血小板功能檢測進展及臨床應用作者：叢玉隆李祖蘭來源：檢驗世界網自2002年衛生部文件建議“廢除Duke法檢測出血時間、玻片法檢測凝血時間，建議應用PT、APTT替代作為術前出血篩查”以來，凝血試驗檢測在國內發展迅速，使用凝血儀器的檔次在國際上也處于很高的水平，但在臨床應用上距離國際水平還相差太遠。我們現在所說的凝血檢測在絕大部分醫院中指的僅僅是凝血四項，或再加D二聚體檢測。實際上，凝血因子檢查遠遠不止這些。以我科開展的項目為例，凝血因子檢查大約有幾十項。另一方面，血栓的形成與血管、血小板、凝（抗凝）血因子、血液粘稠度等因素都有重要的聯系，特別是血小板功能的變化。血小板功能的檢測在臨床上有很大的作用，而目前國內在血小板功能的檢測項目的開展沒有得到應有的重視，原因是實驗室的臨床服務意識、實驗室知識結構、方法學質量控制等因素限制了血小板功能檢測在國內的開展。進入二十一世紀，人類社會的老年時代也隨之而來。人口老齡化帶來的社會問題是疾病譜發生變化。建國初期我國死亡率最高的疾病是傳染病，之后為腫瘤；而進入二十一世紀，隨著人口老齡化的出現，心腦血管疾病逐漸上升為死亡率最高的疾病，成為人類健康的第一殺手。其中，心腦血管疾病多半的機制都是血栓的形成，如因冠狀動脈形成血栓導致的冠心病、腦血管、腦血栓等等都是由血栓引起的。同時，形成血栓的核心因素及第一要素就是血小板。當前，年齡大于50歲以上的老年人，由于血管內皮細胞、血脂等的變化易患心腦血管疾病，很多老年人都在服用阿司匹林治療，那么阿司匹林服用劑量應該為多少合適呢。劑量過小不會獲得治療效果，而劑量過大則容易導致血小板功能的過分抑制，導致自發性出血。但是目前80%-90%的醫院對服用阿司匹林后血小板功能監測項目開展的很少，大大影響了臨床對心腦血管疾病的診斷和治療。凝血過程及血小板形成血栓的病理生理基礎正常情況下，血液每天都在血管內流動，為機體輸送氧氣，進行氣體交換、新陳代謝、抗炎等，而不會出現血栓的現象。但一旦出現問題時，血管內就會有血栓的形成，對受損部位進行止血。機體既能保證血液正常流動又不會凝固，而出現問題時又馬上止血的原因是正常生命活動中，機體內存在一種非常復雜的而又統一對立的生理調節系統即抗凝系統和凝血系統?？鼓到y和促凝系統在神經和神經體液調節下處于動態平衡，可保證血液中的紅細胞、白細胞、血小板等物質處于正常作用，保證血管的完整性，保持血液呈液體狀態，既不出血，也不形成血栓。圖1為血管內示意圖。血小板功能檢測進展及臨床應用在凝血系統中形成凝血抗凝對立統一系統的機制來源于血管特別是血管壁、血小板和血漿中的各種相關因子（如圖2所示）。其中血管壁包括血管壁的變化、血管壁的結構、血管壁的內皮細胞壁釋放出的因子（促凝時釋放促凝因子，抗凝時釋放抗凝因子）。血小板功能檢測進展及臨床應用正常情況下機體以血管作為平臺、以血管內皮細胞為總指揮調節血小板的功能，調節血漿中的各種因子變化，始終保持機體平衡。血小板和血管內皮細胞均具有雙重作用。出血時，促凝系統發揮作用，血管內皮細胞首先暴露膠原蛋白，膠原隨后激活血小板，使血小板粘附、聚集并釋放凝血因子，這些凝血因子再激活其他一些相關因子，最后導致纖維蛋白原變為纖維蛋白，形成血栓進行止血。一旦止血成功后，血管修復了，就不再需要這些栓子，此時血管內皮細胞就釋放纖溶因子，促使纖溶酶原變為纖溶酶，溶解纖維蛋白。如圖3所示。血小板功能檢測進展及臨床應用血小板在血栓形成的作用血小板結構血小板結構決定血小板功能。正常的血小板形狀不規則，無細胞核但有細胞器，是巨核細胞胞漿液剝落下來的脫離細胞。細胞中含有內質網、微管微絲、高爾基體、線粒體、致密顆粒等結構，其中較為特殊的、與血小板凝血作用緊密相關的結構是致密顆粒，含有很多的凝血因子(如ADP、ATP)。