微專題PCR技術(shù)的延申1.RT-PCR技術(shù)(1)過(guò)程：逆轉(zhuǎn)錄PCR(RT-PCR)一般分為兩步，先以mRNA為模板,在逆轉(zhuǎn)錄酶的催化下合成cDNA的第1條鏈，再以第1條鏈為模板做常規(guī)PCR，從而獲得雙鏈cDNA分子。(2)應(yīng)用：逆轉(zhuǎn)錄PCR可從mRNA出發(fā)獲取目的基因，也可以研究基因的表達(dá)情況，實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR還可用于病毒定量檢測(cè)。熒光探針?lè)?是臨床檢測(cè)中最常用的檢測(cè)方法。PCR擴(kuò)增時(shí)，加入一對(duì)引物的同時(shí)再加入一個(gè)特異性的熒光探針。該探針是一個(gè)寡核苷酸，5′端標(biāo)記一個(gè)熒光報(bào)告基團(tuán)(Reporter，R)，3′端標(biāo)記一個(gè)淬滅基團(tuán)(Quencher，Q)。當(dāng)探針完整時(shí)，報(bào)告基團(tuán)發(fā)射的熒光信號(hào)被淬滅基團(tuán)吸收，以至于無(wú)法檢測(cè)到熒光信號(hào)；而當(dāng)PCR擴(kuò)增時(shí)(在延伸階段)，探針會(huì)被Taq酶的5′→3′外切酶活性酶切降解，使報(bào)告基團(tuán)和淬滅基團(tuán)分離，報(bào)告基團(tuán)發(fā)射底的熒光不會(huì)再被吸收，從而可以在熒光監(jiān)測(cè)系統(tǒng)接收到熒光信號(hào)，即每擴(kuò)增一條DNA，就形成一個(gè)熒光分子，PCR產(chǎn)物越多，熒光信號(hào)累積的越多，熒光強(qiáng)度越大。熒光定量PCR儀能夠監(jiān)測(cè)出熒光到達(dá)預(yù)先設(shè)定閾值的循環(huán)數(shù)(Ct值)與病毒核酸濃度有關(guān)，病毒核酸濃度越高，Ct值越小。Ct>40或無(wú)Ct值判定為陰性。2）帶熒光標(biāo)記的探針，其___端帶有熒光物質(zhì)，在延伸階段，通過(guò)檢測(cè)反應(yīng)體系中的_________，可以達(dá)到檢測(cè)________________的目的。[新冠熱點(diǎn)題型]熒光定量PCR是一種在PCR反應(yīng)體系中加入熒光標(biāo)記的探針，利用熒光信號(hào)的積累，對(duì)整個(gè)PCR進(jìn)程進(jìn)行檢測(cè)，最后對(duì)PCR產(chǎn)物擴(kuò)增量進(jìn)行定量分析技術(shù)。作用原理如下圖所示：1）據(jù)圖分析，TaqDNA聚合酶的作用有：________________（答兩點(diǎn)）催化DNA的合成（子鏈延伸）、分解與模板雜交的熒光探針5'熒光強(qiáng)度PCR產(chǎn)物擴(kuò)增量[新冠熱點(diǎn)題型]熒光定量PCR是一種在PCR反應(yīng)體系中加入熒光標(biāo)記的探針，利用熒光信號(hào)的積累，對(duì)整個(gè)PCR進(jìn)程進(jìn)行檢測(cè)，最后對(duì)PCR產(chǎn)物擴(kuò)增量進(jìn)行定量分析技術(shù)。作用原理如下圖所示：3）若運(yùn)用該技術(shù)檢測(cè)COVID-19（新冠病毒）的核酸，圖中所示模板DNA來(lái)源于_____________________________________________；以COVID-19的RNA為模板逆轉(zhuǎn)錄合成DNA設(shè)計(jì)與新冠病毒（COVID-19）的基因片段堿基互補(bǔ)配對(duì)的序列為精確定位并復(fù)制新冠病毒基因，設(shè)計(jì)引物和熒光標(biāo)記的探針時(shí)應(yīng)該遵循的思路是______________________________________下列有關(guān)敘述正確的是（

