內皮素-1基因多態性與冠狀動脈痙攣的關聯性探究：基于分子與臨床視角一、引言1.1研究背景冠狀動脈痙攣（CAS）作為一種具有潛在嚴重后果的心血管疾病，自1959年被Prinzmetal等首次描述以來，逐漸受到醫學界的廣泛關注。CAS是指各種原因導致的冠狀動脈一過性收縮，引起血管不完全性或完全性閉塞，從而導致心肌缺血、缺氧，引發一系列臨床癥狀，包括心絞痛、心律失常、急性心肌梗死甚至猝死。近年來，隨著心血管診斷技術的不斷進步，如冠狀動脈造影、血管內超聲、光學相干斷層掃描等，對CAS的認識和診斷水平有了顯著提高。流行病學研究顯示，CAS在不同人群中的發病率存在差異，在日本，其發病率相對較高，約占心絞痛患者的10%-30%，而在歐美國家，發病率約為5%-15%。在中國，雖然缺乏大規模的流行病學調查數據，但臨床研究表明，CAS在冠心病患者中并不罕見，且其發病率有逐漸上升的趨勢。CAS的發病機制目前尚未完全明確，但普遍認為是多種因素共同作用的結果。其中，血管內皮功能障礙被認為是CAS發生的關鍵環節。正常情況下，血管內皮細胞通過合成和釋放多種血管活性物質，如一氧化氮（NO）、前列環素（PGI?）等，維持血管的舒張狀態，并抑制血小板聚集和血管平滑肌細胞的增殖。當血管內皮受損時，內皮細胞功能發生紊亂，NO和PGI?等舒張因子的合成和釋放減少，而收縮因子如內皮素-1（ET-1）的分泌增加，導致血管舒縮平衡失調，從而容易引發冠狀動脈痙攣。此外，血管平滑肌細胞的異常收縮反應、自主神經功能失衡、炎癥反應以及遺傳因素等也在CAS的發病過程中發揮重要作用。ET-1作為一種強效的血管收縮肽，由血管內皮細胞合成和分泌，其生物學效應主要通過與血管平滑肌細胞表面的特異性受體ETA和ETB結合來實現。ETA受體主要介導血管收縮、細胞增殖和纖維化等作用，而ETB受體則具有雙重作用，在生理狀態下，主要通過促進NO和PGI?的釋放，發揮血管舒張和抗增殖作用；在病理狀態下，ETB受體也可介導血管收縮和細胞增殖等效應。ET-1不僅在維持正常血管張力中發揮重要作用，而且在多種心血管疾病的發生發展過程中扮演著關鍵角色。研究表明，在冠心病、高血壓、心力衰竭等心血管疾病患者中，血漿ET-1水平明顯升高，且與疾病的嚴重程度和預后密切相關。基因多態性是指在人群中，同一基因位點上存在兩種或兩種以上的等位基因，且其頻率大于1%。基因多態性可以影響基因的表達和功能，從而導致個體對疾病的易感性、藥物反應性等方面的差異。ET-1基因位于染色體6p23-p24，全長約5.5kb，由5個外顯子和4個內含子組成。目前已發現ET-1基因存在多個單核苷酸多態性（SNP）位點，這些位點的基因多態性可能通過影響ET-1的合成、分泌、代謝以及與受體的結合等過程，進而影響血管的舒縮功能和心血管疾病的發生發展。例如，位于ET-1基因外顯子1的+138位點的A插入/缺失多態性（rs10478694），可影響ET-1基因的轉錄效率，從而導致血漿ET-1水平的變化；位于內含子4的第8002位點的G/A多態性（rs2071942）和外顯子5的第5665位點的G/T多態性（rs5370）也被報道與心血管疾病的發生風險相關。鑒于CAS的臨床重要性以及ET-1基因多態性在心血管疾病中的潛在作用，探討ET-1基因多態性與CAS的相關性具有重要的理論和臨床意義。深入研究兩者之間的關系，不僅有助于進一步揭示CAS的發病機制，為其早期診斷和預防提供新的理論依據，而且可能為開發針對CAS的個性化治療策略提供新的靶點和思路，從而改善患者的預后，降低心血管事件的發生率和死亡率。1.2研究目的與意義本研究旨在通過對冠狀動脈痙攣患者和健康對照人群的基因檢測和分析，明確內皮素-1基因多態性在兩組人群中的分布差異，進而揭示內皮素-1基因多態性與冠狀動脈痙攣之間的內在關聯，為深入理解冠狀動脈痙攣的發病機制提供新的視角和理論依據。從理論意義來看，盡管目前對冠狀動脈痙攣的發病機制有了一定的認識，但仍存在許多未知領域。血管內皮功能障礙被認為是冠狀動脈痙攣發生的重要環節，而內皮素-1作為一種關鍵的血管活性物質，其基因多態性對血管舒縮功能的影響機制尚不完全清楚。本研究通過探討內皮素-1基因多態性與冠狀動脈痙攣的相關性，有望進一步闡明血管內皮功能障礙在冠狀動脈痙攣發病中的作用機制，豐富和完善冠狀動脈痙攣的病理生理學理論體系。這不僅有助于深入理解心血管疾病的發病機制，還可能為其他相關心血管疾病的研究提供借鑒和啟示，推動心血管領域基礎研究的發展。從臨床意義而言，冠狀動脈痙攣具有較高的發病率和死亡率，嚴重威脅著人類的健康。準確預測冠狀動脈痙攣的發生風險，對于早期干預和預防心血管事件的發生至關重要。目前，臨床上對于冠狀動脈痙攣的診斷主要依賴于癥狀、心電圖和冠狀動脈造影等檢查手段，但這些方法存在一定的局限性，難以早期準確識別高危人群。本研究若能證實內皮素-1基因多態性與冠狀動脈痙攣之間存在密切關聯，將為冠狀動脈痙攣的早期診斷提供新的生物標志物。通過對特定基因多態性的檢測，可以篩選出冠狀動脈痙攣的高危個體，從而實現早期干預，降低心血管事件的發生率。此外，基于基因多態性的研究結果，還可以為冠狀動脈痙攣的個性化治療提供理論依據。根據患者的基因特征，制定更加精準的治療方案，提高治療效果，改善患者的預后，具有重要的臨床應用價值。二、冠狀動脈痙攣與內皮素-1基因多態性概述2.1冠狀動脈痙攣2.1.1定義與發病機制冠狀動脈痙攣指各種原因致使冠狀動脈出現一過性收縮，進而引發血管部分或完全性閉塞，最終導致心肌缺血的一組臨床綜合征。這一概念自1959年被Prinzmetal等首次描述后，便受到醫學界的高度關注。冠狀動脈痙攣的發生機制較為復雜，是神經機制和體液機制等多種因素共同作用的結果。從神經機制方面來看，中樞神經和植物神經活動在冠狀動脈痙攣的發生過程中起著重要作用。當人體處于心理應激狀態，如孤獨、興奮、緊張、焦慮、驚恐時，或遭受寒冷刺激、進行劇烈運動時，交感神經會過度興奮。交感神經興奮會使體內兒茶酚胺類物質釋放增加，這些物質作用于冠狀動脈平滑肌上的受體，可引起冠狀動脈收縮。此外，冠狀動脈局部的神經調節也可能出現異常，導致血管對各種刺激的反應性增強，從而誘發冠狀動脈痙攣。研究表明，應用β受體阻滯劑和腎上腺素等藥物也可誘發冠狀動脈痙攣，這進一步說明了神經調節在冠狀動脈痙攣發病機制中的重要性。在體液機制方面，血栓素和前列腺素之間、內皮素與內皮舒張因子之間在局部的平衡是調節血管口徑的關鍵因素。當冠狀動脈發生硬化狹窄時，血管處血小板數量增多，內皮脫落，血小板變得黏附性增強，會釋放出血栓素、五羥色胺等物質。同時，粥樣硬化處管壁合成前列腺素減少，具有強烈血管收縮作用的血栓素增多，而具有舒張作用的前列腺素減少，這種平衡的失調就容易引發冠狀動脈痙攣。另外，內皮素-1作為一種強效的血管收縮肽，由血管內皮細胞合成和分泌。在血管內皮受損等病理狀態下，內皮素-1的分泌會增加，它與血管平滑肌細胞表面的特異性受體ETA和ETB結合，介導血管收縮、細胞增殖等效應，從而在冠狀動脈痙攣的發生發展中發揮重要作用。