1進出口化妝品中病原菌檢測方法微滴式數字PCR法第4部分：肺炎克雷伯氏菌本文件描述了進出口化妝品中肺炎克雷伯氏菌的微滴式數字PCR檢測方法。本文件適用于進出口化妝品中肺炎克雷伯氏菌的快速檢測。本文件所能達到的檢出限(LOD?)為0.27CFU/g(mL)-0.47CFU/g(mL)。2規(guī)范性引用文件下列文件中的內容通過文中的規(guī)范性引用而構成本文件必不可少的條款。其中，注日期的引用文件，僅該日期對應的版本適用于本文件，不注日期的引用文件，其最新版本(包括所有的修改單)適用于本文件。GB/T6682分析實驗室用水規(guī)格和試驗方法GB19489實驗室生物安全通用要求GB/T27403實驗室質量控制規(guī)范食品分子生物學檢測SN/T2206.3化妝品微生物檢驗方法第3部分：肺炎克雷伯氏菌SN/T5075化妝品微生物檢驗制樣規(guī)范3術語和定義本文件沒有需要界定的術語和定義。下列縮略語適用于本文件。DNA:脫氧核糖核酸(DeoyribonuleicAcid)ddPCR:微滴式數字PCR(dropletdigitalPolymenseChainReaction)PCR:聚合酶鏈式反應(PolymeraseChainReaction)5方法原理針對肺炎克雷伯氏菌phoE基因設計引物、探針，將一定濃度的引物、探針與模板DNA及反應預混液混合，配成PCR反應體系。將該數字PCR體系分布到12000個~20000個微滴中，使大部分微記BHQ1。利用數字PCR系統的檢測通道，可對每個微滴的熒光信號進行采集分析。含有模板DNA的微滴出現熒光信號的增強，形成陽性微滴簇。最終根據陽性微滴的有無判定樣品中是否含有肺炎克2Primer-R:5'-CCACCGCTTCAAACTTC吸取10mL1:10樣品稀釋液接種到90mLSCDLP增菌液中，置于36℃±1℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)混勻增菌培養(yǎng)物，在其液面表層吸取1mL,于時，用生理鹽水清洗沉淀1次~2次。用1mL生理鹽水混懸沉淀，于10000g~12000g離心3min,棄去上清液。在沉淀中加人50μLDNA提取液振蕩混勻，于95℃~100℃加熱10min,室溫冷卻按照公式(1)計算DNA的濃度。4A—260mm處的吸光值；N—核酸稀釋倍數。A/4m在1.8-2.0之間，DNA濃度為0.01ng/μL-10ng/pL時。適用ddPCR檢測。檢測過程中分別設置陽性對照、陰性對照和空白對照。以肺炎克雷伯氏菌標準菌株DNA或含目的片段的DNA作為陽性對照，以非肺炎克雷伯氏菌標準菌株DNA作為陰性對照，用等體積的一級水代替模板DNA作為空白對照。每個待檢樣品提取的DNA溶液進行3個平行ddPCR檢測。按照表1配制反應體系。一一水一一將配制好的ddPCR反應混合液，加人微滴生成裝置加樣孔中，按儀器操作說明生成微滴。將生成的微滴緩慢轉移至96孔板中，封膜后置于PCR儀上，按以下參數進行PCR擴增：95℃10min;94℃30s,57℃1min,40個循環(huán)；98C10min,12℃10min。升降溫速度設置為≤擴增反應結束后，將96孔板放入ddPCR檢測儀中對每個微滴進行熒光檢測，采用FAM通道讀6主要培養(yǎng)基和試劑A.1DNA提取液滅菌一級水將Chelex-100顆粒加入滅菌一級水中混勻，2℃-8℃保存。A2大豆酪蛋白卵磷脂吐溫80(SCDLP)液體培養(yǎng)基A.2.1成分酪蛋白胨大豆蛋白胨氯化鈉磷酸氫二鉀葡萄糖卵磷脂蒸餾水先將卵磷脂在少量蒸餾水中加溫溶解后，再與其他成分混合，加熱溶解，調pH值為7.2-7.3,分裝，每瓶90mL,121℃