）A.每個(gè)模板DNA分子含有2個(gè)游離的磷酸基團(tuán)B.做qPCR之前，需要先根據(jù)目的基因的核苷酸序列合成1種引物和1種Taqman探針C.在反應(yīng)過(guò)程中，需要細(xì)胞中的ATP為新鏈的合成提供能量D.熒光信號(hào)達(dá)到設(shè)定的閾值時(shí)，經(jīng)歷的循環(huán)數(shù)越少，說(shuō)明含有的病變的概率越小A1對(duì)引物dNTP大2.重疊延伸PCR技術(shù)重疊PCR是采用具有互補(bǔ)末端的引物,使PCR產(chǎn)物形成了重疊鏈,從而在隨后的擴(kuò)增反應(yīng)中通過(guò)重疊鏈的延伸,將不同來(lái)源的擴(kuò)增片段重疊拼接起來(lái)的技術(shù),主要應(yīng)用于基因的定點(diǎn)突變與基因拼接,基本過(guò)程如圖所示:(2023·山東泰安模擬預(yù)測(cè))通過(guò)設(shè)計(jì)引物，運(yùn)用PCR技術(shù)可以實(shí)現(xiàn)目的基因的定點(diǎn)誘變。下圖為基因工程中獲取突變基因的過(guò)程，其中引物1序列中含有一個(gè)堿基T不能與目的基因片段配對(duì)，但不影響引物與模板鏈的整體配對(duì)，反應(yīng)體系中引物1和引物2的5′端分別設(shè)計(jì)增加限制酶a和限制酶b的識(shí)別位點(diǎn)。下列有關(guān)敘述正確的是(

)A．在PCR反應(yīng)體系中還需要加入4種游離脫氧核苷酸、解旋酶、Taq酶等B．第3輪PCR結(jié)束后，含突變堿基對(duì)且兩條鏈等長(zhǎng)的DNA占1/2C．引物中設(shè)計(jì)兩種限制酶識(shí)別位點(diǎn)有利于目的基因定向插入載體D．第2輪PCR，引物1能與圖中②結(jié)合并且形成兩條鏈等長(zhǎng)的突變基因C1/4②較長(zhǎng)①該過(guò)程需要______種引物；②PCR1的產(chǎn)物AB是引物___和引物___擴(kuò)增的結(jié)果；③PCR2的產(chǎn)物CD是引物___和引物___擴(kuò)增的結(jié)果；④產(chǎn)物AD的形成需要引物嗎？___________________________________4abcd不需要，但需要耐高溫的DNA聚合酶⑤需要改變的堿基位于引物___和引物___上⑥引物b和引物c之間有什么關(guān)系？____________________________⑦PCR3中突變產(chǎn)物AD的擴(kuò)增需要引物___和引物___bc引物b和引物c應(yīng)有部分堿基互補(bǔ)的關(guān)系ad③進(jìn)行第三次PCR時(shí)（圖中PCR3）________（填“需要”或“不需要”）加入上述引物A～D，引物（理由）是

。不需要PCR1和PCR2的產(chǎn)物退火以后已經(jīng)形成類似引物作用的3^′端，可以在DNA聚合酶的作用下直接延伸2.科學(xué)家將抗人大腸癌單克隆抗體基因(ND-1)與酵母胞嘧啶脫氨酶基因(CD)融合,在大腸桿菌中成功地表達(dá)了單鏈抗體與酶的融合蛋白,這類蛋白的療法稱為由抗體介導(dǎo)的酶解前藥療法(ADEPT)。ND-1—CD融合基因的構(gòu)建方法如圖所示。下列有關(guān)敘述錯(cuò)誤的是(