見圖4。血小板處于正常靜止狀態時，致密顆粒不會起到抗凝作用；而當血小板一旦被活化后，致密顆粒、α顆粒收縮釋放各種物質，然后這些物質通過血小板內的通道進入到血小板外部的血漿內，并與血漿中的凝血因子相互作用，促進凝血過程。血小板功能檢測進展及臨床應用激活后血小板功能血小板被激活后的功能主要有：粘附，血小板附著在某物體的表面；聚集，血小板相互間的粘附；變形，血小板形態變化，白色血栓形成；釋放，釋放血小板內容物，加強凝血因子、血小板、內皮細胞功能。其中，血小板這些功能的實現主要依賴的是血小板表面上的各種受體（見圖6），如與膠原結合的糖蛋白1、與粘附作用有關的糖蛋白Ⅰb、與聚集作用有關糖蛋白Ⅱb/Ⅲa、凝血酶的受體糖蛋白Ⅴ。受體被激活后，血小板內部會發生一系列的生理變化以及更加復雜的化學變化，如圖5、圖6所示，構成了血栓形成的病理生理基礎。血小板功能檢測的的臨床應用（一）血小板病的實驗診斷（二）血栓前狀態的實驗診斷（三）抗血小板藥物治療監測血小板檢查項目（一）一般檢查：1.血小板計數;2.MPV;3.血塊回縮試驗。（二）血小板功能檢查：1.血小板粘附試驗;2.血小板聚集試驗;3.血小板粘附集聚試驗;4.血栓彈力圖。其中血小板聚集試驗方法有：(1)血小板集聚儀法；(2)VerifyNow儀法；(3)流式細胞術聚集法;(4)血小板粘附聚集試驗用到的儀器為PF-100血小板粘附集聚儀。（三）特殊檢查：1.血小板釋放物包括致密顆粒的釋放（如血小板ATP釋放，5-TH測定）和α顆粒釋放（如PF4，β-TG，GMp-140）檢查;2.血小板AA代謝（如TXB2，丙二醛）檢查;3.血小板膜蛋白（如GPI，GPIIb和IIIa）;4.血小板內鈣流、鈣波動檢測。上述試驗項目中最適合臨床常規診治工作是血小板聚集試驗，各項血小板聚集試驗的方法學原理大致是相同的，血小板聚集原理見圖-7。血小板功能檢測進展及臨床應用血小板表明有很多的受體和糖蛋白，其中比較重要的是糖蛋白IIb/IIIa。正常情況下這兩種糖蛋白以分開、游離形式存在。以ADP或AA受體為例，一旦在血漿中加入ADP或AA，它們就變為誘導劑，跟血小板ADP或AA受體結合反應，促使GPIIb與GPIIIa結合在一起形成GPIIb/IIIa結合物。之后，GPIIb/IIIa結合物與血漿中的纖維蛋白原結合，在一定鈣濃度情況下，血小板與血小板之間粘附、聚集、變形，形成血小板血栓。如圖8所示，血小板聚集試驗獲得成功需要注意的要素有血小板濃度（血小板聚集的關鍵因素），相對應受體的存在與否，誘導劑的質量和濃度，鈣濃度（由抗凝劑加入量決定）等等。當前血小板聚集試驗最大問題就是對這些要素缺乏標準化的質量控制。血小板集聚儀工作原理血小板集聚儀工作原理主要有兩種，濁度法和電阻法。濁度法是在富含血小板血漿（PRP）中加入致聚劑，血小板發生聚集，血漿濁度變化，透光度增加，將血小板聚集儀這種濁度變化轉換為電信號并記錄，形成血小板聚集曲線。根據血小板聚集曲線可了解血小板聚集的程度和速度。電阻法（阻抗法）是根據電阻抗原理，通過放大、記錄浸泡在全血樣品中電極探針間的微小電流或阻抗的變化來測定全血樣品血小板聚集性的方法（如圖8所示）。血小板功能檢測進展及臨床應用PFA-100?血小板檢測儀PFA-100?是一款檢測血小板粘附聚集比較標準化的血小板檢測儀，早在上世紀90年代在國外就已進入臨床使用，筆者在本世紀初曾進行過方法學評價并做了一些科研課題，但其在國內并沒有得到應用。其優勢和缺點都很突出。優勢是操作快速，簡便，易于質量控制；單一試劑包；已有不少的相關文獻發表。缺點是試劑價格昂貴；易受受vWF,PCT,HCT，PLT等參數的影響；只有兩種試劑包（ADP、膠原），應用范圍窄。