藥物分析第十一章抗生素本法得優點:靈敏、用量小,結果直觀適用范圍廣:純度好得、差得制品,已知或新發現得抗生素均適用,同一類型得抗生素不需分離,可一次測定其總效價。缺點:操作步驟多,測定時間長,誤差大等。2理化方法——適用于提純得產品以及化學結構已確定得抗生素優點:迅速、準確、有較高得專屬性。缺點:對含有具同樣官能團雜質得供試品不適用,或需采取適當方法加以校正。而且當該法就是利用某一類型抗生素得共同結構部分得反應時,所測得得結果,往往只能代表藥物得總得含量,并不一定能代表抗生素得生物效價。3第二節β-內酰胺類抗生素頭孢菌素族青霉素族一、化學結構與性質*****6-氨基青霉烷酸7-氨基頭孢菌烷酸4酸性:青霉素和頭孢菌素分子中得游離羧基具有相當強得酸性,大多數青霉素得pKa在2、5～2、8之間,能與無機堿或某些有機堿形成鹽。旋光性:青霉素族分子中含有三個手性碳原子,頭孢菌素族含有兩個手性碳原子,故都具有旋光性。5β-內酰胺環得不穩定性:β-內酰胺環就是該類抗生素得結構活性中心,其性質活潑,就是分子結構中最不穩定部分,其穩定性與含水量和純度有很大關系。在酸、堿、青霉素酶、羥胺及某些金屬離子(銅、鉛、汞和銀)或氧化劑等作用下,易發生水解和分子重排,導致β-內酰胺環得破壞而失去抗菌活性。6二、鑒別試驗(一)呈色反應羥肟酸鐵反應青霉素及頭孢菌素在堿性中與羥胺作用,β-內酰胺環破裂生成羥肟酸;在稀酸中與高鐵離子呈色。茚三酮反應(側鏈含-氨基酸結構)與重氮苯磺酸得偶合反應(側鏈含酚羥基)硫酸-甲醛試驗7(二)各種鹽得反應鉀、鈉離子得火焰反應有機胺鹽得特殊反應(如普魯卡因青霉素得重氮化-偶合反應)(三)色譜法高效液相色譜法(HPLC)薄層色譜法(TLC)中國藥典收載得頭孢菌素族藥物和大多數青霉素族藥物采用HPLC法進行鑒別。8(四)光譜法IR——各國藥典對收載得β-內酰胺類抗生素幾乎均采用了本法進行鑒別。該類抗生素共有得特征峰:

－內酰胺環羰基得伸縮振動(1750～1800)仲酰胺得氨基、羰基得伸縮振動(3300cm-1±,1525cm-1±,1680cm-1±)羧酸離子得伸縮振動(1600cm-1±、1410cm-1±)UV——利用最大吸收波長鑒定法或利用水解產物得最大吸收波長鑒定法。9三、特殊雜質得檢查本類抗生素得特殊雜質主要有高分子聚合物,有關物質,異構體等,一般采用HPLC法控制其量,也有采用測定雜質得吸收度來控制雜質量得。10聚合物——HPLC法聚合物得檢查采用分子排阻色譜法。分子排阻色譜法得分離原理為凝膠色譜柱得分子篩機制。色譜柱多以親水硅膠、凝膠或經修飾凝膠如葡聚糖凝膠(sephadex)和聚丙烯酰胺凝膠(sepharose)等為填充劑。現以頭孢她啶中頭孢她啶聚合物得測定為例1112大家應該也有點累了，稍作休息大家有疑問的，可以詢問和交流色譜條件與系統適用性試驗

用葡聚糖凝膠G-10(40～120

m)為填充劑,玻璃柱內徑1、3～1、5cm,床體積50～60mL;流動相A為含3、5%硫酸銨得0、01mol/L磷酸鹽緩沖液(pH值7、0),流動相B為0、01%十二烷基硫酸鈉溶液;流速為每分鐘1mL;檢測波長為254nm。以流動相A為流動相,用1mg/mL藍色葡聚糖2000溶液進樣200

L進行測定,理論板數應不低于900,拖尾因子在0、75～1、5,對照品溶液以流動相B為流動相,重復進樣200

L,峰面積值得相對標準差應小于5、0%。排阻分子量在1000左右13對照品溶液得制備:取頭孢她啶對照品適量,精密稱定,加水制成含頭孢她啶100

g/1mL得溶液,搖勻。測定法:取本品適量,精密稱定,加水制成含頭孢她啶20mg/1mL得溶液,立即進樣200

L,以流動相A為流動相進行測定,記錄色譜圖;另取對照品溶液200

L注入液相色譜儀,以流動相B為流動相,記錄色譜圖,按外標法計算,本品含頭孢她啶聚合物以頭孢她啶計不得過0、3%。14自身對照外標法得原理:該法就是利用特定條件下β-內酰胺類抗生素可以締合成與高分子雜質有相似色譜行為得締合物,即在Kav=0處表現為單一得色譜峰。以藥物自身為對照品,測定其在特定條件下締合時得峰響應指標;然后改變色譜條件,測定樣品,記錄樣品色譜圖中Kav=0處得高分子雜質峰得響應指標,按外標法計算,即得樣品中高分子雜質相當于藥品本身得相對含量。Kav=有效分配系數15自身對照液樣品液流動相B——0、01%十二烷基硫酸鈉溶液流動相A——含3、5%硫酸銨得0、01mol/L磷酸鹽緩沖液締合物高聚物A高聚物﹤A締合物16有關物質和異構體

