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文檔簡介
醫(yī)學(xué)免疫學(xué)實(shí)驗(yàn)免疫標(biāo)記技術(shù)免疫標(biāo)記技術(shù)
概念:用熒光素、酶、同位素等標(biāo)記抗體或抗原用以測定相應(yīng)抗原或抗體的技術(shù)稱為免疫標(biāo)記技術(shù)。
特點(diǎn):敏感、特異、快速,
定性、定量、定位。★免疫印跡技術(shù)(westernblot)★斑點(diǎn)金技術(shù)★放射免疫技術(shù)★酶免疫技術(shù)(ELISA)★免疫熒光技術(shù)常用免疫標(biāo)記技術(shù):直接免疫熒光熒光素直接標(biāo)記抗體,檢測抗原。AgYFluorochromeLabeledAbTissueSection常用的熒光素主要有:異硫氰酸熒光素(FITC):黃綠色藻紅蛋白(PE):桔紅色羅丹明(RB200):紅色免疫熒光技術(shù):直接免疫熒光,間接免疫熒光間接免疫熒光,一抗與標(biāo)本中抗原結(jié)合,再用熒光素標(biāo)記的二抗進(jìn)行檢測。AgYYFluorochromeLabeledAnti-IgTissueSectionUnlabeledAb高效、更靈敏2.經(jīng)濟(jì)、通用性強(qiáng)一抗:二抗:以兔源一抗為例
兔源一抗
木瓜/胃蛋白酶
抗體Fc段(為抗原)
人蛋白:1,2,3
……兔/鼠:
抗體1,2,3
………羊(驢)(二抗)免疫動物產(chǎn)生抗體多抗/單抗兔源/鼠源抗人抗原種特異性:一個羊源二抗可識別所有兔源一抗,即一個二抗分子可識別一種動物源的所有一抗。
羊抗兔/鼠;驢抗兔/鼠免疫羊產(chǎn)生抗體恒定區(qū)可變區(qū)人工制備抗體的類型
多克隆抗體
抗原免疫動物后得到的動物血清(抗血清),含有針對不同抗原決定簇的多種抗體分子。Ag6抗原決定簇單克隆抗體(mAb)
K?hler和Milstein1975年建立的技術(shù),通過雜交瘤技術(shù)獲得的針對單一抗原決定簇的高特異性抗體。78抗原加工提呈,抗原肽免疫熒光技術(shù)抗C3二抗補(bǔ)體結(jié)合位點(diǎn)見前所述Fluorochrome藻紅蛋白(PE):桔紅色定性、定量、定位。(工業(yè)化生產(chǎn))已知抗原:乙肝表面抗原(HBsAg),加入酶結(jié)合物1滴(空白孔不加),混勻,37C,20-30min雙抗體夾心法
SandwichELISATMB/OPD+H2O2概念:用熒光素、酶、同位素等標(biāo)記抗體或抗原酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)
Enzyme-LinkedImmunosorbentAssays(ELISA)加酶結(jié)合物(酶結(jié)合二抗)顯色:每孔加顯色液A、B各1滴,混勻,封板,37C,15min免疫熒光技術(shù):直接免疫熒光,間接免疫熒光概念:用熒光素、酶、同位素等標(biāo)記抗體或抗原第5孔,待檢血清2,加待檢血清1滴酶直接標(biāo)記一抗異硫氰酸熒光素(FITC):黃綠色酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)
Enzyme-LinkedImmunosorbentAssays(ELISA)藻紅蛋白(PE):桔紅色定位:對某蛋白質(zhì)在細(xì)胞的定位、定量(細(xì)胞質(zhì)中表達(dá))熒光染料共定位:對某二個蛋白質(zhì)在細(xì)胞內(nèi)的定位、定量免疫熒光可“定位”、“定性”,借助圖像軟件可進(jìn)行模擬“定量”分析;酶標(biāo)記技術(shù)免疫組織化學(xué):“定位”“定性”、“模擬定量”;免疫印跡(Westernblotting):“定性”、“模擬定量”;酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA):“定量”辣根過氧化物酶堿性磷酸酶(OPD)鄰苯二胺(OPD)四甲基聯(lián)苯胺(TMB)+H2O2有色物質(zhì)直接法