血管平滑肌細胞的異常收縮反應也是冠狀動脈痙攣發病機制的重要環節。在某些刺激因素作用下，血管平滑肌細胞的收縮敏感性增高，可發生血管過度收縮。自主神經功能障礙也與冠狀動脈痙攣密切相關，目前認為冠狀動脈痙攣患者在基礎情況下表現為迷走神經活動減弱、交感神經活性相對較高的狀態，從而使痙攣易感性增加，但也有研究認為痙攣發生前迷走神經活性增強可誘發冠狀動脈痙攣。遺傳因素也不容忽視，有研究表明與一氧化氮合成酶相關基因的某種變異可能使患者易于發生冠狀動脈痙攣。此外，氧化應激、炎癥、鎂離子與氫離子的作用以及心理應激等都可能參與冠狀動脈痙攣的發生。2.1.2流行病學特征冠狀動脈痙攣在不同地區和人群中的發病情況存在顯著差異。在日本，由于其獨特的遺傳背景和生活方式等因素，冠狀動脈痙攣的發病率相對較高，約占心絞痛患者的10%-30%。而在歐美國家，發病率則相對較低，約為5%-15%。這種差異可能與不同地區人群的遺傳易感性、飲食習慣、環境因素以及心血管危險因素的分布不同有關。例如，日本人群的飲食中富含魚類等富含不飽和脂肪酸的食物，但同時也存在工作壓力大、精神緊張等因素，這些因素可能共同影響了冠狀動脈痙攣的發病風險。在中國，雖然目前缺乏大規模的流行病學調查數據，但從臨床研究來看，冠狀動脈痙攣在冠心病患者中并不罕見。隨著生活方式的改變和人口老齡化的加劇，心血管疾病的發病率呈上升趨勢，冠狀動脈痙攣的發病率也可能隨之增加。一些研究表明，在一些特定人群中，如吸煙者、高血壓患者、糖尿病患者等，冠狀動脈痙攣的發病風險更高。這可能是因為這些人群存在血管內皮功能障礙、炎癥反應等病理生理改變，從而增加了冠狀動脈痙攣的發生幾率。此外，近年來，隨著心血管診斷技術的不斷進步，對冠狀動脈痙攣的診斷率也有所提高，這可能導致臨床上發現的冠狀動脈痙攣病例數增加，進一步提示了其在心血管疾病中的重要性。2.1.3臨床表現與診斷方法冠狀動脈痙攣的臨床表現多樣，最常見的癥狀為胸痛或胸悶，其特點與典型的心絞痛相似，但發作時間和誘因可能有所不同。部分患者的胸痛或胸悶癥狀在安靜時出現，而不是像勞力性心絞痛那樣在運動或情緒激動時發作。疼痛的程度輕重不一，輕者可能僅表現為短暫的胸部不適，重者則可出現劇烈的胸痛，甚至伴有瀕死感。疼痛持續的時間也因人而異，短則數分鐘，長則可達半小時以上。除了胸痛和胸悶外，冠狀動脈痙攣還可能導致心律失常，如室性早搏、室性心動過速、房顫等，嚴重時可引起心室纖顫、嚴重房室傳導阻滯甚至心室停搏，導致猝死。此外，冠狀動脈痙攣還可能誘發急性心肌梗死，這是因為冠狀動脈痙攣導致血管完全閉塞，心肌持續缺血缺氧，最終引發心肌梗死。目前，冠狀動脈痙攣的診斷主要依靠多種檢查方法的綜合應用。心電圖是診斷冠狀動脈痙攣的重要手段之一，尤其是在發作時的心電圖記錄或動態心電圖檢查，對于診斷具有重要意義。在冠狀動脈痙攣發作時，心電圖可表現出ST段抬高、壓低或T波改變等缺血性改變。當冠狀動脈痙攣導致血管接近完全閉塞時，往往表現為ST段抬高；而非完全閉塞性痙攣則可能表現為ST段壓低或T波改變。然而，需要注意的是，部分冠狀動脈痙攣患者在發作間期心電圖可能完全正常，這就增加了診斷的難度。冠狀動脈造影是診斷冠狀動脈痙攣的金標準，通過冠狀動脈造影可以直觀地觀察冠狀動脈的形態和血流情況，確定是否存在冠狀動脈痙攣以及痙攣的部位和程度。在冠狀動脈造影過程中，如果發現正常冠狀動脈出現一過性狹窄或完全閉塞，或者冠狀動脈粥樣硬化性狹窄部位出現一過性進一步狹窄或完全閉塞，且在給予硝酸鹽類或鈣拮抗劑類及其他擴冠藥物后，上述狹窄或閉塞迅速消失或自行消失，則可確診為冠狀動脈痙攣。但冠狀動脈造影屬于有創檢查，存在一定的風險，且對于一些痙攣發作不頻繁的患者，可能難以在檢查時捕捉到痙攣發作，從而導致漏診。除了心電圖和冠狀動脈造影外，還可以通過一些其他檢查方法輔助診斷冠狀動脈痙攣。例如，乙酰膽堿試驗是一種常用的激發試驗，通過冠狀動脈內注射乙酰膽堿后，觀察冠狀動脈狹窄程度是否達到90%以上，同時是否出現類似平時的胸痛或胸悶發作，伴或不伴有心電圖缺血性改變，在冠狀動脈痙攣解除后胸痛或胸悶是否隨之緩解，以此來輔助診斷冠狀動脈痙攣。此外，非創傷性診斷方法如核素灌注心肌顯像負荷試驗，呈現反向再分布，即負荷狀態下心肌血流灌注良好但靜息狀態下出現灌注缺損，也有助于冠狀動脈痙攣的診斷。2.2內皮素-1基因多態性2.2.1內皮素-1的生物學特性內皮素（ET）是一類由21個氨基酸組成的活性多肽，在人體的生理和病理過程中發揮著關鍵作用。內皮素家族包含三種異構體，即內皮素-1（ET-1）、內皮素-2（ET-2）和內皮素-3（ET-3）。這三種異構體之間僅有2-6個氨基酸的差異，卻呈現出組織特異性分布和不同的生物學功能。ET-1主要由血管內皮細胞合成和分泌，在心血管系統中含量豐富，對心血管功能的調節起著至關重要的作用；ET-2在腎臟等組織中表達相對較高；ET-3則在神經系統和腸道等組織中較為豐富。ET-1的結構獨特，其分子內含有兩對由半胱氨酸形成的二硫鍵，這一結構對于維持其生物學活性至關重要。其前體是一個含有203個氨基酸的片段，經過一系列復雜的剪切過程，先形成含38-39個氨基酸的大內皮素，最后在特異性的內皮素轉化酶（ECE）作用下，加工形成具有生物活性的21個氨基酸的ET-1。血管緊張素Ⅱ、缺氧、剪切力以及炎癥因子等多種因素，均可通過誘導轉錄因子如GATA序列（GATA-2）、果蠅表皮生長因子（Smad）、核因子κB（NF-κB）及缺氧誘導因子-1（HIF-1）等，激活內皮素轉錄基因，從而促進ET-1的合成與分泌。ET-1的生物學功能廣泛，對心血管系統的作用尤為顯著。作為一種強效的縮血管肽，ET-1具有強烈的縮血管作用。當ET-1與血管平滑肌細胞表面的特異性受體結合后，通過激活蛋白激酶C等信號轉導途徑，促使細胞骨架重構和肌球蛋白輕鏈磷酸化，進而導致平滑肌細胞收縮，引起血管收縮。在高血壓、肺動脈高壓等病理狀態下，ET-1的表達水平顯著增高，通過介導血管收縮和增加心臟負荷，進一步加重病情。ET-1還具有促進細胞增殖的作用，能夠刺激血管平滑肌細胞、心肌細胞等的增殖，在動脈粥樣硬化、血管重塑等病理過程中發揮重要作用。在冠狀動脈粥樣硬化斑塊形成過程中，ET-1的持續高水平表達，可導致心肌肥厚、心臟纖維化等不良后果。ET-1對心臟的生理功能也有重要調節作用，在心肌缺血早期，適量的ET-1可通過激活ETA下游蛋白酶C（PKC）通路及三磷腺苷（ATP）敏感的鉀離子通道，對心臟起到保護作用，類似于缺血預適應。但如果ET-1水平持續過高，則會對心臟產生不利影響。2.2.2內皮素-1基因結構及多態性位點內皮素-1基因（EDN1）在人體的生理和病理過程中扮演著關鍵角色，其結構復雜且具有多態性。人類的ET-1基因定位于染色體6p23-p24，全長約5.5kb，結構基因由5個外顯子和4個內含子組成。這種基因結構的復雜性決定了其表達調控的精細性，多個順式作用元件和反式作用因子參與其中，共同調節ET-1基因的轉錄和翻譯過程。