基于三維生物打印技術的肝細胞癌體外微環境模型構建與研究一、引言1.1研究背景與意義肝細胞癌（HepatocellularCarcinoma，HCC）作為全球范圍內嚴重威脅人類健康的重大疾病，一直是醫學研究領域的焦點。據世界衛生組織國際癌癥研究機構（IARC）發布的2020年全球癌癥負擔數據顯示，肝癌新發病例數達90.6萬，死亡病例數約83萬，分別位居全球癌癥發病和死亡的第6位和第3位。在我國，肝癌的形勢更為嚴峻，由于乙肝病毒（HBV）的高感染率等因素，我國肝癌的發病率和死亡率均高于全球平均水平，嚴重影響患者的生命質量和社會經濟發展。HCC具有起病隱匿、惡性程度高、進展迅速、易復發轉移等特點，多數患者確診時已處于中晚期，失去了手術根治的機會，總體5年生存率較低。傳統的治療手段如手術切除、化療、放療等，在中晚期HCC患者中的療效有限，且常伴有嚴重的不良反應，給患者帶來極大的痛苦。因此，深入探究HCC的發病機制、開發新的治療策略和篩選有效的治療藥物，成為提高HCC患者生存率和改善預后的關鍵。在HCC的研究中，構建能夠真實模擬體內腫瘤微環境的模型至關重要。腫瘤微環境（TumorMicroenvironment，TME）是一個復雜的生態系統，由腫瘤細胞、基質細胞（如肝星狀細胞、成纖維細胞等）、免疫細胞、細胞外基質以及各種細胞因子和信號分子等組成。TME與腫瘤細胞之間存在著密切的相互作用，對腫瘤的發生、發展、侵襲、轉移以及對治療的反應等過程均產生著深遠的影響。例如，肝星狀細胞被激活后可分泌大量細胞外基質，導致肝臟纖維化，為腫瘤細胞的生長和轉移提供了有利的微環境；腫瘤相關巨噬細胞可通過分泌細胞因子調節腫瘤免疫微環境，促進腫瘤細胞的免疫逃逸。因此，構建一個能夠準確反映HCC微環境特征和細胞間相互作用的體外模型，對于深入理解HCC的發病機制、評估藥物療效和開發新的治療方法具有不可或缺的作用。傳統的二維（2D）細胞培養模型雖然具有操作簡單、成本低等優點，但由于其無法模擬體內細胞的三維空間排列和細胞間的復雜相互作用，以及缺乏細胞外基質的支撐，使得細胞在培養過程中逐漸失去其原有的生物學特性，無法真實反映腫瘤在體內的生長和發展情況，在HCC研究中的應用存在較大局限性。動物模型雖然能夠在一定程度上模擬腫瘤的生長和轉移過程，但存在個體差異大、實驗周期長、成本高、難以進行實時監測和機制研究等問題，且動物模型與人類生理病理狀態存在差異，導致實驗結果的外推性受到限制。三維（3D）生物打印技術作為一種新興的前沿技術，為構建HCC體外微環境模型提供了新的契機。3D生物打印技術能夠精確控制細胞、生物材料和生長因子等的空間分布，按照預設的三維結構進行逐層打印，從而構建出具有高度仿生結構和功能的組織工程模型。通過3D生物打印技術，可以將不同類型的細胞與生物材料精確組合，模擬HCC微環境中細胞與細胞、細胞與細胞外基質之間的相互作用，為HCC的研究提供了更加真實、可靠的體外模型。與傳統的2D細胞培養和動物模型相比，基于3D生物打印技術構建的HCC體外微環境模型具有以下顯著優勢：一是能夠高度仿生腫瘤微環境，精確模擬細胞的三維空間排列和細胞間的相互作用，更真實地反映腫瘤在體內的生長和發展情況；二是可實現對模型的精準調控，通過調整生物材料的組成、結構和細胞的種類、比例等參數，構建出具有不同特性的腫瘤微環境模型，滿足不同研究目的的需求；三是便于進行實時監測和分析，利用各種先進的成像技術和檢測手段，可以對模型中的細胞行為、分子信號傳導等進行實時動態監測，深入探究HCC的發病機制和藥物作用機制；四是可大量制備，成本相對較低，有利于大規模的藥物篩選和治療方案的優化。綜上所述，本研究旨在利用3D生物打印技術構建肝細胞癌體外微環境模型，通過模擬腫瘤微環境中細胞與細胞、細胞與細胞外基質之間的相互作用，為深入研究肝細胞癌的發病機制、評估藥物療效和開發新的治療方法提供一個創新的、高效的研究平臺，具有重要的科學意義和臨床應用價值。1.2國內外研究現狀在國際上，3D生物打印技術構建肝細胞癌體外微環境模型的研究已取得了一定的進展。美國、歐洲和亞洲的一些科研團隊在該領域處于前沿地位。美國的研究團隊致力于開發新型的生物墨水材料，以實現對肝臟細胞外基質的精確模擬。例如，通過將納米材料與天然高分子材料復合，制備出具有良好生物相容性和機械性能的生物墨水，為肝細胞和腫瘤細胞的生長提供了更接近體內環境的支撐。在歐洲，科研人員側重于利用多細胞共培養技術，在3D打印模型中引入多種細胞類型，如免疫細胞、內皮細胞等，以更全面地模擬腫瘤微環境的細胞組成和相互作用。一項研究通過構建包含肝癌細胞、肝星狀細胞和內皮細胞的三維模型，發現內皮細胞能夠促進腫瘤細胞的增殖和遷移，揭示了血管生成在肝癌發展中的重要作用。亞洲的研究則在3D打印技術的創新和模型的臨床應用方面取得了顯著成果。韓國的研究團隊開發了一種基于微流控技術的3D生物打印方法，能夠精確控制細胞和生物材料的沉積，構建出具有復雜血管網絡的肝癌模型，為研究腫瘤的血液供應和藥物輸送提供了有力工具。日本的科研人員利用3D打印技術構建了患者特異性的肝癌模型，通過對患者腫瘤組織的細胞和基因分析，將個性化的細胞和生物材料打印成三維模型，用于藥物篩選和治療方案的優化，取得了較好的效果。在國內，隨著對3D生物打印技術的重視和投入不斷增加，相關研究也呈現出蓬勃發展的態勢。中山大學的研究團隊在肝細胞癌3D仿生腫瘤微環境模型的構建方面取得了重要突破。他們在仿生復合水凝膠中共培養肝癌細胞、肝星狀細胞和肝細胞的球體，成功構建出體外肝癌微環境的3D模型，實現了細胞與微環境相互作用的可視化。研究發現，當與肝癌細胞共培養時，肝星狀細胞被激活并沉積膠原蛋白以重塑微環境，進而觸發肝癌細胞中更高的上皮-間質轉化（EMT）水平，為研究肝癌和相關肝纖維化的機制提供了重要的仿生平臺。香港大學的科研團隊研發了“仿生肝立方”，通過三維生物打印技術仿制病患肝臟，制成同時具有正常組織、腫瘤組織、血管結構的體外模型。該模型內置創新的微血管系統，能助快速評估各種傳統藥物和新興療法的功效和副作用，可替代動物模型廣泛應用于新藥研發，為開展臨床試驗提供更真實準確的數據，提高臨床試驗的成功率，并縮短研發周期、降低成本。盡管國內外在利用3D生物打印技術構建肝細胞癌體外微環境模型方面取得了諸多成果，但目前的研究仍存在一些不足和空白。一方面，現有的生物墨水材料雖然在生物相容性和機械性能等方面有了一定的改進，但仍難以完全模擬肝臟細胞外基質的復雜成分和結構，導致模型與體內真實環境存在一定差異。另一方面，大多數模型在構建過程中對腫瘤微環境中各種細胞間的動態相互作用以及信號傳導通路的模擬不夠全面和深入，限制了對肝癌發病機制和治療靶點的深入研究。此外，如何將3D打印的肝癌模型與臨床實踐更緊密地結合，實現從基礎研究到臨床應用的有效轉化，也是當前面臨的一大挑戰。綜上所述，目前的研究在生物墨水、細胞間作用模擬及臨床轉化等方面存在不足。本文將致力于篩選優化生物墨水，深入研究細胞間相互作用，探索臨床轉化路徑，利用3D生物打印技術構建更完善的肝細胞癌體外微環境模型，為肝癌研究和治療提供有力支持。1.3研究目的與內容本研究旨在利用3D生物打印技術，構建高度仿生的肝細胞癌體外微環境模型，為深入探究肝細胞癌的發病機制、評估藥物療效以及開發新型治療方法提供創新的研究平臺。通過該模型，期望能夠更準確地模擬體內腫瘤微環境，揭示肝細胞癌發生發展過程中的關鍵分子機制和細胞間相互作用，為臨床治療提供更具針對性和有效性的理論依據。圍繞這一研究目的，本研究將開展以下幾方面的內容：3D生物打印技術原理及生物墨水的篩選與優化：深入研究3D生物打印技術的工作原理，包括擠出式打印、光固化打印、噴墨式打印等不同打印方式的特點和適用范圍，分析其在構建肝細胞癌體外微環境模型中的優勢和局限性。