)A.圖中兩條雜交鏈的獲得至少需要經(jīng)過(guò)1次擴(kuò)增循環(huán)B.圖中雜交鏈延伸成ND-1—CD融合基因的過(guò)程不需要添加引物C.PCR反應(yīng)體系中須加入耐高溫的DNA聚合酶,該酶主要在延伸過(guò)程起作用D.該融合蛋白應(yīng)是利用抗體部分特異性地識(shí)別人大腸癌細(xì)胞并將酶帶到靶部位A23.(2024·濟(jì)寧三模)PCR技術(shù)的實(shí)用性和極強(qiáng)的生命力使其成為生物科學(xué)研究的一種重要方法,極大地推動(dòng)了分子生物學(xué)以及生物技術(shù)產(chǎn)業(yè)的發(fā)展。下面是兩個(gè)具體實(shí)驗(yàn)中的PCR技術(shù)應(yīng)用,請(qǐng)根據(jù)資料回答下列問(wèn)題:(1)重疊延伸PCR技術(shù)是一種通過(guò)寡聚核苷酸鏈之間重疊的部分互相搭橋、互為模板,通過(guò)多次PCR擴(kuò)增,從而獲得目的基因的方法。利用該技術(shù)可以實(shí)現(xiàn)基因的定點(diǎn)誘變。它在需要誘變的位置合成兩個(gè)帶有變異基因堿基的互補(bǔ)引物,然后分別與引物a和引物d做PCR,這樣得到的兩個(gè)PCR引物產(chǎn)物都帶有變異基因,并且彼此重疊,再將重疊部位進(jìn)行重組PCR就能得到誘變PCR產(chǎn)物,如圖所示:①PCR擴(kuò)增DNA的過(guò)程中,引物a、b、c、d中,PCR1應(yīng)選擇圖1中引物_____,大量擴(kuò)增突變產(chǎn)物AD則應(yīng)選擇引物_____。

②重疊延伸PCR通過(guò)___________________________實(shí)現(xiàn)定點(diǎn)突變。PCR1和PCR2需要分別進(jìn)行的原因是_________________________。

a和ba和d在引物b和c上引入突變堿基引物b和引物c可以互補(bǔ)配對(duì),導(dǎo)致引物失效③若正常基因可被限制酶DpnⅠ識(shí)別并切割,特定位點(diǎn)突變后的基因不能被DpnⅠ識(shí)別,請(qǐng)?jiān)O(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)思路鑒定上述過(guò)程獲得的突變產(chǎn)物AD是否為突變基因:

用限制酶DpnⅠ分別處理正常基因和上述過(guò)程獲得的突變產(chǎn)物AD,然后進(jìn)行電泳;若上述過(guò)程獲得的突變產(chǎn)物AD的電泳條帶只有一條且大于正常基因的電泳條帶,則為突變基因3.反向PCR技術(shù)反向PCR技術(shù)是根據(jù)DNA片段中間的已知序列設(shè)計(jì)引物,擴(kuò)增已知序列兩側(cè)的未知序列。擴(kuò)增思路:先從未知序列的兩側(cè)把DNA切成片段,然后通過(guò)DNA連接酶將DNA片段環(huán)化;再利用已知序列的兩端設(shè)計(jì)引物,只不過(guò)引物相對(duì)于已知序列是反向配置的,所以子鏈反向延伸(如圖)。(2)反向PCR可用于擴(kuò)增未知序列,其原理如下圖所示。下圖鏈狀DNA分子內(nèi)側(cè)是已知序列,外側(cè)為未知序列。①不直接在圖2中DNA分子的兩端設(shè)計(jì)引物并進(jìn)行擴(kuò)增,原因是___________。

DNA兩端序列未知,無(wú)法設(shè)計(jì)引物②圖3中環(huán)狀DNA進(jìn)行PCR的過(guò)程中,沿引物A延伸子鏈的延伸方向是________(填“順時(shí)針”或“逆時(shí)針”),PCR產(chǎn)物______(填“含有”或“不含”)EcoRⅠ的酶切位點(diǎn)。