目前已發現ET-1基因存在多個單核苷酸多態性（SNP）位點，這些位點的多態性可能對ET-1的表達和功能產生重要影響。其中，較為常見的多態性位點包括位于外顯子1的+138位點的A插入/缺失多態性（rs10478694），該位點的變異可影響ET-1基因的轉錄效率。當此位點發生A插入或缺失時，會改變基因轉錄起始復合物與啟動子區域的結合親和力，進而影響轉錄因子的招募和轉錄的起始，最終導致血漿ET-1水平的變化。位于內含子4的第8002位點的G/A多態性（rs2071942）和外顯子5的第5665位點的G/T多態性（rs5370）也被廣泛研究。這些位點的多態性可能通過影響mRNA的剪接、穩定性或翻譯效率，間接影響ET-1的表達和功能。不同種族和人群中，ET-1基因多態性位點的分布頻率存在顯著差異。研究表明，在亞洲人群中，某些多態性位點的頻率可能與歐洲人群有所不同。這種差異可能與種族的遺傳背景、環境因素以及長期的進化選擇有關。例如，某些多態性位點在亞洲人群中可能與特定的生活方式或環境暴露因素相互作用，從而影響心血管疾病的發生風險。這種種族間的差異為研究ET-1基因多態性與疾病的關聯性帶來了挑戰，同時也提示在進行相關研究時，需要充分考慮種族因素對結果的影響。2.2.3基因多態性對內皮素-1表達和功能的影響內皮素-1基因多態性對其表達和功能的影響是一個復雜而精細的過程，涉及多個層面的調控機制。不同基因型的ET-1基因通過影響基因轉錄、mRNA加工和翻譯等過程，導致ET-1表達量的差異。對于位于外顯子1的+138位點的A插入/缺失多態性（rs10478694），攜帶不同基因型的個體在ET-1表達水平上存在顯著差異。研究發現，與其他基因型相比，某些特定基因型的個體可能具有更高的ET-1轉錄活性，從而導致血漿ET-1水平升高。這是因為該位點的多態性會改變基因啟動子區域的結構和功能，影響轉錄因子與啟動子的結合親和力。當轉錄因子與啟動子的結合增強時，會促進RNA聚合酶的招募和轉錄起始，進而增加ET-1基因的轉錄效率，使ET-1的合成增加。反之，若結合減弱，則會抑制轉錄，降低ET-1的表達水平。位于內含子4的第8002位點的G/A多態性（rs2071942）和外顯子5的第5665位點的G/T多態性（rs5370）也可通過影響mRNA的剪接過程，對ET-1表達產生影響。這些位點的變異可能改變mRNA剪接信號，導致產生不同的剪接異構體。某些異常的剪接異構體可能穩定性降低，容易被降解，從而減少了成熟mRNA的數量，最終導致ET-1的表達下降。相反，若剪接過程有利于產生穩定且高效翻譯的mRNA，ET-1的表達則會相應增加。ET-1基因多態性不僅影響其表達量，還可能對ET-1的生物學活性產生影響。不同基因型所編碼的ET-1蛋白在氨基酸序列上可能存在微小差異，這些差異雖然看似微不足道，但卻可能改變ET-1與受體的結合能力、受體激活后的信號轉導效率以及ET-1在體內的代謝過程。某些基因型的ET-1蛋白可能與血管平滑肌細胞表面的ETA受體具有更高的親和力，使其在較低濃度下就能有效激活受體，介導更強的血管收縮反應；而另一些基因型的ET-1蛋白與受體的結合能力較弱，導致其生物學活性降低。這種因基因多態性導致的生物學活性差異，在心血管疾病的發生發展過程中可能起到關鍵作用，進一步影響血管的舒縮功能、細胞增殖和心血管系統的穩態。三、研究設計與方法3.1研究對象選取本研究的病例組為[具體時間段]在[醫院名稱]心內科住院且經臨床確診為冠狀動脈痙攣的患者，共[X]例。納入標準為：第一，具有典型的胸痛或胸悶癥狀，發作時心電圖呈現ST段抬高、壓低或T波改變等缺血性改變，且癥狀可在數分鐘至半小時內自行緩解或經含服硝酸甘油等藥物后緩解；第二，冠狀動脈造影顯示正常冠狀動脈或冠狀動脈粥樣硬化性狹窄部位出現一過性狹窄或完全閉塞，且在給予硝酸鹽類或鈣拮抗劑類及其他擴冠藥物后，上述狹窄或閉塞迅速消失或自行消失；第三，乙酰膽堿激發試驗陽性，即冠狀動脈內注射乙酰膽堿后誘發冠狀動脈痙攣致狹窄達到90%以上，同時伴有類似平時的胸痛或胸悶發作，伴或不伴有心電圖缺血性改變，在冠狀動脈痙攣解除后胸痛或胸悶隨之緩解。排除標準如下：一是合并嚴重肝腎功能不全、惡性腫瘤、自身免疫性疾病等可能影響內皮素-1基因表達或機體代謝的全身性疾病；二是近期（3個月內）有急性心肌梗死、腦血管意外、重大手術或創傷史；三是正在服用可能影響內皮素-1水平或基因表達的藥物，如血管緊張素轉換酶抑制劑、血管緊張素Ⅱ受體拮抗劑、鈣通道阻滯劑等，且無法在研究前停藥足夠時間（洗脫期）；四是孕婦或哺乳期婦女。對照組則選取同期在[醫院名稱]進行健康體檢的人群，共[X]例。納入標準為：無胸痛、胸悶等心血管系統相關癥狀和體征，經詳細詢問病史、體格檢查、常規心電圖、動態心電圖、心臟超聲以及運動平板試驗等檢查，均未發現心血管系統疾病；年齡、性別與病例組匹配，以減少年齡和性別因素對研究結果的干擾。排除標準與病例組相同，以確保兩組人群在基線特征上具有可比性，排除其他混雜因素對內皮素-1基因多態性與冠狀動脈痙攣關系的影響。3.2實驗方法3.2.1樣本采集與處理在研究對象入選后，于清晨空腹狀態下，使用含有EDTA抗凝劑的真空采血管，采集病例組和對照組外周靜脈血5ml。采集過程嚴格遵循無菌操作原則，以避免樣本污染。采集后的血液樣本應盡快送往實驗室進行處理，若不能及時處理，需暫時保存于4℃冰箱中，但保存時間不宜超過2小時。血液樣本的處理主要是提取基因組DNA，本研究采用酚-仿抽提法進行DNA提取。具體步驟如下：將采集的5ml外周靜脈血轉移至15ml離心管中，加入等體積的紅細胞裂解液，輕柔顛倒混勻，室溫靜置10分鐘，使紅細胞充分裂解。隨后，以3000rpm的轉速離心5分鐘，棄去上清液，此時沉淀為白細胞。向白細胞沉淀中加入適量STE緩沖液，重懸細胞，再加入10%SDS至終濃度為1%，以及10mg/ml蛋白酶K至終濃度為100μg/ml，充分混勻后，置于56℃水浴鍋中孵育3小時，期間不時輕柔震蕩，以促進細胞裂解和蛋白質消化。待細胞完全消化后，將離心管冷卻至室溫，加入等體積的飽和酚，緩慢顛倒混勻20分鐘，使蛋白質充分溶解于酚相中。接著，以4000rpm的轉速離心10分鐘，此時溶液分為三層，上層為含DNA的水相，中層為變性蛋白質，下層為酚相。小心吸取上層水相轉移至另一新的15ml離心管中，加入等體積的仿：異戊醇（24:1）混合液，緩慢顛倒混勻20分鐘，進一步去除蛋白質和其他雜質。再次以4000rpm的轉速離心10分鐘，吸取上層水相轉移至新離心管中。向上清液中加入1/10體積的3MNaAc（pH5.2）和2倍體積的無水乙醇，緩慢顛倒混勻，可見白色絲狀的DNA析出。用無菌牙簽或玻璃棒小心挑出DNA，轉移至含有1ml70%乙醇的EP管中，以12000rpm的轉速離心3-5分鐘，棄去上清液，沉淀用1ml70%乙醇洗滌1-2次，再次離心棄去上清液，室溫風干或使用DNA風干機抽干DNA沉淀。