系統篩選適合肝臟組織的生物墨水材料，如天然高分子材料（如膠原蛋白、海藻酸鈉、透明質酸等）、合成高分子材料（如聚乳酸、聚己內酯等）以及它們的復合材料。通過實驗測試不同生物墨水的生物相容性、機械性能、降解特性等，優化生物墨水的配方和制備工藝，使其能夠更好地模擬肝臟細胞外基質的結構和功能，為細胞的生長、增殖和分化提供適宜的微環境。肝細胞癌體外微環境模型的構建：從肝癌患者手術切除的腫瘤組織或細胞系中獲取肝癌細胞，同時分離培養肝星狀細胞、肝細胞等腫瘤微環境中的相關細胞。利用優化后的3D生物打印技術，將肝癌細胞、肝星狀細胞、肝細胞以及生物墨水按照預設的三維結構進行逐層打印，構建包含多種細胞類型和細胞外基質的肝細胞癌體外微環境模型。在打印過程中，精確控制細胞的密度、分布以及生物材料的比例和空間結構，模擬體內腫瘤微環境中細胞與細胞、細胞與細胞外基質之間的相互作用。模型的性能評估與驗證：運用多種生物學和材料學檢測方法，對構建的肝細胞癌體外微環境模型進行全面的性能評估。通過細胞活力檢測、增殖能力分析、凋亡檢測等實驗，評估模型中細胞的生物學活性和功能狀態；利用免疫熒光染色、蛋白質印跡、實時定量PCR等技術，檢測模型中相關基因和蛋白的表達水平，分析細胞間的信號傳導通路和相互作用機制；采用掃描電子顯微鏡、原子力顯微鏡等材料表征手段，觀察模型的微觀結構和表面形貌，測定其機械性能和降解特性，驗證模型是否符合預期的設計要求和生物學特性。同時，將構建的3D模型與傳統的2D細胞培養模型和動物模型進行對比研究，評估3D模型在模擬體內腫瘤微環境方面的優勢和改進之處。基于模型的肝細胞癌發病機制研究及藥物篩選：利用構建的肝細胞癌體外微環境模型，深入研究腫瘤細胞與微環境中其他細胞之間的相互作用對肝癌發生發展的影響。通過干擾或調控模型中的關鍵信號通路、細胞因子等，觀察腫瘤細胞的生物學行為變化，揭示肝細胞癌發病的分子機制和關鍵調控因素。以該模型為平臺，開展抗腫瘤藥物的篩選和療效評估研究。將不同類型的抗腫瘤藥物（如化療藥物、靶向藥物、免疫治療藥物等）作用于模型，通過檢測細胞活力、增殖抑制率、凋亡率等指標，評估藥物對肝癌細胞的殺傷效果和對腫瘤微環境的調節作用。同時，分析藥物在模型中的作用機制和耐藥機制，為臨床藥物研發和治療方案的優化提供實驗依據。1.4研究方法與創新點本研究將綜合運用多種研究方法，確保研究的科學性、可靠性和創新性，具體如下：文獻研究法：全面搜集和整理國內外關于3D生物打印技術、肝細胞癌發病機制、腫瘤微環境以及相關模型構建等方面的文獻資料，了解該領域的研究現狀和發展趨勢，分析現有研究的優勢和不足，為本研究提供堅實的理論基礎和研究思路。通過對文獻的深入分析，總結出不同3D生物打印方式在構建腫瘤模型中的應用特點，以及適合肝臟組織的生物墨水材料的研究進展，為后續實驗方案的設計提供參考依據。實驗研究法：生物墨水的篩選與優化實驗：針對不同類型的生物墨水材料，包括天然高分子材料（如膠原蛋白、海藻酸鈉、透明質酸等）、合成高分子材料（如聚乳酸、聚己內酯等）以及它們的復合材料，設計一系列實驗來測試其生物相容性、機械性能、降解特性等。采用細胞毒性實驗評估生物墨水對細胞活力的影響，通過拉伸測試、壓縮測試等手段測定其機械性能，利用體外降解實驗觀察其在不同環境下的降解速率，從而篩選出最適合構建肝細胞癌體外微環境模型的生物墨水，并對其配方和制備工藝進行優化。肝細胞癌體外微環境模型的構建實驗：從肝癌患者手術切除的腫瘤組織或細胞系中獲取肝癌細胞，同時分離培養肝星狀細胞、肝細胞等腫瘤微環境中的相關細胞。利用優化后的3D生物打印技術，將不同細胞類型和生物墨水按照預設的三維結構進行逐層打印。在打印過程中，精確控制細胞的密度、分布以及生物材料的比例和空間結構，構建包含多種細胞類型和細胞外基質的肝細胞癌體外微環境模型。通過多次重復實驗，確保模型構建的穩定性和可重復性。模型的性能評估與驗證實驗：運用多種生物學和材料學檢測方法對構建的模型進行全面性能評估。利用CCK-8法、EdU染色等實驗檢測細胞活力和增殖能力，通過AnnexinV-FITC/PI雙染法檢測細胞凋亡情況；采用免疫熒光染色、蛋白質印跡（WesternBlot）、實時定量PCR（qPCR）等技術，檢測模型中相關基因和蛋白的表達水平，分析細胞間的信號傳導通路和相互作用機制；使用掃描電子顯微鏡（SEM）、原子力顯微鏡（AFM）等材料表征手段，觀察模型的微觀結構和表面形貌，測定其機械性能和降解特性。同時，將構建的3D模型與傳統的2D細胞培養模型和動物模型進行對比研究，評估3D模型在模擬體內腫瘤微環境方面的優勢和改進之處。基于模型的肝細胞癌發病機制研究及藥物篩選實驗：利用構建的肝細胞癌體外微環境模型，通過干擾或調控模型中的關鍵信號通路（如Wnt/β-catenin信號通路、PI3K/Akt信號通路等）、細胞因子（如TGF-β、IL-6等）等，觀察腫瘤細胞的生物學行為變化，深入研究腫瘤細胞與微環境中其他細胞之間的相互作用對肝癌發生發展的影響，揭示肝細胞癌發病的分子機制和關鍵調控因素。以該模型為平臺，開展抗腫瘤藥物的篩選和療效評估研究。將不同類型的抗腫瘤藥物（如化療藥物、靶向藥物、免疫治療藥物等）作用于模型，通過檢測細胞活力、增殖抑制率、凋亡率等指標，評估藥物對肝癌細胞的殺傷效果和對腫瘤微環境的調節作用。同時，利用蛋白質組學、代謝組學等技術分析藥物在模型中的作用機制和耐藥機制，為臨床藥物研發和治療方案的優化提供實驗依據。數據分析方法：運用統計學軟件（如SPSS、GraphPadPrism等）對實驗數據進行分析處理。對于計量資料，采用t檢驗、方差分析等方法進行組間差異比較；對于計數資料，采用卡方檢驗等方法進行分析。通過數據分析，明確不同實驗條件下模型的性能差異以及藥物對模型的作用效果，為研究結果的可靠性提供統計學支持。同時，利用生物信息學分析方法對基因表達數據、蛋白質組學數據等進行挖掘和分析，深入揭示肝細胞癌發病機制和藥物作用的分子網絡。本研究在利用3D生物打印技術構建肝細胞癌體外微環境模型方面具有以下創新點：模型構建方法創新：采用多細胞共培養與3D生物打印相結合的方式，將肝癌細胞、肝星狀細胞、肝細胞等多種細胞類型與優化后的生物墨水精確組合，構建出具有高度仿生結構和功能的肝細胞癌體外微環境模型。這種方法能夠更真實地模擬體內腫瘤微環境中細胞與細胞、細胞與細胞外基質之間的復雜相互作用，為肝癌研究提供了一種全新的模型構建策略。多因素模擬創新：在模型構建過程中，不僅考慮了細胞類型和細胞外基質的因素，還通過精確控制生物墨水的組成、結構以及細胞的空間分布，模擬腫瘤微環境中的力學微環境、化學微環境等多種因素。例如，通過調整生物墨水的剛度來模擬肝臟組織在不同病理狀態下的力學特性，通過添加特定的生長因子和信號分子來模擬腫瘤微環境中的化學信號傳導，從而更全面地反映體內腫瘤微環境的復雜性。應用拓展創新：將構建的肝細胞癌體外微環境模型應用于肝癌發病機制研究、藥物篩選以及治療方案評估等多個領域，實現了從基礎研究到臨床應用的初步探索。通過該模型，不僅可以深入研究肝癌的發病機制，為尋找新的治療靶點提供理論依據，還可以快速、高效地篩選和評估抗腫瘤藥物的療效和安全性，為臨床個性化治療方案的制定提供有力支持。同時，本研究還探索了將3D打印技術與臨床影像數據相結合，構建患者特異性的肝癌模型，為精準醫療的發展提供了新的思路和方法。二、相關理論基礎2.1肝細胞癌概述肝細胞癌（HepatocellularCarcinoma，HCC）是原發性肝癌中最常見的類型，約占原發性肝癌的75%-85%。其起源于肝細胞，是一種具有高度侵襲性和轉移性的惡性腫瘤。肝細胞癌的發病機制是一個復雜的多步驟過程，涉及多種因素的相互作用。目前研究認為，慢性肝病是肝細胞癌發生的主要危險因素，其中乙型肝炎病毒（HBV）和丙型肝炎病毒（HCV）感染是最為重要的病因。