第7章鐮刀貧血病-精品課程Chapter6蛋白質的結構與功能的關系第7章鐮刀貧血病-精品課程蛋白質的分子的生物學功能是與其化學組成和極其復雜的結構密切相關的。同時，蛋白質功能總是跟蛋白質與其他分子相互作用相聯系。相互作用中蛋白質構象有時發生微小變化，有時發生劇烈變化。因此蛋白質的構象不是剛性的、靜止的，而是柔性的、動態的。本章主要介紹蛋白質的一級結構與功能的關系——一個分子病發現的故事。第7章鐮刀貧血病-精品課程一、蛋白質的一級結構與功能的關系遺傳病—鐮刀貧血病的發現(Geneticdisease-Sickle-cellanemia)

事情發生在1904年，美國東部NewYork,NewYorkcity,當時有一位黑人大學生Smark(18歲），找一位醫生（Ingram)看病，自覺頭昏、發燒、呼吸困難。醫生對Smark進行了檢查，發現病人眼睛有黃疸，心跳有雜音，沒有發現寄生蟲，只發現Redbloodcell350萬/mm3，Bloodplatelet25萬/mm3,Whitebloodcell5000/mm3.根據正常人的數值（RBC500萬/mm3，WBC6000/mm3，

BP15.6萬/mm3）診斷病人為貧血癥。第7章鐮刀貧血病-精品課程后來Ingram醫生又對病人取血，鏡檢，發現病人的紅血球的是半月型的（形狀象鐮刀）。第7章鐮刀貧血病-精品課程第7章鐮刀貧血病-精品課程

以后這位醫生對這位黑人大學生進行了精心治療，也就是加強營養和一般治療。結果，病人有所好轉，但是，醫生發現病人的紅血球還是鐮刀狀的。于是醫生建議該生休學。

Ingram對這位黑人大學生進行了6年的跟蹤觀察。當時醫生判斷，這個病很可能是一個geneticdisease。后來在美國黑人主要集中的NewYork,Chicago,LosAngeles,Philadelphia,DetroitandWashington發現了很多這樣的病例，發病率占4/1000，都是由于得此病以至30歲以前，就由于此病引起血栓、腎功能減退、心肌梗塞，特別是毛細血管阻塞引起死亡。病人的紅血球很容易溶血和破裂，且紅血球壽命比正常的要短，結果造成嚴重貧血和庰發許多種嚴重疾病。后來診斷此病是先天性的或遺傳性的，而且在一定條件下甚至是一種絕癥。第7章鐮刀貧血病-精品課程久而久之，醫生又發現血紅蛋白有缺陷，就是去氧血紅蛋白溶解度降低，比正常低1/25。由于溶解度的降低，造成了血紅蛋白運氧機能大大降低。后來，對不正常血紅蛋白進行了研究。血紅蛋白是由4條肽鏈以亞基連接起來（2條

-鏈，2條

-鏈），大家知道去氧血紅蛋白對于新陳代謝起著重要作用。它既可以載氧，又可以運走CO2。這位醫生把病人的血紅蛋白提取出來，用正常人的血紅蛋白和病人的血紅蛋白進行電泳比較。結果發現有病的與正常的斜率曲線是平行的，也就是說，在電泳時鐮刀狀的比正常的要快。第7章鐮刀貧血病-精品課程+pH病例電泳的泳動速度：

V=V—速度

E—電場強度Z—帶電顆粒所帶電荷f—帶電顆粒的大小EZf快的原因有幾種可能性：可能是Z，也可能是f。第7章鐮刀貧血病-精品課程后來經過研究推斷，泳動速度的加快是由于Z（帶電荷）的不同。