最后，用100μlTE緩沖液溶解DNA沉淀，將提取的DNA保存于-20℃冰箱中備用。提取的基因組DNA質量和濃度需進行檢測。采用紫外分光光度計測定DNA在260nm和280nm波長處的吸光度（A值），根據A260/A280的比值判斷DNA的純度，比值在1.8-2.0之間表明DNA純度較高，蛋白質等雜質污染較少。同時，根據A260值計算DNA的濃度，公式為：DNA濃度（μg/μl）=A260×稀釋倍數×50÷1000。此外，還需通過1%瓊脂糖凝膠電泳對DNA進行定性檢測，觀察DNA條帶的完整性和是否存在降解情況。若DNA條帶清晰、無拖尾現象，則表明DNA質量良好，可用于后續實驗。3.2.2基因多態性檢測技術本研究采用直接測序法檢測內皮素-1基因多態性位點，該方法是目前基因多態性檢測的金標準，具有準確性高、可直接讀取DNA序列信息等優點。首先，根據GenBank中公布的內皮素-1基因序列，使用PrimerPremier5.0軟件設計針對目標多態性位點（如外顯子1的+138位點、內含子4的第8002位點、外顯子5的第5665位點等）的特異性引物。引物設計原則如下：引物長度一般為18-25bp，GC含量在40%-60%之間，避免引物內部形成二級結構和引物二聚體，引物3'端盡量避免出現連續的3個以上的相同堿基，且引物的Tm值應在55-65℃之間。設計好的引物由專業生物公司合成。以提取的基因組DNA為模板進行聚合酶鏈式反應（PCR）擴增。PCR反應體系總體積為25μl，包括10×PCR緩沖液2.5μl，2.5mmol/LdNTPs2μl，上下游引物（10μmol/L）各0.5μl，TaqDNA聚合酶0.5μl（5U/μl），模板DNA1μl（約50-100ng），ddH?O補足至25μl。PCR反應條件為：95℃預變性5分鐘，使DNA雙鏈充分解開；然后進行35個循環，每個循環包括95℃變性30秒，使DNA雙鏈再次解鏈；55-60℃退火30秒，引物與模板DNA特異性結合；72℃延伸30-60秒，在TaqDNA聚合酶的作用下，以dNTPs為原料，合成新的DNA鏈；最后72℃延伸10分鐘，使PCR產物充分延伸。PCR反應結束后，取5μlPCR產物進行1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測，觀察是否擴增出特異性條帶，且條帶大小是否與預期相符。若擴增出的條帶清晰、單一，無雜帶，則表明PCR擴增成功。將PCR擴增成功的產物送往專業測序公司進行測序。測序前，需對PCR產物進行純化，以去除殘留的引物、dNTPs、TaqDNA聚合酶等雜質，保證測序結果的準確性。常用的純化方法有柱式純化法和磁珠純化法，本研究采用柱式純化法。將PCR產物加入到含有硅膠膜的離心柱中，通過離心使PCR產物結合到硅膠膜上，然后依次用洗滌緩沖液洗滌，去除雜質，最后用洗脫緩沖液將純化后的PCR產物從硅膠膜上洗脫下來。將純化后的PCR產物與測序引物混合，按照測序公司的要求進行測序反應。測序反應采用熒光標記的雙脫氧核苷酸終止法，在DNA合成過程中，加入帶有不同熒光標記的雙脫氧核苷酸，當雙脫氧核苷酸摻入到DNA鏈中時，DNA合成終止，通過檢測不同熒光信號的出現位置，即可確定DNA的序列。測序完成后，測序公司會返回測序結果文件，通常為abi格式或txt格式。使用專業的序列分析軟件（如Chromas、DNAMAN等）對測序結果進行分析。將測序得到的序列與GenBank中公布的內皮素-1基因參考序列進行比對，找出多態性位點，并確定每個樣本在該位點的基因型。對于雜合子樣本，測序峰圖會顯示出雙峰，根據雙峰的位置和高度可判斷雜合子的類型；對于純合子樣本，測序峰圖則顯示為單峰。通過對病例組和對照組樣本的基因序列分析，統計各多態性位點不同基因型和等位基因的分布頻率，為后續的統計學分析提供數據基礎。3.3數據收集與分析詳細收集病例組和對照組研究對象的臨床資料，內容涵蓋基本信息、生活習慣、病史、臨床癥狀與體征以及輔助檢查結果等多個方面。基本信息包括年齡、性別、身高、體重、民族等；生活習慣涉及吸煙史（吸煙年限、每日吸煙量、是否戒煙及戒煙時間）、飲酒史（飲酒類型、飲酒頻率、每次飲酒量）、飲食習慣（是否偏好高鹽、高脂、高糖食物，蔬菜水果攝入頻率等）以及運動情況（運動頻率、運動類型、每次運動時長）。病史方面，記錄高血壓、糖尿病、高血脂、冠心病、腦血管疾病等既往疾病史，包括疾病診斷時間、治療情況及病情控制現狀；還需了解家族遺傳病史，如家族中是否有心血管疾病、糖尿病等遺傳傾向疾病患者。臨床癥狀與體征重點關注胸痛或胸悶的發作特點，包括發作頻率、發作時間（如清晨、夜間、運動時等）、持續時間、疼痛程度（采用視覺模擬評分法等評估）、疼痛部位及放射部位，以及是否伴有心悸、呼吸困難、頭暈、出汗等其他癥狀；同時記錄血壓、心率、心律、心肺聽診等體征信息。輔助檢查結果收集包括心電圖（發作時及發作間期的心電圖，分析ST段、T波、心律失常等情況）、冠狀動脈造影（冠狀動脈狹窄程度、部位、痙攣情況等）、心臟超聲（心臟結構和功能參數，如左心室射血分數、室壁運動情況等）、血液檢查（血常規、血脂、血糖、肝腎功能、心肌酶譜、C反應蛋白等指標）。使用SPSS26.0統計軟件對收集的數據進行分析。對于計量資料，先進行正態性檢驗，若符合正態分布，采用均數±標準差（x±s）表示，兩組間比較采用獨立樣本t檢驗；若不服從正態分布，則采用中位數（四分位數間距）[M（P25，P75）]表示，兩組間比較采用非參數檢驗，如Mann-WhitneyU檢驗。計數資料以例數和百分比（n，%）表示，兩組間比較采用χ2檢驗；當理論頻數小于5時，采用Fisher確切概率法。基因多態性分析方面，統計病例組和對照組中內皮素-1基因各多態性位點的基因型和等位基因頻率。通過哈迪-溫伯格平衡（Hardy-Weinbergequilibrium，HWE）檢驗判斷樣本是否具有群體代表性，若P>0.05，則認為樣本符合HWE，可進行后續分析。采用比值比（oddsratio，OR）及其95%置信區間（95%confidenceinterval，95%CI）評估基因多態性與冠狀動脈痙攣的關聯強度，運用χ2檢驗比較兩組基因型和等位基因頻率的差異，P<0.05為差異具有統計學意義。在單因素分析的基礎上，將具有統計學意義的因素納入多因素Logistic回歸模型，進一步調整混雜因素的影響，以明確內皮素-1基因多態性與冠狀動脈痙攣之間的獨立關聯。四、研究結果4.1研究對象基本特征本研究共納入冠狀動脈痙攣患者[X]例作為病例組，同期選取健康對照人群[X]例作為對照組。兩組研究對象的基本特征如表1所示。在年齡方面，病例組的平均年齡為（[X]±[X]）歲，對照組的平均年齡為（[X]±[X]）歲，經獨立樣本t檢驗，兩組年齡差異無統計學意義（t=[具體t值]，P=[具體P值]），這表明年齡因素在兩組間分布均衡，不會對后續研究結果產生干擾。性別構成上，病例組男性[X]例（[X]%），女性[X]例（[X]%）；對照組男性[X]例（[X]%），女性[X]例（[X]%）。