全球約50%-80%的肝細胞癌病例與HBV感染相關，在我國，這一比例更是高達80%以上。HBV通過整合到宿主基因組中，導致基因的突變和異常表達，進而激活致癌信號通路，促進肝細胞的惡性轉化。例如，HBVX蛋白（HBx）可以與多種細胞內蛋白相互作用，干擾細胞的正常代謝和信號傳導，誘導細胞增殖和凋亡失衡，最終引發肝癌。HCV感染則主要通過持續的肝臟炎癥和氧化應激反應，損傷肝細胞DNA，導致基因突變和腫瘤發生。除了病毒感染，肝硬化也是肝細胞癌發生的重要基礎。肝硬化時，肝臟組織發生彌漫性纖維化和假小葉形成，肝臟微環境發生改變，肝細胞的增殖和分化異常，增加了肝癌發生的風險。據統計，約70%-90%的肝細胞癌患者合并有肝硬化。黃曲霉毒素B1（AFB1）、酒精、非酒精性脂肪性肝病等因素也與肝細胞癌的發生密切相關。AFB1是一種強烈的致癌物質，主要由黃曲霉和寄生曲霉產生，常污染谷物、堅果等食品。AFB1進入人體后，經過肝臟代謝轉化為具有活性的環氧化物，與DNA結合形成加合物，導致基因突變和肝癌發生。長期大量飲酒可導致酒精性肝病，進一步發展為肝硬化和肝癌。非酒精性脂肪性肝病近年來發病率不斷上升，其與代謝綜合征密切相關，通過脂肪毒性、氧化應激、炎癥反應等機制，促進肝細胞癌的發生發展。肝細胞癌起病隱匿，早期常無明顯癥狀，隨著腫瘤的進展，可出現一系列癥狀。肝區疼痛是最常見的癥狀，多為持續性鈍痛、脹痛或刺痛，主要是由于腫瘤迅速生長，使肝包膜張力增加所致。患者還可能出現乏力、消瘦、食欲減退、腹脹等全身和消化道癥狀。部分患者可伴有發熱，多為低熱，少數患者可出現高熱。當腫瘤侵犯膽管或壓迫膽管時，可導致黃疸，表現為皮膚和鞏膜黃染、尿色加深等。此外，肝細胞癌還可能出現轉移癥狀，如肺轉移可引起咳嗽、咯血；骨轉移可導致骨痛、病理性骨折等。肝細胞癌的診斷主要依靠影像學檢查、血清學標志物檢測以及組織病理學檢查。影像學檢查包括超聲檢查、CT檢查、MRI檢查等。超聲檢查是肝細胞癌篩查的首選方法，具有操作簡便、價格低廉、無輻射等優點，可發現肝臟內的占位性病變，并初步判斷其性質。CT檢查和MRI檢查能夠更清晰地顯示腫瘤的大小、位置、形態、血供情況以及與周圍組織的關系，對于肝細胞癌的診斷和分期具有重要價值。動態增強CT和MRI檢查表現為“快進快出”的特點，即動脈期腫瘤明顯強化，門靜脈期和延遲期強化迅速減退，這是肝細胞癌的典型影像學特征。血清學標志物檢測中，甲胎蛋白（AFP）是應用最廣泛的肝細胞癌標志物。AFP是一種糖蛋白，主要由胎兒肝細胞及卵黃囊合成。在成人，AFP升高常見于肝細胞癌，其診斷肝細胞癌的敏感性和特異性分別約為60%-70%和80%左右。當AFP≥400μg/L，持續4周，或AFP≥200μg/L，持續8周，并能排除妊娠、活動性肝病、生殖腺胚胎源性腫瘤等其他疾病時，結合影像學檢查，可做出肝細胞癌的臨床診斷。但需要注意的是，部分肝細胞癌患者AFP并不升高，因此AFP陰性不能排除肝細胞癌的診斷。組織病理學檢查是肝細胞癌診斷的金標準，通過肝穿刺活檢或手術切除標本進行病理檢查，可明確腫瘤的組織學類型、分化程度、有無血管侵犯等，為治療方案的選擇提供重要依據。肝細胞癌的治療方法多樣，主要包括手術治療、局部治療、全身治療等，治療方案的選擇需根據患者的腫瘤分期、肝功能狀況、身體狀況等因素綜合考慮。手術治療是肝細胞癌的首選治療方法，包括肝切除術和肝移植術。肝切除術適用于腫瘤局限、肝功能良好的患者，通過切除腫瘤組織，達到根治的目的。肝移植術則適用于肝功能嚴重受損、無法耐受肝切除術的早期肝細胞癌患者，以及符合米蘭標準（單個腫瘤直徑≤5cm；或腫瘤數目≤3個，最大直徑≤3cm；無肝外轉移；無大血管侵犯）的患者。肝移植不僅可以切除腫瘤，還可以去除肝硬化這一肝癌發生的基礎，提高患者的生存率和生活質量。局部治療包括射頻消融、微波消融、經動脈化療栓塞（TACE）等。射頻消融和微波消融是通過熱效應使腫瘤組織凝固性壞死，適用于腫瘤直徑≤5cm、數目≤3個的早期肝細胞癌患者，以及不能耐受手術的患者。TACE是將化療藥物和栓塞劑混合后注入肝動脈，使腫瘤組織缺血壞死，同時發揮化療藥物的抗腫瘤作用，主要用于不能手術切除的中晚期肝細胞癌患者，可控制腫瘤生長，延長患者生存期。全身治療主要包括化療、靶向治療和免疫治療。化療藥物如多柔比星、順鉑等，對肝細胞癌的療效有限，且不良反應較大，目前僅用于一般狀況較好、肝功能Child-PughA或B級、無肝外轉移的晚期肝細胞癌患者。靶向治療是近年來肝細胞癌治療的重要進展，索拉非尼是第一個被批準用于治療晚期肝細胞癌的靶向藥物，通過抑制腫瘤細胞的增殖和血管生成，延長患者的生存期。侖伐替尼、瑞戈非尼、卡博替尼等多種新型靶向藥物也相繼獲批用于肝細胞癌的治療，為患者提供了更多的選擇。免疫治療如帕博利珠單抗、納武利尤單抗等免疫檢查點抑制劑，通過激活機體的免疫系統，增強免疫細胞對腫瘤細胞的殺傷作用，在晚期肝細胞癌的治療中取得了較好的療效，顯著改善了患者的生存預后。肝細胞癌的預后總體較差，5年生存率較低。其預后受到多種因素的影響，包括腫瘤分期、治療方法、肝功能狀況、患者的身體狀況等。早期肝細胞癌患者通過手術切除或肝移植等根治性治療，5年生存率可達50%-70%。然而，由于肝細胞癌起病隱匿，多數患者確診時已處于中晚期，失去了手術根治的機會，這部分患者的5年生存率僅為10%-30%左右。此外，肝細胞癌具有較高的復發率，即使接受了根治性治療，術后5年內的復發率仍高達40%-70%。復發后的治療相對困難，預后也較差。因此，提高肝細胞癌的早期診斷率，優化治療方案，降低復發率，是改善肝細胞癌患者預后的關鍵。2.2腫瘤微環境腫瘤微環境（TumorMicroenvironment，TME）是腫瘤細胞生長、增殖和轉移的重要外部環境，它是一個由多種細胞成分、細胞外基質以及各種生物活性分子組成的復雜生態系統。腫瘤微環境與腫瘤細胞之間存在著密切的相互作用，這種相互作用對腫瘤的發生、發展、侵襲、轉移以及對治療的反應等過程都產生著深遠的影響。深入了解腫瘤微環境的組成和作用機制，對于揭示腫瘤的生物學行為、開發新的治療策略具有重要意義。腫瘤微環境的細胞組成成分十分復雜，主要包括腫瘤細胞、免疫細胞、基質細胞等。腫瘤細胞作為腫瘤微環境的核心成分，具有無限增殖、侵襲和轉移的能力。它們通過分泌多種細胞因子和信號分子，改變周圍微環境，以滿足自身生長和生存的需求。例如，腫瘤細胞分泌的血管內皮生長因子（VEGF）可以促進腫瘤血管生成，為腫瘤細胞提供充足的營養和氧氣供應；分泌的轉化生長因子-β（TGF-β）可以抑制免疫細胞的活性，幫助腫瘤細胞逃避免疫監視。免疫細胞在腫瘤微環境中扮演著重要角色，其種類繁多，包括T細胞、B細胞、自然殺傷細胞（NK細胞）、巨噬細胞、樹突狀細胞（DC）等。T細胞是腫瘤免疫反應的關鍵參與者，其中細胞毒性T淋巴細胞（CTL）能夠識別并殺傷腫瘤細胞。然而，在腫瘤微環境中，T細胞的功能常常受到抑制，這主要是由于腫瘤細胞和其他免疫抑制細胞分泌的抑制性細胞因子（如TGF-β、IL-10等）以及免疫檢查點分子（如PD-1/PD-L1、CTLA-4等）的作用，導致T細胞的活化、增殖和殺傷功能受到阻礙。B細胞在腫瘤免疫中的作用較為復雜，一方面，B細胞可以通過產生抗體參與體液免疫反應，對腫瘤細胞產生殺傷作用；另一方面，腫瘤微環境中的B細胞也可能分泌一些細胞因子，促進腫瘤的生長和轉移。NK細胞是天然免疫系統的重要組成部分，能夠非特異性地殺傷腫瘤細胞，在腫瘤免疫監視中發揮重要作用。但在腫瘤微環境中，NK細胞的活性也可能受到抑制，其殺傷腫瘤細胞的能力下降。巨噬細胞在腫瘤微環境中可分為M1型和M2型。M1型巨噬細胞具有促炎和抗腫瘤活性，能夠分泌炎性細胞因子，激活免疫細胞，殺傷腫瘤細胞；而M2型巨噬細胞則具有抗炎和促腫瘤作用，它們可以分泌血管生成因子、免疫抑制因子等，促進腫瘤的生長、血管生成和免疫逃逸。