HbAHbS差異PIO2-Hb6.877.090.22

去氧Hb

6.686.910.23異常的去氧Hb比正常的Hb的PI高0.23個pH單位。第7章鐮刀貧血病-精品課程在上述基礎上，進一步的研究表明，病例的多了幾個電荷。采用滴定法，也就是根據耗堿量知道氨基的數目，耗酸量了解羧基的數目的原理（NH3+可看作可滴定酸，—COO-看作可滴定堿）。結果，改變一個PH就有13個電荷數目變化。設異常帶電荷為 X1:13=0.23:XX=130.23=2.993這樣就決定了異常的比正常的Hb多了3個電荷。

~

第7章鐮刀貧血病-精品課程當時認為電荷的增多可能是血紅蛋白中鐵卜啉所引起的，把鐵卜啉環提取出來，結晶，用X-射線衍射，結果沒有什么差異。第7章鐮刀貧血病-精品課程第7章鐮刀貧血病-精品課程第7章鐮刀貧血病-精品課程第7章鐮刀貧血病-精品課程第7章鐮刀貧血病-精品課程當時認為電荷的增多可能是血紅蛋白中鐵卜啉所引起的，把鐵卜啉環提取出來，結晶，用X-射線衍射，結果沒有什么差異。后來把目標轉向了肽鏈分析。在肽鏈上有三種可能電荷增多：正常異常

中

+

-+-中第7章鐮刀貧血病-精品課程

當然，要知道那一種可能，就必須進行研究——試驗。把血紅蛋白的一級結構進行分析。首先用胰蛋白酶水解HB，得到28個肽段，采用紙上層析分離與電泳相結合的方法對這些肽與正常的進行比較。得到了Finger-prints.根據該圖的比較，27個肽一樣，只有一個肽段是不同的。把這個異常的肽段剪下來，進行測序。結果是?鏈上的一個8肽。Hba:H2N-Val-His-Leu-Thr-Pro-Glu-Glu-Lys-COOHHbs:H2N-Val-His-Leu-Thr-Pro-Val-Glu-Lys-COOH第7章鐮刀貧血病-精品課程在正常血紅蛋白分子的鏈中，從N-端開始的第6個氨基酸殘基是GLU，而鐮刀壯貧血患者的血紅蛋白分子的鏈中的第6個氨基酸殘基則被VAL所代替，這樣就明了了產生電荷增多的原因，是第三種可能性，就是說，原來一個帶負電荷的8肽變成了一個中性的8肽

H3N+COO-COO-H3N+COO-第7章鐮刀貧血病-精品課程由此可見，由于HB有4條肽鏈，而這8肽是在-鏈上，一個-鏈多了一個正電荷，而兩條-鏈就多了2個正電荷。多了2個電荷的血紅蛋白發生了結構改變，異常的HBS與HBS聚集起來，有時HBS與HBA凝集，形成所謂平行排列的非球形（線形）結構——鐮刀狀結構。第7章鐮刀貧血病-精品課程Mutationandmolecularinteraction’schanges第7章鐮刀貧血病-精品課程第7章鐮刀貧血病-精品課程第7章鐮刀貧血病-精品課程這個有574個氨基酸殘基的HB中，只要兩條-鏈中的2個GLU殘基被VAL殘基所代替就能引起如此嚴重的病理現象，可見蛋白質的結構與功能有著如此密切的聯系。清楚了病因以后，INGRAM醫生再治療就不難了，根據HB的聚集，用脲素可以使這種聚集消失，醫生給患者吃大量的尿素，結果是有效的?；颊吒杏X好多了，頭昏和呼吸困難都有所改善。但是，由于尿素在體內不能保存太久，就被分解了，這位尋求真理，攀登科學高峰的醫生，繼續進行了研究。根據：

第7章鐮刀貧血病-精品課程H2N-CO-NH2——NH4++（N=C=O）-37OC，PH7.4時，有510-3M的氰酸鹽，證明在體內不是脲素起作用，而是脲素平衡后發生的氰酸鹽起作用，后來給患者服氰酸鹽，比吃脲素好得多。R—NH2+H-N=C=OR-NH-CO-NH2

