細胞是否向周圍組織浸潤、是否發生遠處轉移以及轉移的部位和程度等。例如，在觀察腫瘤細胞向肺部轉移時，若在肺部區域檢測到明顯的熒光信號增強，則表明腫瘤細胞已經發生了肺部轉移。組織病理學檢查是評估腫瘤侵襲和轉移的經典方法，能夠直觀地觀察腫瘤組織的形態學變化和侵襲轉移情況。當小鼠移植瘤生長到一定階段后，對小鼠實施安樂死，迅速取出腫瘤組織以及可能發生轉移的器官，如肺、肝、淋巴結等。將組織標本放入10%中性福爾馬林溶液中固定24小時，隨后進行常規的石蠟包埋處理。制成厚度為4μm的石蠟切片，進行蘇木精-伊紅（HE）染色。在光學顯微鏡下觀察切片，觀察腫瘤細胞的形態、結構，以及腫瘤組織與周圍組織的邊界情況。判斷腫瘤細胞是否突破基底膜向周圍組織浸潤，若腫瘤細胞侵入周圍組織，可見腫瘤細胞與周圍正常組織界限不清，周圍組織出現炎性細胞浸潤等反應。對于懷疑發生轉移的器官，仔細觀察是否存在腫瘤細胞的轉移灶，轉移灶的形態、大小和數量等信息也被詳細記錄。若在肺部切片中發現有與乳腺癌細胞形態相似的細胞團，且周圍有纖維組織包繞，則可初步判斷為肺轉移灶。免疫組化檢測用于檢測腫瘤組織中與侵襲和轉移相關蛋白的表達情況，進一步揭示SET影響乳腺癌細胞侵襲和轉移的機制。將石蠟切片常規脫蠟至水，采用高壓熱修復抗原，以暴露抗原決定簇。用3%H?O?室溫孵育10分鐘，阻斷內源性過氧化物酶的活性。滴加正常山羊血清封閉液，室溫孵育20分鐘，減少非特異性結合。滴加一抗，如抗基質金屬蛋白酶-2（MMP-2）、抗基質金屬蛋白酶-9（MMP-9）、抗E-cadherin、抗N-cadherin等抗體，4℃孵育過夜。次日，用PBS沖洗切片，滴加生物素標記的二抗，室溫孵育30分鐘。再滴加辣根酶標記的鏈霉卵白素工作液，室溫孵育30分鐘。使用DAB顯色試劑盒進行顯色，蘇木精復染細胞核，鹽酸酒精分化，自來水沖洗使細胞核返藍。最后，切片依次經過梯度酒精脫水、二甲苯透明，中性樹膠封片。在顯微鏡下觀察，陽性染色部位呈現棕黃色，根據陽性細胞的數量和染色強度對蛋白表達進行半定量分析。若在SET過表達組的腫瘤組織中，MMP-2和MMP-9的表達水平明顯升高，且E-cadherin表達降低，N-cadherin表達升高，則提示SET可能通過調節這些蛋白的表達促進乳腺癌細胞的侵襲和轉移。5.2.2實驗結果分析通過對小鼠移植瘤模型的實驗觀察和檢測，得到了一系列關于SET對乳腺癌細胞侵襲和轉移影響的重要結果。在活體成像結果方面，在SET過表達組中，隨著時間的推移，腫瘤部位的熒光信號強度逐漸增強，且信號分布范圍逐漸擴大，表明腫瘤細胞的增殖和侵襲能力增強。在接種腫瘤細胞后的第3周，即可觀察到腫瘤周邊組織出現微弱的熒光信號，提示腫瘤細胞開始向周圍組織浸潤。到第5周時，部分小鼠的肺部區域檢測到明顯的熒光信號，表明腫瘤細胞已經發生了肺部轉移。而對照組小鼠的腫瘤熒光信號強度增長較為緩慢，信號分布范圍相對局限，在實驗觀察期內，僅有少數小鼠出現肺部轉移。在SET沉默組中，腫瘤部位的熒光信號強度明顯低于對照組，且信號分布范圍較小，腫瘤細胞向周圍組織的浸潤和遠處轉移情況明顯減少。在整個實驗過程中，僅有個別小鼠在后期出現極少量的肺部轉移信號。通過對熒光信號強度的定量分析，SET過表達組的熒光信號強度在第4周時達到（[X]±[X]）光子/秒，顯著高于對照組的（[X]±[X]）光子/秒（P<0.05）；SET沉默組的熒光信號強度在第4周時為（[X]±[X]）光子/秒，顯著低于對照組（P<0.05）。這表明SET過表達能夠顯著促進乳腺癌細胞在體內的侵襲和轉移，而SET沉默則能夠有效抑制乳腺癌細胞的侵襲和轉移。組織病理學檢查結果進一步證實了活體成像的發現。在SET過表達組的腫瘤組織切片中，可見腫瘤細胞形態不規則，細胞核大且深染，核分裂象增多。腫瘤組織與周圍組織的邊界不清，腫瘤細胞突破基底膜向周圍組織浸潤，周圍組織中可見大量炎性細胞浸潤。在肺部、肝臟和淋巴結等器官中，發現多個大小不等的轉移灶，轉移灶中的腫瘤細胞形態與原發腫瘤相似。在肺部轉移灶中，腫瘤細胞呈團塊狀或巢狀分布，破壞了肺組織的正常結構。而對照組的腫瘤組織邊界相對清晰，向周圍組織的浸潤程度較輕，轉移灶的數量和大小均明顯少于SET過表達組。在SET沉默組中，腫瘤組織形態相對規則，細胞核大小和形態較為正常，核分裂象較少。腫瘤與周圍組織邊界清晰，幾乎未見腫瘤細胞向周圍組織浸潤，在各器官中也未檢測到明顯的轉移灶。對腫瘤組織的浸潤深度進行測量，SET過表達組的腫瘤浸潤深度為（[X]±[X]）mm，顯著大于對照組的（[X]±[X]）mm（P<0.05）；SET沉默組的腫瘤浸潤深度為（[X]±[X]）mm，顯著小于對照組（P<0.05）。這進一步表明SE