腫瘤相關巨噬細胞（TAM）主要以M2型為主，在腫瘤微環境中大量存在，與腫瘤的不良預后密切相關。DC是體內功能最強的抗原呈遞細胞，能夠攝取、加工和呈遞腫瘤抗原，激活T細胞，啟動抗腫瘤免疫反應。然而，在腫瘤微環境中，DC的功能常常受到抑制，其抗原呈遞能力下降，無法有效地激活T細胞，導致腫瘤免疫逃逸。基質細胞是腫瘤微環境的重要組成部分，包括成纖維細胞、脂肪細胞、內皮細胞、肝星狀細胞等。成纖維細胞在腫瘤微環境中被激活后，轉變為癌相關成纖維細胞（CAF）。CAF可以分泌大量的細胞外基質成分，如膠原蛋白、纖連蛋白等，改變腫瘤微環境的物理和化學性質，為腫瘤細胞的生長和轉移提供支持。同時，CAF還能分泌多種生長因子和細胞因子，如血小板衍生生長因子（PDGF）、TGF-β等，促進腫瘤細胞的增殖、遷移和侵襲，調節腫瘤免疫微環境。脂肪細胞在腫瘤微環境中也發生了一系列變化，它們可以通過分泌脂肪酸、脂肪因子等，影響腫瘤細胞的代謝和生長。例如，脂肪細胞分泌的瘦素可以促進腫瘤細胞的增殖和遷移，而脂聯素則具有抑制腫瘤生長的作用。內皮細胞參與腫瘤血管的形成，腫瘤血管與正常血管在結構和功能上存在明顯差異，其管壁不完整、通透性高，為腫瘤細胞的轉移提供了便利條件。腫瘤細胞通過分泌VEGF等血管生成因子，招募內皮細胞，促進腫瘤血管的生成。肝星狀細胞在正常肝臟中處于靜止狀態，當肝臟受到損傷或發生炎癥時，肝星狀細胞被激活，轉化為肌成纖維細胞樣細胞。在肝細胞癌微環境中，激活的肝星狀細胞可以分泌細胞外基質，導致肝臟纖維化，同時還能分泌多種細胞因子和生長因子，如TGF-β、肝細胞生長因子（HGF）等，促進肝癌細胞的增殖、遷移和侵襲。腫瘤微環境中的非細胞組成成分主要包括細胞外基質（ECM）和各種生物活性分子。ECM是由膠原蛋白、彈性蛋白、纖連蛋白、層粘連蛋白等多種蛋白質和多糖組成的復雜網絡結構，它不僅為細胞提供物理支撐，還參與細胞的黏附、遷移、增殖和分化等過程。在腫瘤微環境中，ECM的組成和結構發生了顯著改變，其含量增加，硬度增大，這種變化為腫瘤細胞的生長和轉移提供了有利的微環境。例如，膠原蛋白的過度沉積可以增加腫瘤組織的硬度，激活腫瘤細胞內的機械信號傳導通路，促進腫瘤細胞的增殖和遷移。同時，ECM還可以作為儲存庫，結合和釋放各種生物活性分子，如生長因子、細胞因子等，調節腫瘤細胞的生物學行為。生物活性分子在腫瘤微環境中發揮著重要的信號傳導和調節作用，主要包括生長因子、細胞因子、趨化因子、代謝產物等。生長因子如表皮生長因子（EGF）、胰島素樣生長因子（IGF）等，可以與腫瘤細胞表面的受體結合，激活細胞內的信號傳導通路，促進腫瘤細胞的增殖、存活和遷移。細胞因子如IL-6、IL-8、TNF-α等，參與腫瘤微環境中的炎癥反應和免疫調節。IL-6可以通過激活JAK/STAT3信號通路，促進腫瘤細胞的增殖和存活，同時還能抑制免疫細胞的活性，幫助腫瘤細胞逃避免疫監視。IL-8是一種趨化因子，能夠招募中性粒細胞、T細胞等免疫細胞到腫瘤部位，同時也可以促進腫瘤血管生成和腫瘤細胞的遷移。TNF-α在腫瘤微環境中具有雙重作用，低濃度的TNF-α可以激活免疫細胞，殺傷腫瘤細胞；而高濃度的TNF-α則可能促進腫瘤細胞的增殖、侵襲和轉移。趨化因子是一類能夠吸引免疫細胞定向遷移的小分子蛋白質，它們在腫瘤微環境中形成濃度梯度，引導免疫細胞向腫瘤部位聚集。然而，腫瘤細胞也可以利用趨化因子及其受體，促進自身的遷移和轉移。例如，CXCR4/CXCL12軸在腫瘤細胞的轉移中發揮著重要作用，腫瘤細胞高表達CXCR4，而腫瘤微環境中的基質細胞等則分泌CXCL12，二者結合后可以促進腫瘤細胞向表達CXCL12的器官轉移。代謝產物如乳酸、腺苷等，在腫瘤微環境中也具有重要的調節作用。腫瘤細胞由于代謝旺盛，會產生大量的乳酸，導致腫瘤微環境的pH值降低。酸性微環境可以抑制免疫細胞的活性，促進腫瘤細胞的侵襲和轉移，同時還能影響腫瘤血管的生成和藥物的療效。腺苷是細胞代謝的產物之一，在腫瘤微環境中，腺苷的濃度升高，它可以通過與免疫細胞表面的腺苷受體結合，抑制免疫細胞的活性，促進腫瘤免疫逃逸。腫瘤微環境在肝細胞癌的發生、發展、轉移及耐藥中發揮著關鍵作用。在肝細胞癌的發生過程中，慢性炎癥和肝臟損傷是重要的誘發因素。長期的HBV或HCV感染、酒精性肝病、非酒精性脂肪性肝病等導致肝臟持續發生炎癥反應，激活肝星狀細胞等基質細胞，分泌大量的細胞因子和生長因子，如TGF-β、HGF等。這些因子可以誘導肝細胞的增殖和分化異常，促進肝細胞的惡性轉化。同時，炎癥微環境中的免疫細胞如巨噬細胞、T細胞等，其功能也發生了改變，無法有效地清除異常細胞，為腫瘤的發生創造了條件。在肝細胞癌的發展過程中，腫瘤微環境為腫瘤細胞的生長提供了適宜的條件。腫瘤細胞與基質細胞之間通過分泌細胞因子和生長因子，形成了一個相互促進的正反饋環路。例如，腫瘤細胞分泌的HGF可以激活肝星狀細胞，使其分泌更多的細胞外基質和細胞因子，如TGF-β、PDGF等，這些因子又進一步促進腫瘤細胞的增殖、遷移和侵襲。此外，腫瘤微環境中的血管生成也是腫瘤發展的重要因素。腫瘤細胞分泌的VEGF等血管生成因子，刺激內皮細胞增殖和遷移，形成新生血管，為腫瘤細胞提供充足的營養和氧氣，促進腫瘤的生長。腫瘤微環境在肝細胞癌的轉移中起著至關重要的作用。腫瘤細胞要實現轉移，需要突破基底膜，進入血液循環或淋巴循環，然后在遠處器官定植和生長。腫瘤微環境中的細胞外基質成分和各種生物活性分子為腫瘤細胞的轉移提供了支持。例如，腫瘤細胞分泌的基質金屬蛋白酶（MMPs）可以降解細胞外基質，破壞基底膜的完整性，使腫瘤細胞能夠侵入周圍組織和血管。同時，腫瘤微環境中的趨化因子和生長因子可以引導腫瘤細胞的遷移方向，促進其向遠處器官轉移。此外，腫瘤細胞在轉移過程中，還需要逃避免疫系統的監視和殺傷。腫瘤微環境中的免疫抑制細胞和免疫抑制分子，如TAM、調節性T細胞（Treg）、PD-1/PD-L1等，抑制了免疫細胞的活性，幫助腫瘤細胞實現免疫逃逸。腫瘤微環境也是導致肝細胞癌耐藥的重要原因之一。腫瘤微環境中的細胞外基質和各種生物活性分子可以影響藥物的傳遞和分布，降低藥物對腫瘤細胞的作用效果。例如，細胞外基質的增加和硬度的增大，會阻礙藥物的擴散，使藥物難以到達腫瘤細胞。同時，腫瘤微環境中的一些細胞因子和生長因子，如TGF-β、IGF等，可以激活腫瘤細胞內的耐藥相關信號通路，使腫瘤細胞對化療藥物、靶向藥物等產生耐藥性。此外，腫瘤微環境中的免疫抑制狀態也會影響免疫治療的效果，導致腫瘤細胞對免疫治療產生耐藥。2.3三維生物打印技術三維生物打印技術是一種融合了生物材料科學、細胞生物學、計算機科學和機械工程等多學科知識的前沿制造技術，它能夠按照預設的三維結構，將生物材料、細胞和生物活性分子等精確地逐層打印，構建出具有仿生結構和功能的組織工程模型。其基本原理是基于“分層制造、逐層疊加”的思想，與傳統3D打印技術有相似之處，但在材料選擇和應用方面具有獨特的生物醫學特性。在材料選擇方面，3D生物打印所用的材料被稱為生物墨水，這是決定打印成功與否的關鍵因素之一。理想的生物墨水應具備多種特性，以滿足細胞生長和組織構建的需求。首先，生物墨水必須具有良好的生物相容性，確保不會對細胞產生毒性，能夠為細胞提供適宜的生存環境，使細胞在打印后仍能保持正常的生理功能和活性。例如，天然高分子材料如膠原蛋白、海藻酸鈉等，由于其與人體組織的成分相似，具有優異的生物相容性，常被用于制備生物墨水。其次，生物墨水應具有可降解性，在組織修復和再生過程中，隨著新組織的形成，生物墨水能夠逐漸降解，且降解產物不會對機體造成不良影響。聚乳酸-乙交酯（PLGA）等合成高分子材料就具有良好的可降解性，可作為生物墨水的成分之一。此外，生物墨水還需要具備合適的機械性能，能夠為細胞提供足夠的支撐，維持打印結構的穩定性。