OR—NH2+CO2R-NH-C—O-這樣打斷了HBS的聚合，矯正了它的構象，使分子重新獲得輸氧能力。由于這種疾病是先天性的“分子病”，還不能完全治愈。到目前為止還在研究之中。在人類中已發現300多種不同的異常血紅蛋白，其中中國人30種。

這種疾病只有有賴于基因工程的方法才能徹底根治。第7章鐮刀貧血病-精品課程一氧化碳:神秘的殺手CarbonMonoxide:AStealthyKillerLakePowell萊克.鮑威爾，Arizona亞利桑那州,August2000.Afamilywasvacationing度假

inarented租用

houseboat游艇.Theyturnedontheelectricalgenerator發電機

topoweranairconditionerandatelevision.About15minuteslater,twobrothers,aged8and11,jumpedofftheswimdeckatthestern船尾.Situatedimmediatelybelowthedeckwastheexhaustportforthegenerator.Withintwominutes,bothboyswereovercome征服

bythecarbonmonoxideintheexhaust排氣口,whichhadbecomeconcentratedinthespaceunderthedeck.Bothdrowned淹死了.Thesedeaths,alongwithaseriesofdeathsinthe1990slinkedtohouseboatsofsimilardesign,eventuallyledtotherecall召回

andredesignofthegeneratorexhaustassembly.Carbonmonoxide(CO),acolorless,odorlessgas,isresponsibleformorethanhalfofyearlydeathsduetopoisoning中毒

worldwide.COhasanapproximately250-foldgreateraffinityforhemoglobin血紅蛋白

thandoesoxygen.Consequently,relativelylowlevelsofCOcanhavesubstantialandtragic悲劇

effects.WhenCOcombineswithhemoglobin,thecomplexisreferredtoascarboxyhemoglobin,orCOHb.第7章鐮刀貧血病-精品課程SomeCOisproducedbynaturalprocesses,butlocallyhighlevelsgenerallyresultonlyfromhumanactivities.Engineandfurnace爐子

exhaustsareimportantsources,asCOisabyproductoftheincompletecombustion不完全燃燒

offossilfuels石油.IntheUnitedStatesalone,nearly4,000peoplesuccumbtoCOpoisoningeachyear,bothaccidentally意外地

andintentionally故意地.ManyoftheaccidentaldeathsinvolveundetectedCObuildup積累

inenclosedspaces,suchaswhenahouseholdfurnacemalfunctions故障

orleaks泄漏,venting排

COintoahome.However,COpoisoningcanalsooccurinopenspaces露天場所,asunsuspectingpeopleatworkorplay休閑

inhale吸入

theexhaustfromgenerators,outboardmotors舷外馬達,tractor拖拉機

engines,recreationalvehicles休閑交通工具,orlawnmowers割草機.Carbonmonoxidelevelsintheatmospherearerarelydangerous,rangingfromlessthan0.05partspermillion(ppm)inremote偏僻的

anduninhabited無人居住

areasto3to4ppminsomecitiesofthenorthernhemisphere北半球.IntheUnitedStates,thegovernment-mandated(Occupational職業

SafetyandHealthAdministration,OSHA)limitforCOatworksites工地

is50ppmforpeopleworkinganeight-hourshift輪班.ThetightbindingofCOtohemoglobinmeansthatCOHbcanaccumulateover第7章鐮刀貧血病-精品課程timeaspeopleareexposedtoaconstantlow-levelsourceofCO.Inanaverage,healthyindividual,1%orlessofthetotalhemoglobiniscomplexedasCOHb.SinceCOisaproductoftobaccosmoke,manysmokershaveCOHblevelsintherangeof3%to8%oftotalhemoglobin,andthelevelscanriseto15%forchain-smokers.COHblevelsequilibrateat50%inpeoplewhobreatheaircontaining570ppmofCOforseveralhours.ReliablemethodshavebeendevelopedthatrelateCOcontentintheatmospheretoCOHblevelsintheblood(Fig.1).IntestsofhouseboatswithageneratorexhaustliketheoneresponsiblefortheLakePowelldeaths,COlevelsreached6,000to30,000ppmundertheswimdeck,andatmosphericO2levelsunderthedeckdeclined下降