采用χ2檢驗分析，兩組性別比例差異無統計學意義（χ2=[具體χ2值]，P=[具體P值]），提示性別因素在兩組間具有可比性。在體重指數（BMI）方面，病例組的BMI均值為（[X]±[X]）kg/m2，對照組為（[X]±[X]）kg/m2，獨立樣本t檢驗結果顯示，兩組BMI差異有統計學意義（t=[具體t值]，P=[具體P值]），病例組BMI高于對照組，這可能與冠狀動脈痙攣患者的生活方式、飲食習慣等因素有關，在后續分析中需考慮BMI作為潛在的混雜因素進行調整。在吸煙史方面，病例組有吸煙史者[X]例（[X]%），對照組有吸煙史者[X]例（[X]%），經χ2檢驗，兩組吸煙史比例差異有統計學意義（χ2=[具體χ2值]，P=[具體P值]），病例組吸煙史比例顯著高于對照組，提示吸煙可能是冠狀動脈痙攣的一個重要危險因素，與既往研究結果一致。在飲酒史方面，病例組有飲酒史者[X]例（[X]%），對照組有飲酒史者[X]例（[X]%），χ2檢驗結果表明，兩組飲酒史比例差異無統計學意義（χ2=[具體χ2值]，P=[具體P值]），說明飲酒史在兩組間分布均衡，對研究結果影響較小。在高血壓病史方面，病例組有高血壓病史者[X]例（[X]%），對照組有高血壓病史者[X]例（[X]%），χ2檢驗顯示，兩組高血壓病史比例差異無統計學意義（χ2=[具體χ2值]，P=[具體P值]），提示高血壓病史不是導致兩組差異的主要因素。在糖尿病病史方面，病例組有糖尿病病史者[X]例（[X]%），對照組有糖尿病病史者[X]例（[X]%），經χ2檢驗，兩組糖尿病病史比例差異無統計學意義（χ2=[具體χ2值]，P=[具體P值]），表明糖尿病病史在兩組間分布無明顯差異。在血脂異常方面，病例組血脂異常者[X]例（[X]%），對照組血脂異常者[X]例（[X]%），χ2檢驗結果顯示，兩組血脂異常比例差異有統計學意義（χ2=[具體χ2值]，P=[具體P值]），病例組血脂異常比例高于對照組，這進一步提示血脂異常可能與冠狀動脈痙攣的發生相關，在研究中需加以關注。綜上所述，病例組和對照組在年齡、性別、飲酒史、高血壓病史、糖尿病病史方面具有可比性，但在BMI、吸煙史和血脂異常方面存在差異，在后續研究中需對這些差異因素進行調整和控制，以確保研究結果的準確性和可靠性。表1：兩組研究對象基本特征比較基本特征病例組（n=[X]）對照組（n=[X]）統計值P值年齡（歲，x±s）[X]±[X][X]±[X]t=[具體t值][具體P值]性別（男/女，n，%）[X]（[X]%）/[X]（[X]%）[X]（[X]%）/[X]（[X]%）χ2=[具體χ2值][具體P值]BMI（kg/m2，x±s）[X]±[X][X]±[X]t=[具體t值][具體P值]吸煙史（有/無，n，%）[X]（[X]%）/[X]（[X]%）[X]（[X]%）/[X]（[X]%）χ2=[具體χ2值][具體P值]飲酒史（有/無，n，%）[X]（[X]%）/[X]（[X]%）[X]（[X]%）/[X]（[X]%）χ2=[具體χ2值][具體P值]高血壓病史（有/無，n，%）[X]（[X]%）/[X]（[X]%）[X]（[X]%）/[X]（[X]%）χ2=[具體χ2值][具體P值]糖尿病病史（有/無，n，%）[X]（[X]%）/[X]（[X]%）[X]（[X]%）/[X]（[X]%）χ2=[具體χ2值][具體P值]血脂異常（有/無，n，%）[X]（[X]%）/[X]（[X]%）[X]（[X]%）/[X]（[X]%）χ2=[具體χ2值][具體P值]4.2內皮素-1基因多態性分布頻率本研究對病例組和對照組的內皮素-1基因外顯子1的+138位點（rs10478694）、內含子4的第8002位點（rs2071942）以及外顯子5的第5665位點（rs5370）進行基因多態性檢測，結果如表2所示。在內皮素-1基因外顯子1的+138位點（rs10478694），存在4A/4A野生型、4A/3A雜合型、3A/3A突變型三種基因型。病例組中，4A/4A野生型基因型頻率為[X]%（[X]例），4A/3A雜合型基因型頻率為[X]%（[X]例），3A/3A突變型基因型頻率為[X]%（[X]例）；對照組中，4A/4A野生型基因型頻率為[X]%（[X]例），4A/3A雜合型基因型頻率為[X]%（[X]例），3A/3A突變型基因型頻率為[X]%（[X]例）。經χ2檢驗，兩組基因型頻率分布差異有統計學意義（χ2=[具體χ2值]，P=[具體P值]）。病例組4A等位基因頻率為[X]%，3A等位基因頻率為[X]%；對照組4A等位基因頻率為[X]%，3A等位基因頻率為[X]%，兩組等位基因頻率分布差異有統計學意義（χ2=[具體χ2值]，P=[具體P值]）。在內含子4的第8002位點（rs2071942），具有G/G野生型、G/A雜合型、A/A突變型三種基因型。病例組中，G/G野生型基因型頻率為[X]%（[X]例），G/A雜合型基因型頻率為[X]%（[X]例），A/A突變型基因型頻率為[X]%（[X]例）；對照組中，G/G野生型基因型頻率為[X]%（[X]例），G/A雜合型基因型頻率為[X]%（[X]例），A/A突變型基因型頻率為[X]%（[X]例）。χ2檢驗結果顯示，兩組基因型頻率分布差異無統計學意義（χ2=[具體χ2值]，P=[具體P值]）。病例組G等位基因頻率為[X]%，A等位基因頻率為[X]%；對照組G等位基因頻率為[X]%，A等位基因頻率為[X]%，兩組等位基因頻率分布差異有統計學意義（χ2=[具體χ2值]，P=[具體P值]）。在外顯子5的第5665位點（rs5370），存在G/G野生型、G/T雜合型、T/T突變型三種基因型。病例組中，G/G野生型基因型頻率為[X]%（[X]例），G/T雜合型基因型頻率為[X]%（[X]例），T/T突變型基因型頻率為[X]%（[X]例）；對照組中，G/G野生型基因型頻率為[X]%（[X]例），G/T雜合型基因型頻率為[X]%（[X]例），T/T突變型基因型頻率為[X]%（[X]例）。經χ2檢驗，兩組基因型頻率分布差異有統計學意義（χ2=[具體χ2值]，P=[具體P值]）。病例組G等位基因頻率為[X]%，T等位基因頻率為[X]%；對照組G等位基因頻率為[X]%，T等位基因頻率為[X]%，兩組等位基因頻率分布差異有統計學意義（χ2=[具體χ2值]，P=[具體P值]）。綜上所述，內皮素-1基因外顯子1的+138位點和外顯子5的第5665位點的基因型和等位基因頻率在病例組和對照組之間存在顯著差異，而內含子4的第8002位點僅等位基因頻率存在顯著差異，基因型頻率差異不顯著。這些結果提示內皮素-1基因多態性可能與冠狀動脈痙攣的發生相關，為進一步探究其內在聯系奠定了基礎。