其機械性能應與目標組織的力學特性相匹配，例如打印骨骼組織時，生物墨水需要具有較高的硬度和強度，以模擬骨骼的力學性能；而打印軟組織如皮膚、肝臟等時，生物墨水則應具有較好的柔韌性和彈性。同時，生物墨水的流變學特性也至關重要，它需要在打印過程中具有良好的流動性，以便能夠順利地通過打印噴頭或噴嘴，形成精確的三維結構；而在打印完成后，又能迅速固化，保持結構的形狀和完整性。例如，通過調整生物墨水的濃度、添加交聯劑等方式，可以改變其流變學特性，滿足打印需求。3D生物打印技術的打印工藝主要包括噴墨打印、擠出打印和激光輔助打印等類型，每種工藝都有其獨特的工作原理和適用范圍。噴墨打印技術是通過精確控制液滴的噴射，將生物材料逐層堆積形成三維結構。其工作原理類似于傳統的噴墨打印機，噴頭在計算機的控制下，將含有細胞和生物材料的液滴精確地噴射到指定位置。這種打印工藝的優點是打印速度快、分辨率高，可以實現對細胞和生物材料的精確操控，適用于構建精細的組織結構。然而，噴墨打印技術對生物墨水的要求較高，需要生物墨水具有較低的粘度，以確保液滴能夠順利噴射，這在一定程度上限制了其對某些高粘度生物材料的應用。此外，由于液滴的體積較小，對于構建較大尺寸的組織工程模型，打印時間較長。擠出打印技術是通過將生物材料擠出形成連續的線條，逐層堆疊構建組織結構。在擠出打印過程中，生物墨水被裝載在注射器或擠出機中，通過機械壓力或氣動壓力將其從噴頭擠出，形成細絲狀的材料流，按照預設的路徑逐層堆積，最終形成三維結構。這種打印工藝的優點是能夠處理各種粘度的生物材料，包括高粘度的生物墨水，可打印的材料種類豐富。同時，擠出打印技術能夠構建較大尺寸和復雜形狀的組織工程模型，具有較好的結構穩定性。但是，擠出打印的分辨率相對較低，打印速度較慢，在打印過程中，生物材料受到的剪切力較大，可能會對細胞的活性產生一定的影響。為了減少剪切力對細胞的損傷，研究人員通常會優化噴頭的設計和打印參數，如降低擠出壓力、增大噴頭直徑等。激光輔助打印技術則利用激光的能量，將液態的生物材料凝固成固態結構。其工作原理是在打印過程中，激光束聚焦在含有生物材料的液面上，通過激光的熱效應或光化學反應，使液態生物材料迅速凝固，從而實現材料的逐層堆積。激光輔助打印技術具有高精度、高分辨率的特點，能夠實現對細胞和生物材料的精確操控，適用于構建復雜的三維結構和微小的組織工程模型。此外，該技術對生物墨水的要求相對較低，可使用多種類型的生物材料。然而，激光輔助打印設備成本較高，打印過程較為復雜，需要專業的操作人員進行控制，這在一定程度上限制了其廣泛應用。同時，激光能量可能會對細胞產生一定的熱損傷，因此需要精確控制激光參數，確保細胞的活性和功能不受影響。3D生物打印構建過程通常包括預處理、打印和后處理三個階段。在預處理階段，研究人員首先需要獲取目標組織或器官的三維結構信息，這可以通過醫學成像技術如計算機斷層掃描（CT）、磁共振成像（MRI）等獲取患者的解剖數據，然后利用計算機輔助設計（CAD）軟件對這些數據進行處理和分析，重建出目標組織或器官的三維模型。接下來，根據三維模型和打印需求，選擇合適的生物墨水和細胞，并將它們混合制備成具有適宜粘度的生物墨水。在制備生物墨水時，需要精確控制細胞的密度和生物材料的比例，以確保打印出的組織工程模型具有良好的生物學性能。此外，還需要對打印設備進行調試和校準，設置合適的打印參數，如打印速度、溫度、層高、路徑等。在打印階段，打印機按照設定的程序，將生物墨水逐層堆積，構建出目標組織或器官的三維結構。在打印過程中，需要密切監控打印狀態，確保生物墨水的均勻擠出或噴射，以及打印結構的準確性和穩定性。對于復雜的結構或懸空部分，可能需要添加支撐結構來保持打印過程的穩定性。支撐結構可以在打印完成后去除或降解，不會影響最終產品的性能。同時，為了保證細胞的活性和功能，還需要控制打印環境的溫度、濕度和氣體成分等參數，為細胞提供適宜的生存條件。打印完成后，進入后處理階段。構建的組織工程模型需要在適宜的環境中進行培養，以促進細胞的增殖和分化。培養過程中，需要提供合適的營養物質、生長因子和氣體環境，使細胞能夠在生物墨水中生長、遷移和相互作用，逐漸形成具有功能的組織。此外，還可能需要對打印模型進行一些后處理操作，如固化、洗滌、消毒、去除支撐結構等。固化是為了增強打印結構的穩定性和機械性能，可通過光固化、熱固化或化學固化等方法實現。洗滌是為了去除打印模型表面的雜質和未反應的生物材料，保證模型的清潔。消毒則是為了防止微生物污染，確保模型在后續應用中的安全性。去除支撐結構可以使打印模型呈現出最終的形狀和結構。通過后處理，最終得到具有良好生物學性能和結構穩定性的組織工程模型，可用于進一步的研究和應用。三、三維生物打印技術構建肝細胞癌體外微環境模型的方法3.1模型設計3.1.1結構設計模型的結構設計是構建肝細胞癌體外微環境模型的關鍵步驟，它直接影響到模型對體內腫瘤微環境的仿生程度以及后續實驗的準確性和可靠性。肝臟作為人體重要的代謝器官，具有復雜的組織結構和生理功能。正常肝臟組織由肝小葉組成，肝小葉呈多角棱柱體，中央有中央靜脈，肝細胞單層排列成板狀結構，以中央靜脈為中心呈放射狀分布，形成肝板。肝板之間為肝血竇，竇壁由內皮細胞和肝星狀細胞組成，肝血竇內有血液流動，為肝細胞提供營養物質和氧氣。肝細胞癌組織則呈現出與正常肝臟組織不同的結構特征，腫瘤細胞呈巢狀、條索狀或腺樣排列，細胞形態不規則，大小不一，細胞核大且深染，核仁明顯。腫瘤組織內血管豐富，但血管結構紊亂，管壁不完整，存在動靜脈瘺等異常情況，導致腫瘤組織的血液供應和代謝與正常組織存在顯著差異。為了構建出能夠準確模擬肝臟和腫瘤生理結構的模型，我們利用計算機輔助設計（CAD）軟件進行模型的結構設計。在設計過程中，充分考慮肝臟和腫瘤的解剖學特征、細胞分布規律以及細胞外基質的組成和結構。首先，根據肝臟的三維結構數據，構建出肝小葉的基本結構單元，包括中央靜脈、肝板、肝血竇等部分。通過精確的幾何建模，確定各部分的形狀、尺寸和空間位置關系，確保肝小葉結構的準確性和完整性。然后，在肝小葉的基礎上，按照腫瘤組織的生長特點和分布規律，構建腫瘤區域。腫瘤區域的設計考慮了腫瘤細胞的增殖、侵襲和轉移等生物學行為，模擬腫瘤細胞在肝臟組織中的浸潤生長過程，使腫瘤區域與周圍正常肝臟組織形成自然的過渡。在確定模型的形狀和尺寸時，參考人體肝臟和腫瘤的實際大小，并結合實驗需求和打印設備的性能進行合理調整。一般來說，模型的大小應適中，既能保證包含足夠的細胞和組織結構，又便于操作和觀察。例如，我們設計的模型形狀為近似長方體，長、寬、高分別為10mm、8mm、5mm，這樣的尺寸既能模擬肝臟和腫瘤的局部結構，又能在打印過程中保證結構的穩定性和精度。同時，模型的尺寸也考慮了后續實驗中對模型進行成像分析和細胞生物學檢測的要求，確保能夠準確獲取模型內部的信息。模型的內部結構設計也至關重要，它直接影響到細胞的生長和相互作用以及物質的傳輸和代謝。在模型中，通過設置不同的通道和孔隙結構，模擬肝臟內的血管系統和膽管系統，為細胞提供營養物質、氧氣和代謝產物的運輸通道。例如，設計了一套微通道網絡來模擬肝血竇，微通道的直徑和分布密度根據肝臟的生理數據進行優化，確保能夠提供足夠的血液供應，同時促進細胞間的物質交換和信號傳遞。此外，還在模型中設置了一些特殊的結構，如腫瘤血管生成區域，用于研究腫瘤血管生成的機制和過程。通過在該區域添加血管內皮生長因子（VEGF）等生長因子，誘導血管內皮細胞的增殖和遷移，形成新生血管，模擬腫瘤組織內血管生成的過程。細胞分布方式也是模型結構設計的重要內容。根據腫瘤微環境中細胞的組成和分布特點，在模型中精確控制肝癌細胞、肝星狀細胞、肝細胞等不同細胞類型的分布位置和比例。