例1頭孢呋辛酯中有關物質和異構體得檢查:色譜條件與系統適用性試驗:要求頭孢呋辛酯A,B異構體之間、頭孢呋辛酯A異構體與頭孢呋辛酯△3-異構體之間得分離度R﹥1、5。頭孢呋辛酯A,B異構體、△3-異構體及E異構體峰得相對保留時間分別約為1、0、0、9、1、2及1、7和2、1。

異構體——供試品色譜圖中A異構體峰得面積與A、B異構體峰得面積和之比應為0、48～0、55。有關物質——按自身對照法測定,E異構體不得過1、0%;△3-異構體不得過1、5%;其她單個雜質不得過0、5%并規定了總雜質量不得過3、0%。

171頭孢呋辛；2異構體B；3異構體A；4△3-異構體；5,6E異構體△3-異構體就是取頭孢呋辛酯對照品經加熱破壞處理而制得,E異構體經紫外光照射24h制得。頭孢呋辛酯就是由兩個非對映異構體頭孢呋辛酯A和B組成得混合物18吸光度如青霉素鈉(鉀)得吸光度檢查:取本品,加水制成每1mL中含1、80mg得溶液,照分光光度法,在280nm得波長處測定吸收度,不得大于0、10;在264nm得波長處有最大吸收,吸收度應為0、80～0、88。此法中264nm處吸收值用來控制青霉素鈉(鉀)得含量,280nm處吸收值用來控制雜質得量。19四、含量測定高效液相色譜法這就是β-內酰胺類抗生素含量測定得主要方法。中國藥典收載得本類抗生素原料及制劑共約70種,應用HPLC法測定含量得有50多種,約占78%。本類藥物得HPLC法通常采用反相HPLC,以外標法計算含量。20第三節氨基糖苷類抗生素這類抗生素得化學結構都就是以堿性環已多元醇為苷元,與氨基縮合而成得苷,故稱為氨基糖苷類抗生素。主要有鏈霉素、慶大霉素、卡那霉素、新霉素及巴龍霉素、硫酸奈替米星、硫酸西索米星、硫酸依替米星等她們得抗菌譜和化學性質都有共同之處。21一、化學結構與性質鏈霉素鏈霉素22慶大霉素R1R2R3分子式C1CH3CH3HC21H43N5O7C2CH3HHC20H41N5O7C2aHHCH3C20H41N5O7C1aHHHC19H29N5O7慶大霉素23二、鑒別試驗茚三酮反應——本類抗生素具羥基胺類和α-氨基酸得性質,可與茚三酮縮合成藍紫色化合物。N-甲基葡萄糖胺反應——水解,產生葡萄糖胺衍生物,在堿性溶液中與乙酰丙酮縮合成吡咯衍生物,再與對二甲氨基苯甲醛得酸性醇溶液反應,生成櫻桃紅色縮合物。吡咯衍生物櫻桃紅色縮合物24麥芽酚(Maltol)反應在堿性溶液中,鏈霉糖經分子重排、擴環、消除反應,生成麥芽酚,與鐵離子在微酸性溶液中形成紫紅色配位化合物。麥芽酚紫紅色為鏈霉素得專屬反應25坂口(Sakaguchi)反應——鏈霉素水溶液加氫氧化鈉試液,水解生成鏈霉胍與8-羥基喹啉、次溴酸鈉反應,生成橙紅色化合物。為鏈霉素得專屬反應26三、特殊雜質檢查及組分分析1、鏈霉素中鏈霉素B得檢查鏈霉素B就是指甘露糖鏈霉素,由發酵產生,其生物活性僅為鏈霉素得20%~25%,能被甘露糖鏈霉素B苷酶水解成甘露糖和鏈霉素。中國藥典(2005)新規定了該項檢查,采用薄層色譜法測定。27溶液配制供試品溶液:取本品0、25g,精密稱定,置回流瓶中,加入5ml新鮮配制得硫酸-甲醇溶液(397?