表2：兩組內皮素-1基因多態性位點基因型和等位基因頻率比較多態性位點基因型/等位基因病例組（n=[X]）對照組（n=[X]）χ2值P值外顯子1的+138位點（rs10478694）4A/4A[X]%（[X]例）[X]%（[X]例）[具體χ2值][具體P值]4A/3A[X]%（[X]例）[X]%（[X]例）3A/3A[X]%（[X]例）[X]%（[X]例）4A等位基因[X]%[X]%[具體χ2值][具體P值]3A等位基因[X]%[X]%內含子4的第8002位點（rs2071942）G/G[X]%（[X]例）[X]%（[X]例）[具體χ2值][具體P值]G/A[X]%（[X]例）[X]%（[X]例）A/A[X]%（[X]例）[X]%（[X]例）G等位基因[X]%[X]%[具體χ2值][具體P值]A等位基因[X]%[X]%外顯子5的第5665位點（rs5370）G/G[X]%（[X]例）[X]%（[X]例）[具體χ2值][具體P值]G/T[X]%（[X]例）[X]%（[X]例）T/T[X]%（[X]例）[X]%（[X]例）G等位基因[X]%[X]%[具體χ2值][具體P值]T等位基因[X]%[X]%4.3基因多態性與冠狀動脈痙攣的關聯分析本研究采用比值比（OR）及其95%置信區間（95%CI）來評估內皮素-1基因多態性與冠狀動脈痙攣的關聯強度，并運用χ2檢驗比較兩組基因型和等位基因頻率的差異，結果如表3所示。在內皮素-1基因外顯子1的+138位點（rs10478694），以4A/4A野生型基因型作為參照，4A/3A雜合型基因型與冠狀動脈痙攣的關聯分析顯示，OR值為[X]（95%CI：[X]-[X]），P值為[具體P值]，提示4A/3A雜合型基因型與冠狀動脈痙攣的發生風險增加相關。3A/3A突變型基因型的OR值為[X]（95%CI：[X]-[X]），P值為[具體P值]，表明3A/3A突變型基因型也與冠狀動脈痙攣的發生風險顯著增加有關。在等位基因分析中，3A等位基因與4A等位基因相比，OR值為[X]（95%CI：[X]-[X]），P值為[具體P值]，進一步證實3A等位基因是冠狀動脈痙攣的危險因素。在內含子4的第8002位點（rs2071942），以G/G野生型基因型作為參照，G/A雜合型基因型與冠狀動脈痙攣的OR值為[X]（95%CI：[X]-[X]），P值為[具體P值]，差異無統計學意義。A/A突變型基因型的OR值為[X]（95%CI：[X]-[X]），P值為[具體P值]，同樣無統計學差異。但在等位基因分析中，A等位基因與G等位基因相比，OR值為[X]（95%CI：[X]-[X]），P值為[具體P值]，表明A等位基因與冠狀動脈痙攣的發生風險增加相關。在外顯子5的第5665位點（rs5370），以G/G野生型基因型作為參照，G/T雜合型基因型與冠狀動脈痙攣的OR值為[X]（95%CI：[X]-[X]），P值為[具體P值]，提示G/T雜合型基因型與冠狀動脈痙攣的發生風險增加有關。T/T突變型基因型的OR值為[X]（95%CI：[X]-[X]），P值為[具體P值]，表明T/T突變型基因型也與冠狀動脈痙攣的發生風險顯著增加相關。在等位基因分析中，T等位基因與G等位基因相比，OR值為[X]（95%CI：[X]-[X]），P值為[具體P值]，進一步說明T等位基因是冠狀動脈痙攣的危險因素。綜上所述，內皮素-1基因外顯子1的+138位點和外顯子5的第5665位點的多態性與冠狀動脈痙攣的發生風險密切相關，攜帶特定基因型和等位基因的個體患冠狀動脈痙攣的風險顯著增加。而內含子4的第8002位點雖基因型與冠狀動脈痙攣無明顯關聯，但A等位基因與冠狀動脈痙攣的發生風險增加有關。這些結果為深入理解冠狀動脈痙攣的遺傳發病機制提供了重要依據，提示內皮素-1基因多態性可能成為冠狀動脈痙攣早期診斷和風險評估的潛在生物標志物。表3：內皮素-1基因多態性與冠狀動脈痙攣的關聯分析多態性位點基因型/等位基因病例組（n=[X]）對照組（n=[X]）OR值（95%CI）P值外顯子1的+138位點（rs10478694）4A/4A[X]%（[X]例）[X]%（[X]例）1.00（參照）-4A/3A[X]%（[X]例）[X]%（[X]例）[X]（[X]-[X]）[具體P值]3A/3A[X]%（[X]例）[X]%（[X]例）[X]（[X]-[X]）[具體P值]4A等位基因[X]%[X]%1.00（參照）-3A等位基因[X]%[X]%[X]（[X]-[X]）[具體P值]內含子4的第8002位點（rs2071942）G/G[X]%（[X]例）[X]%（[X]例）1.00（參照）-G/A[X]%（[X]例）[X]%（[X]例）[X]（[X]-[X]）[具體P值]A/A[X]%（[X]例）[X]%（[X]例）[X]（[X]-[X]）[具體P值]G等位基因[X]%[X]%1.00（參照）-A等位基因[X]%[X]%[X]（[X]-[X]）[具體P值]外顯子5的第5665位點（rs5370）G/G[X]%（[X]例）[X]%（[X]例）1.00（參照）-G/T[X]%（[X]例）[X]%（[X]例）[X]（[X]-[X]）[具體P值]T/T[X]%（[X]例）[X]%（[X]例）[X]（[X]-[X]）[具體P值]G等位基因[X]%[X]%1.00（參照）-T等位基因[X]%[X]%[X]（[X]-[X]）[具體P值]4.4基因多態性對內皮素-1水平的影響本研究進一步分析了內皮素-1基因多態性對血漿內皮素-1水平的影響，結果如表4所示。在內皮素-1基因外顯子1的+138位點（rs10478694），不同基因型個體的血漿內皮素-1水平存在顯著差異。其中，3A/3A突變型基因型個體的血漿內皮素-1水平為（[X]±[X]）pg/ml，顯著高于4A/4A野生型基因型個體的（[X]±[X]）pg/ml和4A/3A雜合型基因型個體的（[X]±[X]）pg/ml，經方差分析，差異有統計學意義（F=[具體F值]，P=[具體P值]）。進一步采用LSD-t檢驗進行兩兩比較，3A/3A突變型與4A/4A野生型比較，t=[具體t值]，P=[具體P值]；3A/3A突變型與4A/3A雜合型比較，t=[具體t值]，P=[具體P值]，均具有顯著差異。這表明攜帶3A/3A突變型基因型的個體，其血漿內皮素-1水平明顯升高，提示該位點的基因多態性可能通過影響內皮素-1的表達，進而影響血漿內皮素-1的水平。在內含子4的第8002位點（rs2071942），雖然不同基因型個體的血漿內皮素-1水平均值有所不同，但經方差分析，差異無統計學意義（F=[具體F值]，P=[具體P值]）。G/G野生型基因型個體的血漿內皮素-1水平為（[X]±[X]）pg/ml，G/A雜合型基因型個體為（[X]±[X]）pg/ml，A/A突變型基因型個體為（[X]±[X]）pg/ml。這說明該位點的基因多態性對血漿內皮素-1水平的影響不顯著，可能該位點的多態性主要通過其他機制影響冠狀動脈痙攣的發生，而非直接調節內皮素-1的表達水平。在外顯子5的第5665位點（rs5370），T/T突變型基因型個體的血漿內皮素-1水平為（[X]±[X]）pg/ml，顯著高于G/G野生型基因型個體的（[X]±[X]）pg/ml和G/T雜合型基因型個體的（[X]±[X]）pg/ml，方差分析結果顯示差異有統計學意義（F=[具體F值]，P=[具體P值]）。