例如，將肝癌細胞主要分布在腫瘤區域，模擬腫瘤細胞的聚集和生長；將肝星狀細胞分布在腫瘤周邊和肝血竇周圍，以模擬其在腫瘤微環境中的激活和對腫瘤生長的影響；肝細胞則分布在正常肝臟組織區域，保持其正常的生理功能和代謝活動。通過合理的細胞分布設計，能夠更好地模擬腫瘤微環境中細胞與細胞之間的相互作用，為研究肝細胞癌的發病機制和治療方法提供更真實的實驗模型。3.1.2細胞選擇與準備細胞的選擇與準備是構建肝細胞癌體外微環境模型的基礎，合適的細胞類型和高質量的細胞狀態對于模型的成功構建和功能發揮至關重要。在本研究中，我們選擇了肝癌細胞、肝星狀細胞、肝細胞等多種細胞類型，以模擬腫瘤微環境中復雜的細胞組成和相互作用。肝癌細胞是模型中的核心細胞成分，其來源主要有兩種途徑：一是從肝癌患者手術切除的腫瘤組織中獲取原代肝癌細胞；二是使用已建立的肝癌細胞系，如HepG2、Hep3B、MHCC97H等。原代肝癌細胞能夠更真實地反映患者腫瘤細胞的生物學特性，但獲取難度較大，培養過程較為復雜，且細胞數量有限。肝癌細胞系則具有易于培養、增殖速度快、細胞數量易于控制等優點，但其生物學特性可能與原代細胞存在一定差異。因此，在實際研究中，我們綜合考慮實驗目的和需求，選擇合適的肝癌細胞來源。若需要研究患者特異性的肝癌生物學行為和治療反應，優先選擇原代肝癌細胞；若進行一般性的肝癌發病機制研究和藥物篩選，肝癌細胞系則是較為常用的選擇。肝星狀細胞在肝臟纖維化和腫瘤微環境中起著關鍵作用。正常情況下，肝星狀細胞處于靜止狀態，當肝臟受到損傷或發生炎癥時，肝星狀細胞被激活，轉化為肌成纖維細胞樣細胞，分泌大量的細胞外基質，如膠原蛋白、纖連蛋白等，導致肝臟纖維化。在肝細胞癌微環境中，激活的肝星狀細胞還能分泌多種細胞因子和生長因子，如轉化生長因子-β（TGF-β）、肝細胞生長因子（HGF）等，促進肝癌細胞的增殖、遷移和侵襲。因此，在模型中引入肝星狀細胞，能夠更好地模擬腫瘤微環境的纖維化特征和細胞間的相互作用。肝星狀細胞通常從正常肝臟組織中分離獲得，常用的分離方法有密度梯度離心法和膠原酶消化法。在分離過程中，需要嚴格控制實驗條件，確保獲得高純度和高活性的肝星狀細胞。肝細胞是肝臟的主要功能細胞，具有多種代謝和解毒功能。在模型中，肝細胞的存在能夠維持肝臟的正常生理功能，同時與肝癌細胞和肝星狀細胞相互作用，影響腫瘤的發生發展。肝細胞可以從正常肝臟組織中分離獲取，也可以使用人肝細胞系，如HL-7702等。分離肝細胞時，同樣需要采用合適的方法，如兩步灌流法，以獲得高質量的肝細胞。在獲取細胞后，需要對細胞進行培養、擴增和預處理，以滿足3D生物打印的需求。細胞培養是維持細胞生長和活性的關鍵步驟，不同類型的細胞需要使用特定的培養基和培養條件。肝癌細胞和肝星狀細胞常用的培養基為DMEM培養基，添加10%胎牛血清、1%青霉素-鏈霉素雙抗等；肝細胞則常用WilliamsE培養基或肝細胞專用培養基，添加胰島素、轉鐵蛋白、硒等生長因子。在培養過程中，需要控制培養溫度、濕度和氣體環境，一般在37℃、5%CO?的培養箱中進行培養。定期更換培養基，觀察細胞的生長狀態，當細胞生長至對數生長期時，進行細胞傳代和擴增，以獲得足夠數量的細胞用于實驗。在3D生物打印前，還需要對細胞進行預處理，以提高細胞在生物墨水中的分散性和活性。預處理步驟包括細胞計數、調整細胞密度、添加細胞保護劑等。使用細胞計數儀對細胞進行準確計數，根據實驗設計，將細胞密度調整到合適的范圍，一般為1×10?-1×10?個/mL。為了保護細胞在打印過程中免受損傷，可在細胞懸液中添加適量的細胞保護劑，如海藻糖、甘露醇等。此外，還需要對細胞進行活力檢測，確保細胞的活性在90%以上，以保證打印后細胞的正常生長和功能。3.2生物材料選擇與制備3.2.1生物材料特性要求在構建肝細胞癌體外微環境模型時，生物材料的選擇至關重要，其特性直接影響模型的質量和實驗結果的準確性。理想的生物材料應具備多種特性，以滿足肝細胞癌模型構建的需求。生物相容性是生物材料的首要特性。肝細胞癌模型中的細胞需要在生物材料提供的微環境中生長、增殖和分化，因此生物材料必須不會對細胞產生毒性，不會引發免疫反應，能夠與細胞和諧共處。例如，天然高分子材料如膠原蛋白，其結構與人體細胞外基質中的成分相似，具有良好的生物相容性，能夠為細胞提供自然的生長環境，促進細胞的黏附、增殖和分化。研究表明，將肝癌細胞接種在膠原蛋白基質上，細胞能夠保持良好的活性和形態，并且能夠正常表達相關的基因和蛋白，說明膠原蛋白能夠為肝癌細胞的生長提供適宜的微環境。生物相容性還包括材料與細胞之間的相互作用，如材料表面的化學性質、電荷分布等會影響細胞的黏附、遷移和信號傳導。具有合適表面性質的生物材料能夠促進細胞與材料之間的相互作用，增強細胞在材料上的附著和功能表達。可降解性是生物材料的另一個重要特性。在肝細胞癌模型的構建和研究過程中，隨著細胞的生長和組織的形成，生物材料需要逐漸降解，為新生組織騰出空間，同時降解產物不能對細胞和周圍環境產生不良影響。聚乳酸-乙交酯（PLGA）是一種常用的可降解合成高分子材料，其降解速率可以通過調整乳酸和乙交酯的比例來控制。在肝細胞癌模型中，PLGA可以作為支架材料，為細胞提供初始的支撐結構，隨著細胞的增殖和組織的成熟，PLGA逐漸降解，不會對細胞的生長和功能產生阻礙。可降解生物材料的降解機制主要包括水解、酶解等。水解是指材料在水的作用下發生化學鍵的斷裂，導致材料逐漸分解；酶解則是通過細胞分泌的酶來催化材料的降解。不同的生物材料具有不同的降解機制和降解速率，在選擇生物材料時，需要根據模型構建的需求和實驗周期，合理選擇具有合適降解特性的材料。力學性能是生物材料的關鍵特性之一。肝臟組織具有一定的力學特性，在構建肝細胞癌體外微環境模型時，生物材料的力學性能應與肝臟組織相匹配，為細胞提供適宜的力學微環境。力學性能包括材料的硬度、彈性模量、拉伸強度等參數。例如，正常肝臟組織的彈性模量約為1-10kPa，肝硬化組織的彈性模量可升高至10-100kPa。在構建肝細胞癌模型時，若要模擬正常肝臟微環境，生物材料的彈性模量應接近正常肝臟組織；若要模擬肝硬化背景下的肝癌微環境，則需要選擇彈性模量較高的生物材料。合適的力學性能不僅能夠維持模型的結構穩定性，還能夠影響細胞的形態、增殖、遷移和分化等生物學行為。研究發現，在剛性較強的材料上，肝癌細胞的增殖速度較快，遷移能力增強；而在柔軟的材料上，細胞的形態和功能更接近體內正常細胞。這是因為細胞能夠感知周圍材料的力學信號，并通過細胞骨架等結構傳遞信號，調節細胞內的基因表達和信號傳導通路，從而影響細胞的生物學行為。生物活性也是生物材料應具備的重要特性。具有生物活性的生物材料能夠與細胞發生特異性的相互作用，調節細胞的生物學功能，促進組織的修復和再生。例如，一些生物材料可以通過表面修飾或添加生物活性分子，如生長因子、細胞黏附肽等，賦予材料生物活性。在肝細胞癌模型中，添加肝細胞生長因子（HGF）的生物材料能夠促進肝癌細胞的增殖和遷移，同時也能調節肝星狀細胞的活化和細胞外基質的分泌，更好地模擬腫瘤微環境中細胞間的相互作用。生物活性分子可以通過與細胞表面的受體結合，激活細胞內的信號傳導通路，調節細胞的基因表達和蛋白質合成，從而影響細胞的生物學行為。此外，生物材料的生物活性還可以體現在其對細胞代謝、免疫調節等方面的影響。例如，某些生物材料可以調節細胞的代謝途徑，促進細胞的能量供應和物質合成；一些生物材料還可以調節免疫細胞的活性，影響腫瘤微環境中的免疫反應。3.2.2常見生物材料介紹在肝細胞癌體外微環境模型構建中，有多種生物材料可供選擇，每種材料都具有獨特的特性和應用優勢。水凝膠是一種常見的生物材料，它是由親水性聚合物通過物理或化學交聯形成的三維網絡結構，能夠吸收大量的水分，具有良好的生物相容性和保水性。水凝膠的種類繁多，包括天然水凝膠和合成水凝膠。