from21%to12%.Evenabovetheswimdeck,COlevelsofupto7,200ppmweredetected,highenoughtocausedeathwithinafewminutes.HowisahumanaffectedbyCOHb?Atlevelsoflessthan10%oftotalhemoglobin,symptoms癥狀

arerarelyobserved.At15%,theindividualexperiences體驗

mild輕微

headaches.At20%to30%,theheadacheissevere劇烈的

and第7章鐮刀貧血病-精品課程圖1.血液中COHb與環境中的CO濃度的關系。圖中顯示：在4種不同的條件下，短時間中毒的影響和休息狀態和輕度運動狀態下的比較。第7章鐮刀貧血病-精品課程isgenerallyaccompaniedbynausea嘔心,dizziness頭昏眼花,confusion混亂,disorientation方向知覺的喪失,andsomevisualdisturbances視覺混亂;thesesymptomsaregenerallyreversed恢復

rapidlyiftheindividualistreatedwithoxygen.AtCOHblevelsof30%to50%,theneurologicalsymptoms神經學上的癥狀

becomemoresevere嚴重,andatlevelsnear50%,theindividuallosesconsciousness失去知覺

andcansinkintocoma昏迷.Respiratoryfailure呼吸衰竭mayfollow.Withprolongedexposure,somedamagebecomespermanent永久的.DeathnormallyoccurswhenCOHblevelsriseabove60%.Autopsy尸體解剖

ontheboyswhodiedatLakePowellrevealed顯示

COHblevelsof59%and52%.BindingofCOtohemoglobinisaffectedbymanyfactors,includingexercise(Fig.1)andchangesinairpressurerelatedtoaltitude海拔.BecauseoftheirhigherbaselevelsofCOHb,smokersexposedtoasourceofCOoftendevelopsymptomsfasterthannonsmokers.IndividualswithheartandlungconditionsorblooddiseasesthatreducetheavailabilityofoxygentotissuesmayalsoexperiencesymptomsatlowerlevelsofCOexposure.Fetuses胎兒

areatparticularriskforCOpoisoning,becausefetalhemoglobin胎兒血紅蛋白

hasasomewhat稍微

higheraffinityforCOthanadulthemoglobin.Cases案例

ofCOexposurehavebeenrecordedinwhichthefetusdiedbutthemotherrecovered.第7章鐮刀貧血病-精品課程Itmayseem似乎

surprisingthatthelossofhalfofone’shemoglobintoCOHbcanprovefatal致命的—weknowthatpeoplewithanyofseveralanemic貧血

conditionsmanagetofunctionreasonablywellwithhalftheusualcomplement補充ofactivehemoglobin.However,thebindingofCOtohemoglobindoesmorethanremoveproteinfromthepoolavailabletobindoxygen.Italsoaffects影響

theaffinityoftheremaining剩余

hemoglobinsubunitsforoxygen.AsCObindstooneortwosubunitsofahemoglobintetramer四聚體,theaffinityforO2isincreasedsubstantially充分地

intheremainingsubunits(Fig.2).Thus,ahemoglobintetramerwithtwoboundCOmoleculescanefficientlybindO2inthelungs—butitreleasesverylittleofitinthetissues.Oxygendeprivation剝奪