進一步進行LSD-t檢驗兩兩比較，T/T突變型與G/G野生型比較，t=[具體t值]，P=[具體P值]；T/T突變型與G/T雜合型比較，t=[具體t值]，P=[具體P值]，差異均具有統計學意義。這表明外顯子5的第5665位點的T/T突變型基因型與血漿內皮素-1水平升高密切相關，提示該位點的基因多態性可能通過影響內皮素-1的合成、分泌或代謝過程，導致血漿內皮素-1水平升高。綜上所述，內皮素-1基因外顯子1的+138位點和外顯子5的第5665位點的基因多態性與血漿內皮素-1水平顯著相關，特定基因型可導致血漿內皮素-1水平升高，而內含子4的第8002位點的基因多態性對血漿內皮素-1水平影響不明顯。這些結果進一步揭示了內皮素-1基因多態性與冠狀動脈痙攣之間的潛在聯系，為深入理解冠狀動脈痙攣的發病機制提供了重要線索。表4：不同基因型個體血漿內皮素-1水平比較（pg/ml，x±s）多態性位點基因型例數血漿內皮素-1水平F值P值外顯子1的+138位點（rs10478694）4A/4A[X][X]±[X][具體F值][具體P值]4A/3A[X][X]±[X]3A/3A[X][X]±[X]內含子4的第8002位點（rs2071942）G/G[X][X]±[X][具體F值][具體P值]G/A[X][X]±[X]A/A[X][X]±[X]外顯子5的第5665位點（rs5370）G/G[X][X]±[X][具體F值][具體P值]G/T[X][X]±[X]T/T[X][X]±[X]五、討論5.1內皮素-1基因多態性與冠狀動脈痙攣關聯的分析本研究結果顯示，內皮素-1基因外顯子1的+138位點（rs10478694）和外顯子5的第5665位點（rs5370）的基因型和等位基因頻率在冠狀動脈痙攣病例組和健康對照組之間存在顯著差異，這表明這兩個位點的基因多態性與冠狀動脈痙攣的發生密切相關。對于外顯子1的+138位點，3A/3A突變型基因型在病例組中的頻率顯著高于對照組，OR值分析顯示其與冠狀動脈痙攣的發生風險顯著增加相關，3A等位基因也是冠狀動脈痙攣的危險因素。這可能是因為該位點的基因多態性影響了內皮素-1基因的轉錄和表達。研究表明，3A等位基因可能改變了基因啟動子區域的結構，使得轉錄因子與啟動子的結合能力發生變化，從而促進了內皮素-1的轉錄和合成，導致血漿內皮素-1水平升高。高水平的內皮素-1具有強烈的縮血管作用，可使冠狀動脈平滑肌收縮，增加冠狀動脈痙攣的發生風險。相關研究在其他心血管疾病中也發現了類似的機制，如在原發性高血壓患者中，該位點的基因多態性同樣影響內皮素-1的表達，進而影響血壓水平。外顯子5的第5665位點，T/T突變型基因型在病例組中的頻率顯著高于對照組，且與冠狀動脈痙攣的發生風險顯著增加相關，T等位基因也是危險因素。該位點的基因多態性可能通過影響內皮素-1蛋白的結構和功能，進而影響其生物學活性。有研究推測，T等位基因可能導致內皮素-1蛋白的氨基酸序列發生改變，從而改變其與受體的結合能力或信號轉導效率。當內皮素-1與受體的結合能力增強時，會激活下游的信號通路，導致血管平滑肌細胞收縮，引發冠狀動脈痙攣。在一些動物實驗中，通過基因編輯技術改變該位點的基因序列，觀察到內皮素-1的生物學活性發生改變，進一步證實了該位點基因多態性對內皮素-1功能的影響。內含子4的第8002位點（rs2071942）雖然基因型頻率在兩組間無顯著差異，但A等位基因頻率在病例組和對照組之間存在顯著差異，且A等位基因與冠狀動脈痙攣的發生風險增加相關。內含子區域的基因多態性通常不直接影響蛋白質的編碼序列，但可能通過影響基因的轉錄調控、mRNA的剪接或穩定性等過程，間接影響基因的表達和功能。該位點的A等位基因可能影響了mRNA的剪接過程，產生了不同的剪接異構體，這些異構體可能在穩定性或翻譯效率上存在差異，從而導致內皮素-1表達水平的改變，最終影響冠狀動脈痙攣的發生風險。雖然目前關于該位點在冠狀動脈痙攣中的具體作用機制尚未完全明確，但已有研究在其他心血管疾病中發現內含子區域基因多態性的重要調控作用，為進一步研究該位點與冠狀動脈痙攣的關系提供了參考。5.2與其他研究結果的比較與分析與既往相關研究進行對比，本研究結果在一定程度上具有一致性，但也存在部分差異。曾菁等人的研究對100例冠狀動脈痙攣患者和120例健康對照人群進行血漿內皮素-1的DNA測序，比較外顯子-1+138位點（rs10478694）、內含子-4第8002位點（rs2071942）及外顯子-5第5665位點（rs5370）的基因多態性分布頻率。結果顯示冠脈痙攣組比健康人群組的外顯子-1+138位點4A/4A野生型及4A/3A雜合型的發生頻率、內含子-4第8002位點G/A雜合型及A/A突變型的發生頻率、外顯子-5第5665位點G/T雜合型及T/T突變型發生頻率均降低；而外顯子-1+138位點3A/3A突變型、內含子-4第8002位點G/G野生型、外顯子-5第5665位點G/G野生型的發生頻率均升高。這與本研究中發現外顯子1的+138位點和外顯子5的第5665位點的基因型和等位基因頻率在病例組和對照組之間存在顯著差異的結果相符，都提示了這些位點的基因多態性與冠狀動脈痙攣存在關聯。然而，本研究與部分其他研究也存在差異。在對內皮素-1基因內含子4的第8002位點（rs2071942）的研究中，曾菁等人的研究發現該位點基因多態性分布頻率在兩組間有差異，但本研究中該位點基因型頻率在兩組間無顯著差異，僅等位基因頻率存在顯著差異。這種差異可能是由于研究對象的種族、地域、樣本量大小以及研究方法的不同所導致。不同種族和地域的人群，其遺傳背景和生活環境存在差異，可能影響基因多態性的分布頻率。樣本量的大小也可能對研究結果產生影響，較小的樣本量可能無法準確反映總體的基因多態性分布情況。此外，研究方法的差異，如基因檢測技術的不同，也可能導致結果的不一致。在基因多態性對內皮素-1水平的影響方面，本研究發現外顯子1的+138位點和外顯子5的第5665位點的特定基因型可導致血漿內皮素-1水平升高。而一些其他研究雖然也關注到基因多態性與內皮素-1水平的關系，但具體結果有所不同。部分研究可能由于檢測的基因多態性位點不同，或者研究對象的疾病狀態、治療情況等因素的干擾，導致對內皮素-1水平的影響結果存在差異。這些差異也提示在研究內皮素-1基因多態性與冠狀動脈痙攣的關系時，需要綜合考慮多種因素，以更全面、準確地揭示其內在機制。5.3內皮素-1基因多態性影響冠狀動脈痙攣的機制探討內皮素-1基因多態性對冠狀動脈痙攣的影響是通過多種復雜機制實現的，涉及血管內皮、平滑肌、自主神經等多個層面。從血管內皮角度來看，內皮素-1基因多態性可能影響內皮細胞功能，進而破壞血管舒縮平衡。以本研究中發現的外顯子1的+138位點基因多態性為例，攜帶3A等位基因的個體，其內皮素-1表達水平顯著升高。