天然水凝膠如膠原蛋白、海藻酸鈉、透明質酸等，它們來源于生物體內，具有與人體組織相似的成分和結構，因此生物相容性極佳。膠原蛋白是細胞外基質的主要成分之一，具有良好的細胞黏附性和生物活性，能夠促進細胞的生長和分化。在肝細胞癌模型中，膠原蛋白水凝膠可以為肝癌細胞、肝星狀細胞等提供天然的生長環境，模擬體內細胞與細胞外基質的相互作用。海藻酸鈉是從海藻中提取的多糖，具有良好的生物相容性和可降解性，能夠通過離子交聯形成穩定的水凝膠結構。海藻酸鈉水凝膠可以通過調整交聯程度和濃度，調節其力學性能和降解速率，以滿足不同的實驗需求。透明質酸是一種廣泛存在于人體組織中的糖胺聚糖，具有良好的保濕性和生物活性，能夠促進細胞的遷移和增殖。在肝細胞癌模型中，透明質酸水凝膠可以為細胞提供濕潤的微環境，同時其生物活性有助于調節細胞間的信號傳導。合成水凝膠如聚乙二醇（PEG）、聚丙烯酰胺等，具有結構可控、性能穩定等優點。PEG水凝膠具有良好的生物相容性和低免疫原性，其分子結構可以通過化學修飾引入各種功能性基團，以調節材料的性能。例如，通過在PEG水凝膠中引入細胞黏附肽RGD，可以增強細胞在水凝膠上的黏附能力。聚丙烯酰胺水凝膠具有較高的力學強度和穩定性，可用于構建需要承受一定力學載荷的肝細胞癌模型。然而，合成水凝膠的生物活性相對較低，通常需要通過添加生物活性分子或與天然材料復合等方式來改善其性能。生物墨水是3D生物打印中用于構建模型的關鍵材料，它通常由生物材料、細胞和生物活性分子等組成，具有良好的可打印性和生物相容性。生物墨水的種類豐富多樣，根據其成分和特性的不同，可以分為基于天然材料的生物墨水、基于合成材料的生物墨水以及復合材料生物墨水。基于天然材料的生物墨水，如前面提到的膠原蛋白、海藻酸鈉、透明質酸等制成的生物墨水，具有良好的生物相容性和細胞親和性，能夠為細胞提供自然的生長環境。例如，以膠原蛋白為主要成分的生物墨水，在3D打印過程中能夠保持細胞的活性，打印后細胞能夠在膠原蛋白基質中正常生長和增殖。基于合成材料的生物墨水，如聚乳酸（PLA）、聚己內酯（PCL）等合成高分子材料制成的生物墨水，具有良好的力學性能和可加工性，能夠構建出結構穩定的模型。然而，這些合成材料的生物相容性相對較差，需要進行表面修飾或與天然材料復合來改善其性能。復合材料生物墨水則結合了天然材料和合成材料的優點，通過將兩者復合，可以獲得具有良好生物相容性、力學性能和可打印性的生物墨水。例如，將海藻酸鈉與PLA復合制備的生物墨水，既具有海藻酸鈉的生物相容性和可降解性，又具有PLA的力學強度和穩定性，能夠滿足肝細胞癌模型構建的多種需求。聚乳酸-乙交酯（PLGA）是一種常用的合成高分子生物材料，由乳酸和乙交酯通過共聚反應合成。PLGA具有良好的生物相容性、可降解性和力學性能，其降解產物乳酸和乙交酯是人體代謝的正常產物，對人體無毒副作用。PLGA的降解速率可以通過調整乳酸和乙交酯的比例、分子量以及材料的形態等因素來控制。在肝細胞癌模型中，PLGA可以作為支架材料，為細胞提供支撐結構。由于其良好的力學性能，PLGA支架能夠維持模型的形狀和穩定性，適合構建具有復雜結構的肝細胞癌模型。同時，PLGA的可降解性使得支架在細胞生長和組織形成過程中逐漸降解，為新生組織騰出空間。PLGA還可以通過表面修飾或與其他生物材料復合，進一步改善其性能。例如，將PLGA與膠原蛋白復合，可以提高材料的生物相容性和細胞黏附性；在PLGA表面接枝生長因子或細胞黏附肽等生物活性分子，可以賦予材料生物活性，促進細胞的生長和分化。3.2.3生物材料的制備與處理選定生物材料后，其制備與處理過程對于構建高質量的肝細胞癌體外微環境模型至關重要。制備過程需精確控制各步驟，處理環節則要確保材料的安全性和功能性。以水凝膠為例，其制備過程通常涉及原料混合、溶解和交聯等步驟。以海藻酸鈉水凝膠制備為例，首先將海藻酸鈉粉末按照一定比例與去離子水混合，在攪拌條件下充分溶解，形成均勻的海藻酸鈉溶液。為保證溶液均勻性，攪拌速度和時間需嚴格控制，一般在室溫下以200-500r/min的速度攪拌2-4小時，直至海藻酸鈉完全溶解。接著，根據實驗需求，加入適量的細胞和生物活性分子，如將肝癌細胞以1×10?-1×10?個/mL的密度加入海藻酸鈉溶液中，同時添加一定濃度的肝細胞生長因子（HGF），以促進細胞的生長和增殖。為形成穩定的水凝膠結構，需進行交聯反應。常用的交聯劑為氯化鈣（CaCl?），將CaCl?溶液緩慢滴加到海藻酸鈉溶液中，海藻酸鈉中的鈉離子與CaCl?中的鈣離子發生離子交換，形成交聯網絡，從而使海藻酸鈉溶液轉變為水凝膠。交聯反應的條件，如交聯劑濃度、交聯時間等，會影響水凝膠的性能。一般來說，CaCl?的濃度在0.1-0.5mol/L之間，交聯時間為10-30分鐘，可獲得性能較好的海藻酸鈉水凝膠。生物墨水的制備則更為復雜，除了上述步驟，還需考慮材料的可打印性。以基于膠原蛋白和海藻酸鈉的復合生物墨水制備為例，先分別制備膠原蛋白溶液和海藻酸鈉溶液。膠原蛋白溶液制備時，將膠原蛋白粉末溶解于酸性溶液中，如0.1mol/L的乙酸溶液，在4℃下攪拌過夜，使其充分溶解。海藻酸鈉溶液的制備如前所述。然后，將兩種溶液按照一定比例混合，如膠原蛋白與海藻酸鈉的質量比為1:1-1:3，攪拌均勻。為改善生物墨水的可打印性，可添加適量的增稠劑或流變調節劑，如黃原膠，其添加量一般為生物墨水總質量的0.1%-0.5%。在添加細胞和生物活性分子后，需充分攪拌，使細胞和分子均勻分散在生物墨水中。聚乳酸-乙交酯（PLGA）材料的制備通常采用溶液澆鑄法或熔融擠出法。溶液澆鑄法是將PLGA顆粒溶解于有機溶劑中，如二氯甲烷，形成均勻的溶液。將溶液倒入特定模具中，在通風條件下使有機溶劑揮發，PLGA則在模具中固化成型。這種方法適合制備形狀簡單、厚度較薄的PLGA支架。熔融擠出法則是將PLGA顆粒加熱至其熔點以上，通過螺桿擠出機將熔融的PLGA擠出，形成所需的形狀。該方法可制備具有復雜形狀和結構的PLGA支架，但需要嚴格控制溫度和擠出速度等參數。例如，PLGA的熔點一般在100-150℃之間，擠出溫度可控制在160-180℃，擠出速度為1-5cm/min。在制備完成后，生物材料需要進行滅菌處理，以確保實驗的安全性和可靠性。常用的滅菌方法有高壓蒸汽滅菌、紫外線滅菌和輻照滅菌等。高壓蒸汽滅菌是將生物材料放入高壓蒸汽滅菌鍋中，在121℃、103.4kPa的條件下處理15-20分鐘。這種方法適用于耐高溫、耐高壓的生物材料，如部分水凝膠和PLGA材料。紫外線滅菌是利用紫外線的殺菌作用，將生物材料暴露在紫外線燈下照射一定時間，一般照射30-60分鐘。該方法主要用于表面滅菌，適用于對溫度敏感的生物材料。輻照滅菌則是利用γ射線或電子束等對生物材料進行輻照，破壞微生物的DNA結構，達到滅菌的目的。輻照滅菌的劑量一般為25-30kGy。這種方法適用于各種生物材料，尤其是對熱和紫外線敏感的材料，但需要專業的輻照設備。為改善生物材料的性能，還需進行改性處理。表面修飾是常見的改性方法，如通過化學接枝將生物活性分子連接到材料表面。對于PLGA材料，可通過等離子體處理使其表面活化，然后接枝細胞黏附肽RGD，增強細胞在材料表面的黏附能力。材料復合也是一種有效的改性方法，如將天然材料與合成材料復合，制備具有多種優良性能的復合材料。將膠原蛋白與PLGA復合，可提高PLGA的生物相容性和細胞親和性。在肝細胞癌模型構建中，改性后的生物材料能夠更好地模擬體內腫瘤微環境，促進細胞的生長和相互作用。3.3三維生物打印過程3.3.1打印設備與參數設置本研究選用了[品牌名稱]的[型號]三維生物打印機，該打印機具備高精度的運動控制系統和先進的材料擠出或噴射技術，能夠滿足復雜結構的打印需求，在生物醫學領域得到了廣泛應用。其噴頭設計可精確控制生物材料的輸出，確保細胞和生物墨水在打印過程中的均勻分布，同時配備了溫度、壓力等多種傳感器，實時監測打印過程中的關鍵參數，保障打印質量的穩定性。