逆時(shí)針含有(1)如表所列為已知的DNA序列和設(shè)計(jì)的一些PCR引物，步驟Ⅲ選用的引物必須是________。名稱DNA序列(虛線處省略了部分核苷酸序列)已知序列5′-AACTATGCGCTCATGA－－－GCAATGCGTAGCCTCT-3′3′-TTGATACGCGAGTACT－－－CGTTACGCATCGGAGA-5′引物①5′-AACTATGCGCTCATGA-3′②5′-GCAATGCGTAGCCTCT-3′③5′-AGAGGCTACGCATTGC-3′④5′-TCATGAGCGCATAGTT-3′②④(2)對(duì)產(chǎn)物測(cè)序，經(jīng)分析得到了片段F的完整序列。下列單鏈序列中(虛線處省略了部分核苷酸序列)，結(jié)果正確的是______。A.5′-AACTATGCG－－－AGCCCTT-3′B.5′-AATTCCATG－－－CTGAATT-3′C.5′-GCAATGCGT－－－TCGGGAA-3′D.5′-TTGATACGC－－－CGAGTAC-3′B4.巢式PCR技術(shù)利用兩套引物進(jìn)行兩輪PCR擴(kuò)增。首先利用第一對(duì)引物(外引物)對(duì)目的基因所在的DNA進(jìn)行第一輪擴(kuò)增(經(jīng)過(guò)15~30次循環(huán)),第二輪擴(kuò)增以第一輪擴(kuò)增產(chǎn)物為模板,利用第二對(duì)引物(內(nèi)引物或巢式引物)結(jié)合在第一輪擴(kuò)增產(chǎn)物內(nèi)部,經(jīng)過(guò)15~30次循環(huán),獲得第二輪擴(kuò)增片段(即目的基因),最終第二輪擴(kuò)增片段短于第一輪,基本過(guò)程如圖所示:4.巢式PCR技術(shù)優(yōu)點(diǎn)：提高特異性：第一輪PCR使用一對(duì)外引物進(jìn)行擴(kuò)增，這些引物與模板DNA進(jìn)行非特異性配對(duì)，可能導(dǎo)致非特異性產(chǎn)物的產(chǎn)生。第二輪PCR使用一對(duì)內(nèi)引物（巢式引物），這些引物位于第一輪PCR產(chǎn)物的內(nèi)部，只能與正確擴(kuò)增的產(chǎn)物結(jié)合，從而大大降低了非特異性擴(kuò)增的可能性。增強(qiáng)靈敏度：第二輪PCR的擴(kuò)增產(chǎn)物通常較短，這意味著它可以從低拷貝的起始DNA樣本中擴(kuò)增出更多的產(chǎn)物，從而克服了單次PCR擴(kuò)增的靈敏度限制。通過(guò)兩輪PCR，可以從有限的起始DNA中擴(kuò)增得到足量的產(chǎn)物，這對(duì)于從低濃度的DNA樣本中檢測(cè)目標(biāo)基因非常重要。2.巢式PCR是指先后用外內(nèi)引物擴(kuò)增目的基因的方法。其原理為:先以比目的基因大的DNA片段為模板用外引物(F1，R1)進(jìn)行擴(kuò)增，獲得大量含目的基因的中間產(chǎn)物，再以擴(kuò)增后的中間產(chǎn)物為模板，用內(nèi)引物(F2，R2)擴(kuò)增目的基因，如圖所示。下列說(shuō)法錯(cuò)誤的是()A.兩對(duì)引物的堿基序列不相同，但均應(yīng)為單鏈DNA片段B.第二輪PCR反應(yīng)能否進(jìn)行，是對(duì)第一輪PCR反應(yīng)正確性的鑒定C.由于和兩套引物都互補(bǔ)的靶序列較少，該技術(shù)可大大提高擴(kuò)增的特異性D.如果兩套引物一起加入反應(yīng)體系中，外引物的復(fù)性溫度應(yīng)顯著低于內(nèi)引物D高于，更長(zhǎng)向?qū)NA它的部分序列通過(guò)堿基互補(bǔ)配對(duì)原則，與目的基因中希望被編輯的DNA序列相結(jié)合，sgRNA可以指導(dǎo)Cas蛋白對(duì)靶基因進(jìn)行敲除、插入和突變修飾。核酸酶Cas9CRISPR/Cas9是一種基于細(xì)菌天然免疫機(jī)制開發(fā)的基因編輯技術(shù)。經(jīng)簡(jiǎn)化改造的CRISPR系統(tǒng)由核酸內(nèi)切酶Cas9和sgRNA兩部分組成。CRISPR/Cas9基因編輯技術(shù)及其應(yīng)用一種來(lái)自細(xì)菌的核酸內(nèi)切酶功能Cas9sg在sgRNA引導(dǎo)下，切割與“向?qū)А盧NA結(jié)合的DNA，使DNA雙鏈斷裂(磷酸二酯鍵)。如Cas9識(shí)別的PAM是5'-NGG-3'(N表示任意核苷酸)CRISPR/Cas9系統(tǒng)向?qū)NA核酸酶Cas9CRISPR/Cas9基因編輯技術(shù)及其應(yīng)用4.(2024·德州二模)CRISPR/Cas9基因編輯技術(shù)能對(duì)基因進(jìn)行定點(diǎn)編輯,其原理如圖1所示。科研人員根據(jù)豬的細(xì)胞表面抗原基因RAG1的啟動(dòng)子設(shè)計(jì)了sgRNA1和sgRNA2,并利用CRISPR/Cas9基因編輯技術(shù)獲得了兩種基因敲除豬,檢測(cè)基因敲除豬體內(nèi)的RAG1表達(dá)情況如圖2所示。下列說(shuō)法錯(cuò)誤的是(