inthetissuesrapidlybecomessevere嚴重.Toaddtotheproblem,theeffectsofCOarenotlimitedtointerference干涉withhemoglobinfunction.CObindstootherhemeproteins亞鐵血紅素蛋白andavarietyofmetalloproteins金屬蛋白.Theeffectsoftheseinteractions互作arenotyetwellunderstood,buttheymayberesponsibleforsomeofthelonger-termeffectsofacute劇烈的butnonfatal非致命COpoisoning.第7章鐮刀貧血病-精品課程圖2.幾種氧合曲線。正常的血紅蛋白；來自于貧血個體的只有50%血紅蛋白功能，和來自于與CO結合了50%的血紅蛋白。圖示在人的肺和組織中的氧分壓pO2第7章鐮刀貧血病-精品課程WhenCOpoisoningissuspected懷疑,rapidevacuation撤離ofthepersonawayfromtheCOsourceisessential,butthisdoesnotalwaysresultinrapidrecovery.WhenanindividualismovedfromtheCO-pollutedsitetoanormal,outdoor室外atmosphere,O2beginstoreplacetheCOinhemoglobin.TheCOHblevelsdropratherslowly,however;thehalf-time半衰期is2to6.5hours,dependingonindividualandenvironmentalfactors.If100%oxygenisadministeredwithamask面具,therateofexchangecanbeincreasedaboutfourfold四倍;thehalftimeforO2-COexchangecanbereducedtotensofminutesif100%oxygenatapressureof3atm(303kPa)issupplied.Thus,rapidtreatmentbyaproperlyequippedmedicalteamiscritical急需的.Carbonmonoxidedetectors探測器inallhomesarehighlyrecommended強烈推薦.Thisisasimpleandinexpensivemeasuretoavoidpossibletragedy災難.Aftercompletingtheresearchforthisbox,weimmediatelypurchasedseveralnewCOdetectorsforourhomes.第7章鐮刀貧血病-精品課程二、蛋白質空間結構與功能的關系：蛋白質折疊病(proteinfolding)

人們對由于基因突變造成蛋白質分子中僅僅一個氨基酸殘基的變化就引起疾病的情況已有所了解，即所謂“分子病”，如地中海鐮刀狀紅血球貧血癥就是因為血紅蛋白分子中第六位的谷氨酸突變成了頡氨酸?，F在則發現蛋白質分子的氨基酸序列沒有改變，只是其結構或者說構象有所改變也能引起疾病，那就是所謂“構象病”，或稱“折疊病”。您知道“蛋白質折疊病”嗎？瘋牛病、老年性癡呆癥、囊性纖維病變、家族性高膽固醇癥、家族性淀粉樣蛋白癥、某些腫瘤、白內障等等都是“折疊病”。就是相關蛋白質的三維空間結構異常。這種三維空間結構異常是由于致病蛋白質分子通過分子間作用感染正常蛋白質而造成的。請注意，致病蛋白質分子與正常蛋白質分子的構成完全相同，只是空間結構不同。由于蛋白質折疊異常而造成分子聚集甚至沉淀或不能正常轉運到位所引起的

。

第7章鐮刀貧血病-精品課程您知道蛋白質折疊有多復雜嗎？美國“科學美國人”曾經載文稱，用當今最快的計算機模擬計算蛋白質折疊，要花一百年！而當今最快的計算機已經達到每秒幾萬億甚至十幾萬億次浮點運算的高速了。

在正常機體中，Prion(原蛋白)是正常神經活動所需要的蛋白質，造成瘋牛病的Prion病蛋白可以感染正常蛋白而在蛋白質之間傳染,從而認為蛋白結構的變化來自于序列的變化，而序列的變化來自于基因的變化，生命信息從核酸傳遞到蛋白。而致病Prion的信息已被諾貝爾獎獲得者普魯辛納證明不是來自基因的變化，致病蛋白Prion導致正常蛋白Prion轉變為致病的折疊狀態是通過蛋白分子間的作用而感染！這種相互作用的本質和機制是什么？僅僅改變了折疊狀態的分子又如何導致嚴重的疾病？這些問題都不能用傳統的概念給予滿意的解釋，因此在科學界引起激烈的爭論，有關研究的強度和競爭性也隨之大大增強。由于分子伴侶在蛋白質折疊中至關重要的作用，分子伴侶本身的突變顯然會引起蛋白質折疊異常而引起折疊病。隨著蛋白質折疊研究的深入，人們會發現更多疾病的真正病因和更針對性的治療方法，設計更有效的藥物?，F在發現有第7章鐮刀貧血病-精品課程些小分子可以穿越細胞作為配體與突變蛋白結合，從而使原已失去作戰能力的突變蛋白逃逸“蛋白質質量控制系統”而“帶傷作戰”。這種小分子被稱為“藥物分子伴侶”，有希望成為治療“折疊病”的新藥。新生肽的折疊問題或蛋白質折疊問題不僅具有重大的科學意義，除了上面提到的在醫學上的應用價值外，在生物工程上具有極大的應用價值?；蚬こ毯偷鞍坠こ桃呀浿饾u發展成為產值以數十億美元計的大產業，進入21世紀后，還將會有更大的發展。但是當前經常遇到的困難，是在簡單的微生物細胞內引入異體DNA后所合成的多肽鏈往往不能正確折疊成為有生物活性的蛋白質而形成不溶解的包含體或被降解。這一“瓶頸”問題的徹底解決有待于對新生肽鏈折疊更多的認識。蛋白質的折疊是否有“第二遺傳密碼”？