在打印參數設置方面，根據所選用的生物材料和模型設計要求進行了優化。對于擠出式打印工藝，打印速度設定為[X]mm/s，這一速度既能保證生物墨水的連續穩定擠出，又能避免因速度過快導致的噴頭堵塞或細胞損傷。擠出壓力控制在[X]kPa，確保生物墨水在擠出過程中具有適當的流動性，以形成精確的三維結構。例如，在打印基于海藻酸鈉和膠原蛋白復合生物墨水時，該擠出壓力可使生物墨水順利通過噴頭，并在打印平臺上快速固化，維持結構的完整性。層高是影響打印精度和模型質量的重要參數，本研究將其設置為[X]mm，以實現較高的分辨率和細膩的結構構建。對于光固化打印工藝，光源強度設置為[X]mW/cm2，曝光時間為[X]s，這樣的參數組合能夠確保光固化生物墨水在短時間內充分固化，同時避免過度曝光對細胞活性和生物材料性能的影響。在打印含有光固化水凝膠的模型時，通過精確控制光源強度和曝光時間，可使水凝膠在特定區域迅速固化，形成所需的三維形狀，同時保證細胞在固化過程中的存活率。打印溫度也是關鍵參數之一，根據生物材料和細胞的特性，將打印平臺溫度維持在[X]℃，這一溫度接近細胞的生理溫度，有利于保持細胞的活性和功能。在打印過程中，通過溫控系統實時監測和調節平臺溫度，確保溫度波動在±[X]℃范圍內，為細胞提供穩定的生存環境。3.3.2打印過程控制與質量監控在打印過程中，對環境和設備參數進行嚴格控制是確保模型質量的關鍵。打印室的溫度和濕度保持在相對穩定的范圍內，溫度控制在[X]℃，濕度維持在[X]%，以防止生物墨水因環境因素的變化而發生性能改變，影響打印效果和細胞活性。例如，在高濕度環境下，生物墨水可能會吸收過多水分，導致其粘度降低，影響擠出的穩定性和結構的準確性；而在溫度過高或過低的情況下，細胞的活性和代謝功能可能會受到抑制，甚至導致細胞死亡。打印速度和擠出壓力是影響打印質量的重要設備參數，在打印過程中通過設備的控制系統進行實時監測和調整。一旦發現打印速度或擠出壓力出現異常波動，立即暫停打印，檢查設備和生物墨水的狀態，排除故障后再繼續打印。通過這種方式，有效避免了因參數波動導致的打印缺陷，如線條粗細不均勻、結構變形等問題。為了確保打印質量，采用了多種質量監控方法。圖像監測是常用的方法之一，通過在打印設備上安裝高清攝像頭，實時采集打印過程中的圖像信息。利用圖像分析軟件對采集到的圖像進行處理和分析，對比預設的模型結構，及時發現打印過程中出現的偏差，如結構錯位、缺失等問題。一旦發現問題，立即對打印參數進行調整或對打印過程進行干預，確保模型的準確性。傳感器監測也是重要的質量監控手段。在打印設備上安裝了壓力傳感器、溫度傳感器等，實時監測打印過程中的擠出壓力、打印平臺溫度等參數。當這些參數超出預設的范圍時，傳感器會及時發出警報，提醒操作人員進行調整。例如，當擠出壓力過高時，可能意味著噴頭堵塞或生物墨水粘度異常，需要及時清理噴頭或調整生物墨水的配方；當打印平臺溫度過低時，可能會影響細胞的活性和生物墨水的固化效果，需要及時調整溫控系統。定期對打印完成的模型進行抽樣檢測，通過掃描電子顯微鏡（SEM）觀察模型的微觀結構，評估生物材料的分布和細胞的附著情況；利用原子力顯微鏡（AFM）測定模型的力學性能，確保其符合預期的設計要求。通過這些檢測手段，對打印過程進行全面的質量監控，及時發現和解決問題，提高模型的構建質量和可靠性。3.4模型的后處理與培養3.4.1后處理步驟打印完成后，對模型進行一系列后處理操作是確保模型質量和性能的關鍵環節。固化是后處理的首要步驟，其目的是增強打印結構的穩定性和機械性能，使模型能夠保持預設的三維形狀。對于光固化生物墨水構建的模型，通常采用紫外線照射的方式進行固化。在特定波長的紫外線照射下，生物墨水中的光敏劑被激活，引發聚合反應，使生物墨水迅速固化。例如，對于含有光引發劑的明膠甲基丙烯酸酯（GelMA）水凝膠生物墨水，在365nm紫外線照射下，照射強度為[X]mW/cm2，照射時間為[X]分鐘，可實現良好的固化效果。對于化學交聯的生物墨水，如海藻酸鈉與氯化鈣交聯形成的水凝膠，可將打印模型浸泡在含有適量交聯劑的溶液中，進一步促進交聯反應的進行，提高水凝膠的強度和穩定性。浸泡時間一般為[X]分鐘，交聯劑濃度根據生物墨水的特性進行調整。洗滌步驟旨在去除打印模型表面殘留的未交聯生物材料、雜質以及打印過程中產生的副產物，保證模型的清潔，為后續細胞生長提供良好的環境。通常使用無菌的PBS緩沖液對模型進行多次洗滌。將打印模型置于PBS緩沖液中，輕輕搖晃或振蕩，每次洗滌時間為[X]分鐘，重復洗滌[X]次，以確保表面雜質被充分去除。在洗滌過程中，要注意操作輕柔，避免對模型結構造成損傷。消毒是后處理過程中不可或缺的環節，它能有效防止微生物污染，確保模型在后續培養和實驗中的安全性。對于一些耐高溫的模型，可采用高壓蒸汽滅菌法。將模型放入高壓蒸汽滅菌鍋中，在121℃、103.4kPa的條件下滅菌15-20分鐘。對于對溫度敏感的模型，如含有熱敏性生物材料或細胞的模型，則采用紫外線滅菌或輻照滅菌的方法。紫外線滅菌時，將模型放置在紫外線燈下，距離光源[X]cm，照射時間為30-60分鐘。輻照滅菌則需將模型送到專業的輻照機構，利用γ射線或電子束進行輻照，輻照劑量一般為25-30kGy。若打印過程中使用了支撐結構，去除支撐結構是后處理的重要步驟。支撐結構的存在是為了保證打印過程中懸空部分的穩定性，但在打印完成后，需要將其去除，使模型呈現出最終的設計形狀。對于可降解的支撐材料，如某些基于多糖的可降解材料，可通過延長培養時間或在特定的酶溶液中浸泡，使其自然降解。例如，對于以海藻酸鈉為支撐材料的模型，可將其浸泡在含有海藻酸酶的溶液中，在37℃下反應[X]小時，實現支撐材料的降解。對于不可降解的支撐材料，如一些塑料支撐結構，可采用機械去除的方法。使用精細的鑷子、手術刀等工具，小心地將支撐結構從模型上剝離，操作過程中要避免對模型主體造成損傷。3.4.2培養條件優化在培養過程中，適宜的溫度、濕度、氣體環境、培養基成分和更換頻率等條件對于維持模型中細胞的活性和功能至關重要，需要進行優化。溫度是細胞生長的關鍵因素之一，一般將培養溫度控制在37℃，這與人體的生理溫度相近，能夠為細胞提供最適宜的生長環境。在這個溫度下，細胞內的各種酶活性能夠保持在最佳狀態，有利于細胞的代謝、增殖和分化等生理活動。通過恒溫培養箱來精確控制培養溫度，培養箱內的溫度波動應控制在±0.5℃范圍內，以確保溫度的穩定性。濕度對細胞培養也有重要影響，合適的濕度可以防止培養基蒸發，維持培養基的成分和滲透壓穩定。培養箱內的濕度通常保持在95%左右。為了達到這一濕度條件，培養箱內設有濕度控制系統，通過自動加水或噴霧等方式來調節濕度。在培養過程中，要定期檢查濕度計的準確性，確保濕度處于適宜范圍。氣體環境是細胞培養的另一個重要因素，主要涉及氧氣和二氧化碳的濃度。細胞在代謝過程中需要消耗氧氣，同時產生二氧化碳。二氧化碳不僅參與細胞的代謝活動，還能調節培養基的pH值。在細胞培養中，一般將氧氣濃度維持在21%左右，二氧化碳濃度控制在5%。通過培養箱內的氣體混合系統，精確控制氧氣和二氧化碳的比例。同時，要定期檢測氣體濃度，確保氣體環境的穩定性。培養基是為細胞提供營養和生長因子的關鍵物質，其成分的優化對于模型的培養至關重要。針對肝細胞癌體外微環境模型，培養基的選擇應綜合考慮肝癌細胞、肝星狀細胞和肝細胞等多種細胞的需求。常用的基礎培養基有DMEM、RPMI1640等。在基礎培養基中，需要添加適量的血清，如胎牛血清，其添加比例一般為10%-20%。血清中含有多種生長因子、激素和營養物質，能夠促進細胞的生長和增殖。此外，還需要添加一些特殊的營養成分和生長因子，以滿足不同細胞的特殊需求。例如，為了促進肝細胞的生長和功能維持，