醫(yī)學(xué)免疫學(xué)實(shí)驗(yàn)免疫標(biāo)記技術(shù)免疫標(biāo)記技術(shù)

概念：用熒光素、酶、同位素等標(biāo)記抗體或抗原用以測定相應(yīng)抗原或抗體的技術(shù)稱為免疫標(biāo)記技術(shù)。

特點(diǎn)：敏感、特異、快速，

定性、定量、定位。★免疫印跡技術(shù)(westernblot)★斑點(diǎn)金技術(shù)★放射免疫技術(shù)★酶免疫技術(shù)（ELISA）★免疫熒光技術(shù)常用免疫標(biāo)記技術(shù)：直接免疫熒光熒光素直接標(biāo)記抗體,檢測抗原。AgYFluorochromeLabeledAbTissueSection常用的熒光素主要有：異硫氰酸熒光素(FITC)：黃綠色藻紅蛋白(PE)：桔紅色羅丹明（RB200)：紅色免疫熒光技術(shù)：直接免疫熒光，間接免疫熒光間接免疫熒光,一抗與標(biāo)本中抗原結(jié)合，再用熒光素標(biāo)記的二抗進(jìn)行檢測。AgYYFluorochromeLabeledAnti-IgTissueSectionUnlabeledAb高效、更靈敏2.經(jīng)濟(jì)、通用性強(qiáng)一抗：二抗：以兔源一抗為例

兔源一抗

木瓜/胃蛋白酶

抗體Fc段（為抗原）

人蛋白：1，2，3

……兔/鼠：

抗體1，2，3

………羊（驢）（二抗）免疫動物產(chǎn)生抗體多抗/單抗兔源/鼠源抗人抗原種特異性：一個羊源二抗可識別所有兔源一抗，即一個二抗分子可識別一種動物源的所有一抗。

羊抗兔/鼠；驢抗兔/鼠免疫羊產(chǎn)生抗體恒定區(qū)可變區(qū)人工制備抗體的類型

多克隆抗體

抗原免疫動物后得到的動物血清（抗血清），含有針對不同抗原決定簇的多種抗體分子。Ag6抗原決定簇單克隆抗體（mAb)

K?hler和Milstein1975年建立的技術(shù)，通過雜交瘤技術(shù)獲得的針對單一抗原決定簇的高特異性抗體。78抗原加工提呈，抗原肽免疫熒光技術(shù)抗C3二抗補(bǔ)體結(jié)合位點(diǎn)見前所述Fluorochrome藻紅蛋白(PE)：桔紅色定性、定量、定位。（工業(yè)化生產(chǎn)）已知抗原：乙肝表面抗原(HBsAg)，加入酶結(jié)合物1滴（空白孔不加），混勻，37C，20-30min雙抗體夾心法

SandwichELISATMB/OPD+H2O2概念：用熒光素、酶、同位素等標(biāo)記抗體或抗原酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)

Enzyme-LinkedImmunosorbentAssays(ELISA)加酶結(jié)合物(酶結(jié)合二抗)顯色:每孔加顯色液A、B各1滴，混勻，封板，37C，15min免疫熒光技術(shù)：直接免疫熒光，間接免疫熒光概念：用熒光素、酶、同位素等標(biāo)記抗體或抗原第5孔，待檢血清2，加待檢血清1滴酶直接標(biāo)記一抗異硫氰酸熒光素(FITC)：黃綠色酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)

Enzyme-LinkedImmunosorbentAssays(ELISA)藻紅蛋白(PE)：桔紅色定位：對某蛋白質(zhì)在細(xì)胞的定位、定量（細(xì)胞質(zhì)中表達(dá)）熒光染料共定位：對某二個蛋白質(zhì)在細(xì)胞內(nèi)的定位、定量免疫熒光可“定位”、“定性”，借助圖像軟件可進(jìn)行模擬“定量”分析；酶標(biāo)記技術(shù)免疫組織化學(xué)：“定位”“定性”、“模擬定量”；免疫印跡（Westernblotting）：“定性”、“模擬定量”；酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（ELISA）：“定量”辣根過氧化物酶堿性磷酸酶(OPD)鄰苯二胺(OPD)四甲基聯(lián)苯胺(TMB)+H2O2有色物質(zhì)直接法

directELISA檢測抗原：

酶直接標(biāo)記一抗辣根過氧化物酶(HRP)TMB/OPD+H2O2有色物質(zhì)抗原一抗鄰苯二胺(OPD)四甲基聯(lián)苯胺(TMB)酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)