)A.CRISPR/Cas9識(shí)別目標(biāo)DNA序列主要與sgRNA序列的特異性相關(guān)B.基因敲除豬的細(xì)胞表面抗原減少,器官移植過(guò)程中免疫排斥作用減弱C.兩種sgRNA都可引導(dǎo)Cas9在轉(zhuǎn)錄水平上減弱RAG1的表達(dá)D.據(jù)圖2可知,用sgRNA2制備的基因敲除豬用于器官移植效果更好D5.PMP22基因在人基因組中有多個(gè)拷貝，表達(dá)產(chǎn)生的PMP22蛋白在人髓鞘細(xì)胞中不可或缺，但PMP22蛋白過(guò)量可引發(fā)腓骨肌萎縮癥(CMT1A)，科研人員希望利用CRISPR/Cas9基因編輯系統(tǒng)治療CMT1A。回答下列問(wèn)題：(1)CRISPR/Cas9基因編輯系統(tǒng)原理如圖1所示，Cas9蛋白可切割特定部位的DNA雙鏈，造成DNA損傷，一次切割過(guò)程中會(huì)產(chǎn)生____個(gè)游離的磷酸基團(tuán)。機(jī)體修復(fù)DNA損傷時(shí)，可能會(huì)改變堿基序列。圖中g(shù)RNA的作用是___________________________________。2定向引導(dǎo)Cas9蛋白與靶向基因結(jié)合(2)科研人員本來(lái)的基因編輯方案是將gRNA結(jié)合位點(diǎn)設(shè)計(jì)在PMP22基因內(nèi)部，后改為如圖2所示的方案，該方案比起原方案的優(yōu)點(diǎn)是:既能專一性切除多余的PMP22基因，又能確保必要的PMP22基因不被破壞，比破壞PMP22基因結(jié)構(gòu)更可靠(3)科研人員希望在人髓鞘細(xì)胞中表達(dá)CRISPR/Cas9基因編輯系統(tǒng)，構(gòu)建的基因表達(dá)載體如圖3所示。①在對(duì)gRNA對(duì)應(yīng)的DNA片段進(jìn)行PCR擴(kuò)增時(shí)，需要在上游和下游引物的5′端分別添加堿基序列_________________和__________________，保證DNA片段定向插入。②基因表達(dá)載體上，除了圖示序列和標(biāo)記基因外，還需要的序列是_________。5′－GTCGAC－3′5′－GGATCC－3′Cas9基因5.(2024·山東高考)研究發(fā)現(xiàn)基因L能夠通過(guò)脫落酸信號(hào)途徑調(diào)控大豆的逆境響應(yīng)。利用基因工程技術(shù)編輯基因L,可培育耐鹽堿大豆品系。在載體上的限制酶BsaⅠ切點(diǎn)處插入大豆基因L的向?qū)NA序列,將載體導(dǎo)入大豆細(xì)胞后,其轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物可引導(dǎo)核酸酶特異性結(jié)合基因組上的目標(biāo)序列并發(fā)揮作用。載體信息、目標(biāo)基因L部分序列及相關(guān)結(jié)果等如圖所示。(1)用PCR技術(shù)從大豆基因組DNA中擴(kuò)增目標(biāo)基因L時(shí),所用的引物越短,引物特異性越___(填“高”或“低”)。限制酶在切開DNA雙鏈時(shí),形成的單鏈突出末端為黏性末端,若用BsaⅠ酶切大豆基因組DNA,理論上可產(chǎn)生的黏性末端最多有__種。載體信息如圖甲所示,經(jīng)BsaⅠ酶切后,載體上保留的黏性末端序列應(yīng)為5'-________-3'和5'-________-3'。

