醫學免疫學實驗免疫標記技術免疫標記技術

概念：用熒光素、酶、同位素等標記抗體或抗原用以測定相應抗原或抗體的技術稱為免疫標記技術。

特點：敏感、特異、快速，

定性、定量、定位。★免疫印跡技術(westernblot)★斑點金技術★放射免疫技術★酶免疫技術（ELISA）★免疫熒光技術常用免疫標記技術：直接免疫熒光熒光素直接標記抗體,檢測抗原。AgYFluorochromeLabeledAbTissueSection常用的熒光素主要有：異硫氰酸熒光素(FITC)：黃綠色藻紅蛋白(PE)：桔紅色羅丹明（RB200)：紅色免疫熒光技術：直接免疫熒光，間接免疫熒光間接免疫熒光,一抗與標本中抗原結合，再用熒光素標記的二抗進行檢測。AgYYFluorochromeLabeledAnti-IgTissueSectionUnlabeledAb高效、更靈敏2.經濟、通用性強一抗：二抗：以兔源一抗為例

兔源一抗

木瓜/胃蛋白酶

抗體Fc段（為抗原）

人蛋白：1，2，3

……兔/鼠：

抗體1，2，3

………羊（驢）（二抗）免疫動物產生抗體多抗/單抗兔源/鼠源抗人抗原種特異性：一個羊源二抗可識別所有兔源一抗，即一個二抗分子可識別一種動物源的所有一抗。

羊抗兔/鼠；驢抗兔/鼠免疫羊產生抗體恒定區可變區人工制備抗體的類型

多克隆抗體

抗原免疫動物后得到的動物血清（抗血清），含有針對不同抗原決定簇的多種抗體分子。Ag6抗原決定簇單克隆抗體（mAb)

K?hler和Milstein1975年建立的技術，通過雜交瘤技術獲得的針對單一抗原決定簇的高特異性抗體。78抗原加工提呈，抗原肽免疫熒光技術抗C3二抗補體結合位點見前所述Fluorochrome藻紅蛋白(PE)：桔紅色定性、定量、定位。（工業化生產）已知抗原：乙肝表面抗原(HBsAg)，加入酶結合物1滴（空白孔不加），混勻，37C，20-30min雙抗體夾心法

SandwichELISATMB/OPD+H2O2概念：用熒光素、酶、同位素等標記抗體或抗原酶聯免疫吸附試驗

Enzyme-LinkedImmunosorbentAssays(ELISA)加酶結合物(酶結合二抗)顯色:每孔加顯色液A、B各1滴，混勻，封板，37C，15min免疫熒光技術：直接免疫熒光，間接免疫熒光概念：用熒光素、酶、同位素等標記抗體或抗原第5孔，待檢血清2，加待檢血清1滴酶直接標記一抗異硫氰酸熒光素(FITC)：黃綠色酶聯免疫吸附試驗

Enzyme-LinkedImmunosorbentAssays(ELISA)藻紅蛋白(PE)：桔紅色定位：對某蛋白質在細胞的定位、定量（細胞質中表達）熒光染料共定位：對某二個蛋白質在細胞內的定位、定量免疫熒光可“定位”、“定性”，借助圖像軟件可進行模擬“定量”分析；酶標記技術免疫組織化學：“定位”“定性”、“模擬定量”；免疫印跡（Westernblotting）：“定性”、“模擬定量”；酶聯免疫吸附試驗（ELISA）：“定量”辣根過氧化物酶堿性磷酸酶(OPD)鄰苯二胺(OPD)四甲基聯苯胺(TMB)+H2O2有色物質直接法

directELISA檢測抗原：

酶直接標記一抗辣根過氧化物酶(HRP)TMB/OPD+H2O2有色物質抗原一抗鄰苯二胺(OPD)四甲基聯苯胺(TMB)酶聯免疫吸附試驗

Enzyme-LinkedImmunosorbentAssays(ELISA)雙抗體夾心法

SandwichELISA檢測抗原：有兩個一抗。固相載體：聚苯乙烯微量反應板辣根過氧化物酶(HRP)間接法

indirectELISA病人血清固相載體：聚苯乙烯微量反應板（工業化生產）已知抗原：乙肝表面抗原(HBsAg)，二抗：

抗人IgM或IgGFc段抗體如：檢測乙肝表面抗體(HBsAb)①②加病人血清③辣根過氧化物酶(HRP)包被洗滌洗滌(可省)洗滌(不可省)有色物質二抗過量時，加入病人血清后，要不要洗滌？鄰苯二胺(OPD)四甲基聯苯胺(TMB)TMB/OPD+H2O2預包被板加入酶結合物1滴（空白孔不加），混勻，37C，20-30min直接法

directELISA第1孔，空白對照，加洗滌液1滴直接法

directELISA（工業化生產）已知抗原：乙肝表面抗原(HBsAg)，（工業化生產）已知抗原：乙肝表面抗原(HBsAg)，人蛋白：1，2，3……木瓜/胃蛋白酶異硫氰酸熒光素(FITC)：黃綠色抗原免疫動物后得到的動物血清（抗血清），含有針對不同抗原決定簇的多種抗體分子。異硫氰酸熒光素(FITC)：黃綠色辣根過氧化物酶(HRP)四甲基聯苯胺(TMB)K?hler和Milstein1975年建立的技術，通過雜交瘤技術獲得的針對單一抗原決定簇的高特異性抗體。加酶結合物(酶結合二抗)特點：敏感、特異、快速，醫學免疫學實驗免疫標記技術種特異性：一個羊源二抗可識別所有兔源一抗，即一個二抗分子可識別一種動物源的所有一抗。間接ELISA法檢測血清抗-HBsAbTMB/OPD+H2O2TMB/OPD+H2O2抗人IgM或IgGFc段抗體異硫氰酸熒光素(FITC)：黃綠色酶聯免疫吸附試驗（ELISA）：“定量”TMB/OPD+H2O2異硫氰酸熒光素(FITC)：黃綠色第4孔，待檢血清1，加待檢血清1滴加入酶結合物1滴（空白孔不加），混勻，37C，20-30minFluorochromeTMB/OPD+H2O2雙抗體夾心法

SandwichELISA木瓜/胃蛋白酶酶聯免疫吸附試驗

Enzyme-LinkedImmunosorbentAssays(ELISA)TissueSection加入酶結合物1滴（空白孔不加），混勻，37C，20-30min第1孔，空白對照，加洗滌液1滴直接法

directELISA洗板:棄去孔內液體，注滿洗滌液，靜置5sec甩干，重復3次。空白陰性陽性待測1待測2間接ELISA法檢測血清抗-HBsAb

1.加血清及對照(一抗)

第1孔，空白對照，加洗滌液1滴 第2孔，陰性對照，加陰性對照血清1滴第3孔，陽性對照，加陽性對照血清1滴第4孔，待檢血清1，加待檢血清1滴

第5孔，待檢血清2，加待檢血清1滴

(不洗，因為二抗過量)2.加酶結合物(酶結合二抗)加入酶結合物1滴（空白孔不加），混勻，37C，2