第7章鐮刀貧血病-精品課程

DeathbyMisfolding:ThePrionDiseases(蛋白質折疊之死:瘋牛病)Amisfoldedproteinappearstobethecausativeagentofanumberofraredegenerativebraindiseasesinmammals.Perhapsthebestknownoftheseismadcowdisease瘋牛病

(bovinespongiformencephalopathy,牛綿狀腦病BSE),anoutbreak爆發

ofwhichmadeinternationalheadlinesinthespringof1996.Relateddiseasesincludekuru

苦魯病,新幾內亞震顫病andCreutzfeldt-Jakobdisease痙攣性假硬化,克雅病

inhumans,scrapie綿羊瘋癢病

insheep,andchronicwastingdisease慢性消耗性疾病

indeerandelk麋鹿.Thesediseasesarealsoreferredtoasspongiformencephalopathies海綿狀腦病,becausethediseasedbrainfrequentlybecomesriddled迷惑

withholes(Fig.1).Typicalsymptomsincludedementia癡呆andlossofcoordination失去協調.Thediseasesarefatal致命的.Inthe1960s,investigatorsfoundthatpreparationsofthedisease-causingagentsappearedtolacknucleicacids.Atthistime,TikvahAlpersuggestedthattheagentwasaprotein.Initially,theideaseemedheretical異端邪說.Alldisease-causingagentsknownuptothattime—viruses,bacteria,fungi,andsoon—containednucleicacids,andtheirvirulencewasrelatedtogeneticreproduction復制

andpropagation繁殖.However,fourdecades四十第7章鐮刀貧血病-精品課程年

ofinvestigations,pursuedmostnotablybyStanleyPrusiner,haveprovidedevidencethatspongiformencephalopathiesaredifferent.第7章鐮刀貧血病-精品課程

Theinfectiousagenthasbeentracedtoasingleprotein(Mr28,000),whichPrusinerdubbedprion(fromproteinaceousinfectiousonly)protein(PrP).Prionproteinisanormalconstituentofbraintissueinallmammals.Itsroleinthemammalianbrainisnotknownindetail,butitappearstohaveamolecularsignalingfunction.StrainsofmicelackingthegeneforPrP(andthustheproteinitself)suffernoobviousilleffects.IllnessoccursonlywhenthenormalcellularPrP,orPrPC,occursinanalteredconformationcalledPrPSc(Scdenotesscrapie).TheinteractionofPrPScwithPrPCconvertsthelattertoPrPSc,initiatingadominoeffect多米諾效應

inwhichmoreandmoreofthebrainproteinconvertstothedisease-causingform.ThemechanismbywhichthepresenceofPrPScleadstospongiformencephalopathyisnotunderstood.Ininheritedformsofpriondiseases,amutationinthegeneencodingPrPproducesachangeinoneaminoacidresiduethatisbelievedtomaketheconversionofPrPCtoPrPScmorelikely.Acompleteunderstandingofpriondiseasesawaitsnewinformationabouthowprion