低44GTTTCAAT(2)重組載體通過(guò)農(nóng)桿菌導(dǎo)入大豆細(xì)胞,使用抗生素__________篩選到具有該抗生素抗性的植株①~④。為了鑒定基因編輯是否成功,以上述抗性植株的DNA為模板,通過(guò)PCR擴(kuò)增目標(biāo)基因L,部分序列信息及可選用的酶切位點(diǎn)如圖乙所示,PCR產(chǎn)物完全酶切后的電泳結(jié)果如圖丙所示。據(jù)圖可判斷選用的限制酶是_______,其中純合的突變植株是_____(填序號(hào))。

卡那霉素SacⅠ

④(3)實(shí)驗(yàn)中獲得1株基因L成功突變的純合植株,該植株具有抗生素抗性,檢測(cè)發(fā)現(xiàn)其體細(xì)胞中只有1條染色體有T-DNA插入。用抗生素篩選這個(gè)植株的自交子代,其中突變位點(diǎn)純合且對(duì)抗生素敏感的植株所占比例為_____,篩選出的敏感植株可用于后續(xù)的品種選育。

1/4設(shè)基因L突變?yōu)榛騆',則該株基因L成功突變的純合植株的基因型為L(zhǎng)'L',由題中信息知,一條染色體插入了T-DNA,若其插入了L'所在染色體,其所在染色體記為L(zhǎng)'1,則其自交子代的基因型及比例為L(zhǎng)'1L'1∶L'1L'∶L'L'=1∶2∶1。得到敏感型品種的原因是不具有卡那霉素抗性基因，也就沒有向?qū)NA序列和核酸酶基因，目的是去除基因編輯工具，因?yàn)楣ぞ咭呀?jīng)完成了使命。拓展：Cre/LoxP重組酶系統(tǒng)基因編輯Cre-LoxP系統(tǒng)是一種重組酶系統(tǒng)，能在DNA特定位點(diǎn)上執(zhí)行刪除、插入、易位及倒位，是一種廣泛應(yīng)用的基因編輯工具，可以達(dá)到在基因水平上對(duì)生物體進(jìn)行定向遺傳改造的目的，在真核和原核系統(tǒng)中均適用。(1)Cre重組酶：由噬菌體P1的Cre基因編碼，具有限制酶特性，能夠特異性識(shí)別LoxP位點(diǎn)。能介導(dǎo)兩個(gè)LoxP位點(diǎn)間的基因序列被刪除或重組。(2)LoxP序列：來(lái)源于P1噬菌體，包括兩個(gè)13bp的反向重復(fù)序列和一個(gè)8bp的間隔區(qū)域，反向重復(fù)序列是Cre重組酶的特異識(shí)別位點(diǎn)，而間隔區(qū)域決定了LoxP位點(diǎn)的方向。拓展：Cre/LoxP重組酶系統(tǒng)基因編輯(1)Cre重組酶：由噬菌體P1的Cre基因編碼，具有限制酶特性，能夠特異性識(shí)別LoxP位點(diǎn)。