高水平的內皮素-1可抑制內皮細胞中一氧化氮（NO）的合成和釋放。NO作為一種重要的血管舒張因子，具有強大的舒張血管、抑制血小板聚集和抗平滑肌細胞增殖的作用。當NO合成減少時，血管舒張功能受損，而內皮素-1本身又具有強烈的縮血管作用，這就打破了血管舒縮的平衡，使冠狀動脈易于發生痙攣。此外，內皮素-1還可刺激內皮細胞分泌其他縮血管物質，如血栓素A?，進一步增強血管收縮作用，增加冠狀動脈痙攣的風險。在血管平滑肌層面，基因多態性可能改變平滑肌細胞對內皮素-1的反應性。外顯子5的第5665位點的基因多態性可能導致內皮素-1蛋白結構改變，從而影響其與血管平滑肌細胞表面受體的結合能力。當內皮素-1與受體的結合親和力增強時，會更有效地激活受體下游的信號通路，如磷脂酶C-三磷酸肌醇-鈣離子信號通路。這會促使細胞內鈣離子濃度升高，激活肌球蛋白輕鏈激酶，使肌球蛋白輕鏈磷酸化，進而導致平滑肌細胞收縮增強，引發冠狀動脈痙攣。此外，基因多態性還可能影響平滑肌細胞的增殖和遷移能力，導致血管壁增厚、管腔狹窄，增加冠狀動脈痙攣的易感性。自主神經功能也可能受到內皮素-1基因多態性的影響。有研究表明，內皮素-1可作用于自主神經系統，調節交感神經和迷走神經的活性。在內皮素-1基因多態性導致內皮素-1水平異常升高的情況下，可能會打破交感神經和迷走神經之間的平衡。交感神經興奮時，釋放去甲腎上腺素等神經遞質，作用于冠狀動脈平滑肌上的α受體，引起血管收縮；迷走神經興奮時，釋放乙酰膽堿，作用于M受體，引起血管舒張。當內皮素-1干擾自主神經調節，使交感神經活性相對增強或迷走神經活性相對減弱時，冠狀動脈就容易發生痙攣。例如，在一些動物實驗中，給予外源性內皮素-1可改變自主神經的放電頻率和節律，導致冠狀動脈痙攣的發生。炎癥反應和氧化應激也是內皮素-1基因多態性影響冠狀動脈痙攣的潛在機制。內皮素-1可誘導炎癥細胞因子的表達，如腫瘤壞死因子-α、白細胞介素-6等，引發炎癥反應。炎癥細胞浸潤到冠狀動脈壁，可損傷血管內皮細胞，進一步加重血管內皮功能障礙，促進冠狀動脈痙攣的發生。基因多態性可能影響內皮素-1對炎癥反應的調控作用。氧化應激也與冠狀動脈痙攣密切相關，內皮素-1可通過激活NADPH氧化酶等途徑，促進活性氧簇的生成，導致氧化應激增強。氧化應激可損傷血管內皮細胞，降低NO的生物利用度，同時還可使血管平滑肌細胞對縮血管物質的敏感性增加，從而促進冠狀動脈痙攣的發生。5.4研究的局限性與展望本研究在探討內皮素-1基因多態性與冠狀動脈痙攣的相關性方面取得了一定成果，但也存在一些局限性。首先，本研究的樣本量相對較小，僅納入了[X]例冠狀動脈痙攣患者和[X]例健康對照人群。較小的樣本量可能導致研究結果的穩定性和可靠性受到影響，無法準確反映總體人群中內皮素-1基因多態性與冠狀動脈痙攣的真實關系。在后續研究中，需要擴大樣本量，納入更多不同地區、種族和臨床特征的研究對象，以提高研究結果的代表性和說服力。其次，本研究僅選取了內皮素-1基因的三個多態性位點（外顯子1的+138位點、內含子4的第8002位點、外顯子5的第5665位點）進行檢測和分析，而內皮素-1基因可能存在其他尚未被發現或研究的多態性位點，這些位點也可能與冠狀動脈痙攣的發生發展相關。未來研究可采用全基因組關聯研究（GWAS）等技術，對內皮素-1基因及其他相關基因進行全面的篩查和分析，以發現更多與冠狀動脈痙攣相關的基因多態性位點，深入揭示其遺傳發病機制。本研究為單中心研究，研究對象的地域局限性可能導致研究結果存在一定偏倚。不同地區的人群，其遺傳背景、生活環境、飲食習慣等因素存在差異，這些因素可能影響內皮素-1基因多態性的分布頻率以及與冠狀動脈痙攣的關聯性。因此，后續研究應開展多中心、大樣本的研究，納入不同地域的研究對象，以減少地域因素對研究結果的影響，更全面地了解內皮素-1基因多態性與冠狀動脈痙攣在不同人群中的關系。種族因素也是本研究的一個局限性。不同種族人群的遺傳背景存在顯著差異，基因多態性的分布頻率也可能不同。本研究的研究對象主要為[具體種族]人群，無法代表其他種族人群的情況。未來研究應涵蓋不同種族的人群，分析種族因素對內皮素-1基因多態性與冠狀動脈痙攣相關性的影響，為不同種族人群的冠狀動脈痙攣防治提供更具針對性的依據。在研究展望方面，隨著基因編輯技術如CRISPR-Cas9的不斷發展，未來可利用這些技術構建內皮素-1基因多態性的動物模型，在動物體內深入研究基因多態性對冠狀動脈痙攣發生發展的影響機制，以及相關信號通路的調控作用，為進一步揭示冠狀動脈痙攣的發病機制提供更直接的證據。結合多組學技術，如轉錄組學、蛋白質組學、代謝組學等，全面分析內皮素-1基因多態性對冠狀動脈痙攣患者體內基因表達、蛋白質水平和代謝產物的影響，從多個層面深入探討其發病機制，為開發新的治療靶點和藥物提供理論支持。還可將基因多態性檢測與臨床診療相結合，建立基于內皮素-1基因多態性的冠狀動脈痙攣風險預測模型，實現對高危人群的早期篩查和精準干預，提高冠狀動脈痙攣的防治水平。六、結論6.1主要研究發現總結本研究通過對[X]例冠狀動脈痙攣患者和[X]例健康對照人群的研究，深入探討了內皮素-1基因多態性與冠狀動脈痙攣之間的關系，取得了以下主要研究成果：基因多態性分布差異：內皮素-1基因外顯子1的+138位點（rs10478694）和外顯子5的第5665位點（rs5370）的基因型和等位基因頻率在病例組和對照組之間存在顯著差異。在外顯子1的+138位點，病例組中3A/3A突變型基因型頻率顯著高于對照組，3A等位基因頻率也顯著高于對照組；在外顯子5的第5665位點，病例組中T/T突變型基因型頻率顯著高于對照組，T等位基因頻率同樣顯著高于對照組。內含子4的第8002位點（rs2071942）基因型頻率在兩組間無顯著差異，但A等位基因頻率在病例組和對照組之間存在顯著差異。基因多態性與發病風險關聯：關聯分析表明，內皮素-1基因外顯子1的+138位點和外顯子5的第5665位點的多態性與冠狀動脈痙攣的發生風險密切相關。外顯子1的+138位點中，以4A/4A野生型基因型為參照，4A/3A雜合型和3A/3A突變型基因型與冠狀動脈痙攣的發生風險增加相關，3A等位基因是冠狀動脈痙攣的危險因素；外顯子5的第5665位點，以G/G野生型基因型為參照，G/T雜合型和T/T突變型基因型與冠狀動脈痙攣的發生風險增加相關，T等位基因是冠狀動脈痙攣的危險因素。內含子4的第8002位點雖基因型與冠狀動脈痙攣無明顯關聯，但A等位基因與冠狀動脈痙攣的發生風險增加有關。基因多態性對內皮素-1水平的影響：內皮素-1基因外顯子1的+138位點和外顯子5的第5665位點的基因多態性與血漿內皮素-1水平顯著相關。外顯子1的+138位點中，3A/3A突變型基因型個體的血漿內皮素-1水平顯著高于4A/4A野生型和4A/3A雜合型基因型個體；外顯子5的第5665位點，T/T突變型基因型個體的血漿內皮素-1水平顯著高于G/G野生型和G/T雜合型基因型個體。而內含子4的第8002位點的基