)溶解,加熱回流1h,冷卻,用甲醇沖洗冷凝管,合并沖洗液,并用甲醇定量稀釋成每1ml中含10mg得溶液,作為供試品溶液。對照溶液:精密稱取甘露糖對照品約36mg,置回流瓶中,同法處理后定量制成每1ml中含72

g得溶液,作為對照溶液。28TLC方法薄層板:硅膠G點樣:各10μl,分別點于同一薄層板上展開劑:甲苯-醋酸-甲醇(5025?25?)顯色劑:新鮮配制得1,3-萘二酚與硫酸混合溶液,在110

C加熱數分鐘顯色。限度:供試品溶液所顯鏈霉素B斑點得顏色與對照溶液得主斑點比較,不得更深(3、0%)。L=×100%×100%=3.0%70×4.1310×1000C×4.13S×1000根據1mg甘露糖相當于4、13mg得鏈霉素B,則:限量？292、硫酸奈替米星中有關物質得TLC檢查:供試品溶液:150mg/mL;標準品溶液(1)1、5mg/mL;標準品溶液(2)3mg/mL;標準品溶液(3)1、44mg西索米星/mL,點樣:各2

L,展開劑:二氯甲烷-甲醇-濃氨溶液(4:4:2)顯色:0、2%茚三酮溶液,110℃加熱20min。30結果:供試品溶液如顯雜質斑點,其顏色與標準品溶液(3)所顯主斑點相比較,不得更深(1%),其她雜質與標準品溶液(1)所顯主斑點相比較,均不得更深(1%),如有一點超過,應不深于標準品溶液(2)得主斑點(2%)。

注:奈替米星就是由西索米星經化學衍生而成得半合成抗生素,因此在奈替米星成品中有可能殘留西索米星,需進行控制。樣西對1對2

供試品溶液:150mg/mL;標準液(1)1、5mg/mL;標準液(2)3mg/mL;標準液(3)1、44mg西索米星/mL313、慶大霉素C組分測定慶大霉素C1、C2、C1a對微生物得活性無明顯差異,但其毒副作用和耐藥性有差異,導致各組分得多少影響產品得效價和臨床療效。因此各國藥典均規定控制各組分得相對百分含量。慶大霉素無紫外吸收,當采用HPLC-紫外檢測器檢測時,需進行衍生化處理。由于其具有強極性和水溶性,為獲得理想得色譜結果,可采用離子對色譜法,以庚烷磺酸鈉為反離子。32如USP(29)利用慶大霉素C組分結構中得氨基與鄰苯二醛(OPA)、巰基醋酸在pH10、4得硼酸鹽緩沖液中反應,生成1-烷基-2-烷基硫代異吲哚衍生物,在330nm波長處有強吸收。ChP和BP曾采用USP同樣得方法測定慶大霉素C組分,但在現版藥典中分別改用了蒸發光散射檢測器和電化學檢測器。慶大霉素OPA巰基醋酸異吲哚衍生物33ChP(2005)采用蒸發光散射檢測器檢測色譜條件:十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑(pH值范圍0、8～8、0);0、2mol/L三氟醋酸-甲醇(92:8)為流動相,流速0、6ml/min;蒸發光散射檢測器檢測34系統適用性試驗分別稱取慶大霉素和小諾霉素標準品各適量,用流動相制成每1ml中各含0、2mg得溶液,取20

l注入液相色譜儀,記錄色譜圖、C組分得出峰順序從第二個主峰計,依次為慶大霉素C1a、C2、小諾霉素、C2a、C1;C2、小諾霉素和C2a峰之間得分離度應符合要求;連續進樣得小諾霉素峰面積得相對標準偏差應不大于2、0%。35測定法取小諾霉素標準品適量,精密稱定,分別用流動相制成每1ml中約含小諾霉素0、2mg、0、5mg和1、0mg得溶液作為標準品溶液(1)、(2)、(3)。取上述三種溶液各20

l,分別注入液相色譜儀,記錄色譜圖,計算標準品溶液濃度得對數值與相應得主峰面積對數值得回歸方程,相關系數(r)應不小于0、99;lg0.2lg0.5lg1.0lgAr≥0、9936另取本品適量,精密稱定,用流動相制成每1ml中約含慶大霉素2、5mg得溶液,同法測定,用回歸方程計算供試品中對應各組分得量(Xcx),并根據所得得各組分得量(Xcx)按下面公式計算出各組分得含量。式中Cx

為慶大霉素各組分得含量;C1應為25%～50%,C1a應為15%～40%,C2a+C2應為20%～50%。37第四節四環素類抗生素這類抗生素分子有四個環構成,故統稱為四環素類(tetracyclines)抗生素。一、化學結構與性質化學結構:四環素類抗生素,可以看作四駢苯或萘駢萘得衍生物。38性質1、酸堿性(具兩性)2、旋光性(有多個手性碳)3、紫外吸收和熒光(剛性平面結構)4、與金屬離子形成配位化合物5、不穩定性四環素類抗生素對各種氧化劑(包括空氣中氧在內)、酸、堿都就是不穩定得,易發生差向異構化、降解等反應。39二、鑒別試驗1、濃硫酸反