Enzyme-LinkedImmunosorbentAssays(ELISA)雙抗體夾心法

SandwichELISA檢測抗原：有兩個一抗。固相載體：聚苯乙烯微量反應(yīng)板辣根過氧化物酶(HRP)間接法

indirectELISA病人血清固相載體：聚苯乙烯微量反應(yīng)板（工業(yè)化生產(chǎn)）已知抗原：乙肝表面抗原(HBsAg)，二抗：

抗人IgM或IgGFc段抗體如：檢測乙肝表面抗體(HBsAb)①②加病人血清③辣根過氧化物酶(HRP)包被洗滌洗滌(可省)洗滌(不可省)有色物質(zhì)二抗過量時，加入病人血清后，要不要洗滌？鄰苯二胺(OPD)四甲基聯(lián)苯胺(TMB)TMB/OPD+H2O2預(yù)包被板加入酶結(jié)合物1滴（空白孔不加），混勻，37C，20-30min直接法

directELISA第1孔，空白對照，加洗滌液1滴直接法

directELISA（工業(yè)化生產(chǎn)）已知抗原：乙肝表面抗原(HBsAg)，（工業(yè)化生產(chǎn)）已知抗原：乙肝表面抗原(HBsAg)，人蛋白：1，2，3……木瓜/胃蛋白酶異硫氰酸熒光素(FITC)：黃綠色抗原免疫動物后得到的動物血清（抗血清），含有針對不同抗原決定簇的多種抗體分子。異硫氰酸熒光素(FITC)：黃綠色辣根過氧化物酶(HRP)四甲基聯(lián)苯胺(TMB)K?hler和Milstein1975年建立的技術(shù)，通過雜交瘤技術(shù)獲得的針對單一抗原決定簇的高特異性抗體。加酶結(jié)合物(酶結(jié)合二抗)特點(diǎn)：敏感、特異、快速，醫(yī)學(xué)免疫學(xué)實(shí)驗(yàn)免疫標(biāo)記技術(shù)種特異性：一個羊源二抗可識別所有兔源一抗，即一個二抗分子可識別一種動物源的所有一抗。間接ELISA法檢測血清抗-HBsAbTMB/OPD+H2O2TMB/OPD+H2O2抗人IgM或IgGFc段抗體異硫氰酸熒光素(FITC)：黃綠色酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（ELISA）：“定量”TMB/OPD+H2O2異硫氰酸熒光素(FITC)：黃綠色第4孔，待檢血清1，加待檢血清1滴加入酶結(jié)合物1滴（空白孔不加），混勻，37C，20-30minFluorochromeTMB/OPD+H2O2雙抗體夾心法

SandwichELISA木瓜/胃蛋白酶酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)

Enzyme-LinkedImmunosorbentAssays(ELISA)TissueSection加入酶結(jié)合物1滴（空白孔不加），混勻，37C，20-30min第1孔，空白對照，加洗滌液1滴直接法

directELISA洗板:棄去孔內(nèi)液體，注滿洗滌液，靜置5sec甩干，重復(fù)3次。空白陰性陽性待測1待測2間接ELISA法檢測血清抗-HBsAb

1.加血清及對照(一抗)

第1孔，空白對照，加洗滌液1滴 第2孔，陰性對照，加陰性對照血清1滴第3孔，陽性對照，加陽性對照血清1滴第4孔，待檢血清1，加待檢血清1滴

第5孔，待檢血清2，加待檢血清1滴

(不洗，因?yàn)槎惯^量)2.加酶結(jié)合物(酶結(jié)合二抗)加入酶結(jié)合物1滴（空白孔不加），混勻，37C，2