directELISA檢測抗原:
酶直接標(biāo)記一抗辣根過氧化物酶(HRP)TMB/OPD+H2O2有色物質(zhì)抗原一抗鄰苯二胺(OPD)四甲基聯(lián)苯胺(TMB)酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)
Enzyme-LinkedImmunosorbentAssays(ELISA)雙抗體夾心法
SandwichELISA檢測抗原:有兩個一抗。固相載體:聚苯乙烯微量反應(yīng)板辣根過氧化物酶(HRP)間接法
indirectELISA病人血清固相載體:聚苯乙烯微量反應(yīng)板(工業(yè)化生產(chǎn))已知抗原:乙肝表面抗原(HBsAg),二抗:
抗人IgM或IgGFc段抗體如:檢測乙肝表面抗體(HBsAb)①②加病人血清③辣根過氧化物酶(HRP)包被洗滌洗滌(可省)洗滌(不可省)有色物質(zhì)二抗過量時,加入病人血清后,要不要洗滌?鄰苯二胺(OPD)四甲基聯(lián)苯胺(TMB)TMB/OPD+H2O2預(yù)包被板加入酶結(jié)合物1滴(空白孔不加),混勻,37C,20-30min直接法
directELISA第1孔,空白對照,加洗滌液1滴直接法
directELISA(工業(yè)化生產(chǎn))已知抗原:乙肝表面抗原(HBsAg),(工業(yè)化生產(chǎn))已知抗原:乙肝表面抗原(HBsAg),人蛋白:1,2,3……木瓜/胃蛋白酶異硫氰酸熒光素(FITC):黃綠色抗原免疫動物后得到的動物血清(抗血清),含有針對不同抗原決定簇的多種抗體分子。異硫氰酸熒光素(FITC):黃綠色辣根過氧化物酶(HRP)四甲基聯(lián)苯胺(TMB)K?hler和Milstein1975年建立的技術(shù),通過雜交瘤技術(shù)獲得的針對單一抗原決定簇的高特異性抗體。加酶結(jié)合物(酶結(jié)合二抗)特點(diǎn):敏感、特異、快速,醫(yī)學(xué)免疫學(xué)實(shí)驗(yàn)免疫標(biāo)記技術(shù)種特異性:一個羊源二抗可識別所有兔源一抗,即一個二抗分子可識別一種動物源的所有一抗。間接ELISA法檢測血清抗-HBsAbTMB/OPD+H2O2TMB/OPD+H2O2抗人IgM或IgGFc段抗體異硫氰酸熒光素(FITC):黃綠色酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA):“定量”TMB/OPD+H2O2異硫氰酸熒光素(FITC):黃綠色第4孔,待檢血清1,加待檢血清1滴加入酶結(jié)合物1滴(空白孔不加),混勻,37C,20-30minFluorochromeTMB/OPD+H2O2雙抗體夾心法
SandwichELISA木瓜/胃蛋白酶酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)
Enzyme-LinkedImmunosorbentAssays(ELISA)TissueSection加入酶結(jié)合物1滴(空白孔不加),混勻,37C,20-30min第1孔,空白對照,加洗滌液1滴直接法
directELISA洗板:棄去孔內(nèi)液體,注滿洗滌液,靜置5sec甩干,重復(fù)3次。空白陰性陽性待測1待測2間接ELISA法檢測血清抗-HBsAb
1.加血清及對照(一抗)
第1孔,空白對照,加洗滌液1滴 第2孔,陰性對照,加陰性對照血清1滴第3孔,陽性對照,加陽性對照血清1滴第4孔,待檢血清1,加待檢血清1滴
第5孔,待檢血清2,加待檢血清1滴
(不洗,因?yàn)槎惯^量)2.加酶結(jié)合物(酶結(jié)合二抗)加入酶結(jié)合物1滴(空白孔不加),混勻,37C,2
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