能介導(dǎo)兩個(gè)LoxP位點(diǎn)間的基因序列被刪除或重組（具有DNA內(nèi)切酶和DNA連接酶的活性）。(2)LoxP序列：來(lái)源于P1噬菌體，包括兩個(gè)13bp的反向重復(fù)序列和一個(gè)8bp的間隔區(qū)域，反向重復(fù)序列是Cre重組酶的特異識(shí)別位點(diǎn)，而間隔區(qū)域決定了LoxP位點(diǎn)的方向。拓展：Cre/LoxP重組酶系統(tǒng)基因編輯(3)①同向LoxP：如果兩個(gè)LoxP位點(diǎn)位于一條DNA鏈上，且方向相同，Cre重組酶能有效切除兩個(gè)LoxP位點(diǎn)間的序列，僅保留一個(gè)LoxP。②反向LoxP：如果兩個(gè)LoxP位點(diǎn)位于一條DNA鏈上，但方向相反，Cre重組酶能導(dǎo)致兩個(gè)LoxP位點(diǎn)間的序列倒位。1.Cre-Loxp系統(tǒng)是基因工程中常用的特異性重組酶系統(tǒng)，該系統(tǒng)中的Cre酶能根據(jù)兩個(gè)Loxp的方向刪除或倒置位于兩個(gè)Loxp序列間的基因，如圖1所示。現(xiàn)使用Cre-Loxp系統(tǒng)構(gòu)建TK基因缺失的病毒毒株，為研發(fā)該病毒的疫苗提供候選毒株，構(gòu)建過(guò)程如圖2所示，下列分析錯(cuò)誤的是（

）A．圖1中Gene兩端需含有兩個(gè)相同的堿基序列B．位于RFP基因兩端的Loxp序列方向相反C．Cre酶處理之前，應(yīng)初步篩選出有紅色熒光基因的病毒D．Cre酶在圖2過(guò)程中的具有限制酶和DNA連接酶的功能B2.（2024·浙江杭州二模）Cre-loxP是一種常用的基因改造工具，Cre基因的表達(dá)產(chǎn)物是Cre酶，loxP是一段DNA序列。當(dāng)Cre酶遇到兩段loxP序列時(shí)，能將兩段loxP序列中間的序列刪除。甲為Cre基因的雜合個(gè)體（全身各細(xì)胞均表達(dá)Cre基因），乙是含外源基因D的純合個(gè)體（D基因兩端帶有l(wèi)oxP序列），兩種基因在染色體上的分布如圖所示。現(xiàn)將甲和乙雜交，得到的F1自由交配，則F2中含D基因的個(gè)體的比例為（

）A.1/4

B.3/8

C.5/16

D.9/32C拓展：In－Fusion技術(shù)以In-Fusion為代表的新型克隆方式，與傳統(tǒng)的“限制性內(nèi)切酶酶切-DNA連接酶連接”的克隆方法不同，是一種基于同源重組原理的分子克隆方法。In-Fusion克隆在引物兩頭加上的是一段15~20bp來(lái)自載體酶切位點(diǎn)兩側(cè)