圖9為該儀器的工作原理圖。血小板功能檢測進展及臨床應用流式細胞技術可檢測血小板表面的抗原，可區分激活狀態和非激活狀態的血小板，激活狀態標志物CD62/P-Selectin。但是該方法所用儀器和試劑都比較昂貴，操作復雜，需受過特別培訓的技術人員。因此，該方法不能作為快速檢測項目。其檢測結果見圖11所示。血小板功能檢測進展及臨床應用VerifyNow抗血小板治療監測系統VerifyNow抗血小板治療監測系統操作流程如圖12所示。該儀器目前在國內僅限于科研所用，其優點包括：（1）快速，3分鐘內出結果；樣本采集后只需等10鐘的樣本穩定期；有AA、ADP、GPⅡb/Ⅲa三個受體檢查試劑盒；（2）簡便，全血樣本—無需樣本預處理；無需專業培訓的操作人員；全自動操作，包括取樣、廠家定標準確；無需讓病人停藥檢測基礎值也能準確得出血小板抑制百分比。但是，該儀器費用昂貴。血小板功能檢測進展及臨床應用血栓彈力圖監測血小板功能血栓彈力圖是對血小板功能動態變化的描述，對血小板功能的監測并不具備特異性，而且成本費用極其昂貴，目前多用于術中作為快速檢查，判斷血液凝血系統的變化，以決定輸血治療的方案。比濁法血小板聚集儀方法學評價從上述的各類儀器的方法學比較可以看出比濁法血小板聚集儀最適我國使用，但檢驗結果的不穩定性限制了它的普及，如果比濁法血小板集聚試驗實行標準化、規范化操作，檢驗結果能否反映血小板功能變化？比濁法血小板集聚試驗能否作為首選的常規試驗？為了回答這個困擾多年的臨床實際問題，筆者做了如下研究：研究對象為健康成年人例，每天服用100mg阿司匹林，連續服用三天后停藥。分別在服藥前、服藥后、開始停藥、停藥后2天、4天、6天、8天、10天從研究對象中抽血檢測血小板聚集率，所得結果如圖13所示。血小板功能檢測進展及臨床應用出現這種結果的原因是血小板在體內的生命周期是9-10天，剛開始服用阿司匹林時，100%的血小板都被抑制，停藥后，每隔一天都有十分之一的血小板衰亡，并有十分之一的血小板生成，而新生成的血小板并沒有受到藥物的抑制作用。停藥后10天，受到藥物抑制的血小板全部衰亡，所以血小板聚集率恢復到服藥前的血小板聚集率。此外，作者采用流式法、放免法檢測到的血小板聚集率變化圖線幾乎與圖13中的曲線重合，證明了血小板聚集實驗方法的可行性。但需建立嚴格的質量管理措施。影響血小板聚集的各種因素及質量控制血小板聚集試驗要達到標準化會受到很多因素的影響（如圖14所示）。血小板功能檢測進展及臨床應用血小板濃度：反應的血小板數最少為15萬才能完成血小板聚集試驗。血漿PH變化：未經特殊處理的靜脈血標本放置時間過長，可影響血漿PH,直接影響檢測結果?？鼓齽┓N類：采用不同的抗凝劑所得結果是不一樣的，標準的抗凝劑是枸櫞酸鈉。抗凝劑用量：正常紅細胞比積血液與抗凝劑劑量比例必須為1:9，抗凝劑的多少直接關系到血漿游離鈣的含量。如果抗凝劑用量過大，會導致血漿內鈣濃度偏低，無法完成凝集。但當Hct過低（<20%)、過高（70%）,抗凝劑用量要做相應調整。PFR保存的條件和時間血小板聚集儀工作狀態：試驗中最容易忽略的是反應杯的透光度，其次對結果有影響的易忽略的還有攪拌棒的質量和標準化程度。另外，聚集劑種類、濃度、劑量與保存及患者試驗前服用抗凝藥物干擾都是引起試驗誤差的常見因素對各種影響血小板聚集試驗因素的研究（一）PRP血小板濃度對AA、ADP誘導血小板聚集影響如表1所示，采用300萬或400萬AA、ADP誘導血小板聚集時，血小板濃度必須至少在180萬或150萬以上才能出現血小板聚集。需要注意的是該研究采用的是血漿，與采用全血所得結果不同。（二）標本的保存時間對血小板聚集率的影響標本取出后必須加塞保存，否則血漿中CO